抗体的提取与纯化.docx

抗体的提取与纯化.docx

《抗体的提取与纯化.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《抗体的提取与纯化.docx（7页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

抗体的提取与纯化

（关键词：

抗体；抗体的提取与纯化；盐析法；冷酒精沉淀法；DEAE-SephadexA-50柱层析纯化免疫球蛋白；SPA-SepharoseCL-4B亲合层析纯化IgG；离子交换层析）

精制免疫球蛋白的方法很多。

一般采用综合技术，避免蛋白变性。

如分离IgG时，多结合使

用盐析法与离子交换法，以求纯化。

提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。

一、盐析法

取xml血清加xml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。

↓4℃，3h以上，使其充分沉淀离心（3000rpm）,20min,充上清，以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。

↓置4℃3h以上，[此时，（NH4）2SO4的饱和度为33%]重复上述第二步过程1～2次。

末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以0.02%mol/LpH7.4PBS溶解至xml装入透析袋。

↓对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。

取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。

影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意（参阅本章第二节）。

二、冷酒精沉淀法

分离过程如下。

血清加3倍体积的蒸馏水，调节pH至7.7（±）冷却到0℃。

在激烈搅拌的条件下，加预冷的酒精（-20℃）到最终浓度为20%，保持在-5℃。

产生的沉淀（A），含有大多数种类的免疫球蛋白。

沉淀A悬浮于25倍体积的0.15～20mol/LNaCl溶液（冷）中，加有0.05mol/L醋酸调节pH到5.1，产生的沉淀（B），包括大部分的IgA和IgM，IgG留在上清液内。

调节上清液的pH到7.4，加冷酒精（-20℃～-30℃）到最终浓度为25%，维持在-5℃。

所得到的沉淀（C）含有90%～98%IgG。

不同动物，IgG分离的条件和产量略有不同。

见表2-5。

从沉淀（B）可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物：

将沉淀（B）悬浮在0℃水中，调节pH到5.1，离心去除不溶的蛋白。

调节上清液离子强度到0.01～0.0075,pH5.5。

然后加冷酒精到最终浓度为10%，保持在–2℃或-3℃低温，所得的沉淀（B-B）主要含IgA和IgM。

表2-5从几种动物和人血清沉淀A分离IgM的条件

物种  pH  沉淀条件  IgG产量

  酒精浓度（%）  离子强度  

人  5.1  15.  0.01  65

山羊  5.2  0  0.01  65

家兔  5.2  10  0.01  70

大鼠  5.0  15  0.01  50

豚鼠  5.1  15  0.01  70

三、DEAE-SephadexA-50柱层析纯化免疫球蛋白

原理：

DEAE-SephadexA-50（二乙氨基—乙基-葡萄糖凝胶A-50）为弱碱性阳离子交换剂。

用NaOH将Cl-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。

血清中的γ球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.85～7.5），其余均属酸性蛋白。

PH7.2～7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE-SephadexA-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。

因此，通过柱层析，γ球蛋白便可在洗脱中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG.

（一）操作步骤

1．DEAE-Sephadex

A-50预处理　称DEAE-SephadexA-50（下称A-50）5g，悬于500ml蒸馏水内，1h后倾去上层细粒。

按每克A-50加0.5mol/LNaOH15ml的比例，将A-50浸泡于0.5mol/LNaOH液中，搅匀，静置30min，装入布氏漏斗（垫有2层滤纸）中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至pH呈中性；再以0.5mol/LHCl同上操作过程处理，最后以0.5mol/LNaOH再处理一次。

处理完后，将A-50浸泡于0.1mol/LpH7.4PB中过夜。

2．装柱

（1）将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。

（2）将0.1mol/L,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50。

等A-50。

等A-50凝胶沉降2～3cm高时，开启出水口螺旋夹，控制流速1ml/min，同时连续倒入糊状A-50凝胶至所需高度。

（3）关闭出水口，待A-50凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口。

通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。

3．平衡　　

启开出水口螺旋夹，控制流速12～14滴/min。

使约2倍床体积的洗脱液流出。

并以pH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之pH值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。

4．加样及洗脱  

启开上口橡皮塞入下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品（体积应<床体积2%，蛋白浓度以<100mg为宜）。

松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内，至与柱面相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱壁2～3次；再放开出水口，使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数毫升洗脱液，紧塞柱上口，使整个洗脱过程成一密闭系统。

并控制流速12～14滴/min。

5．收集　

开始洗脱的同时就以试管进行收集。

每管收集3～5ml。

共收集10～15管。

6．测蛋白　　

以751型紫外分光光度计分别测定每管OD280nm,与OD260nm,按公式计算各管蛋白含量。

并以OD280nm为纵座标，以试管编号为横座标，绘制洗脱曲线。

7．合并、浓缩　

将洗锐峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以PEG（MW6000）浓缩至所需体积，加入0.02%NaN3防腐，于4℃保存备用。

长期保存时应贮于-40℃冰箱。

8．A-50凝胶的再生　　

在柱上先以2mol/LNaCl洗脱蛋白至流出液的OD280nm<0.02，再以蒸馏水洗去柱中盐。

然后按预处理过程将A-50再处理一遍即达到再生。

近期用时泡于洗脱缓冲液中4℃保存；近期不用时，以无水酒精洗2次，再置50℃温箱烘干，装瓶内保存。

（二）注意事项

（1）柱的选择：

从理论上说，只要柱足够长，就能获得理想的分辨率，但由于层析柱流速同压力梯度有关，柱长增加使流速减慢，峰变宽，分辨率降低。

柱的直径增加，使流体流动的不均匀性增加，分辨率明显下降。

（2）纯化过程必须严格控制缓冲液的pH及离子强度。

样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后，才能进行柱层析。

（3）所装的柱床必须表面平整，无沟流及气泡，否则应重装。

（4）洗脱过程中应严格控制流速，切勿过快。

（5）上样的体积要小，浓度不宜过高。

（6）加样及整个洗脱过程中，严防柱面变干。

四、SPA-SepharoseCL-4B亲合层析纯化

IgG及IgG亚类

（一）原理

葡萄球菌A蛋白（SPA）具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。

改变pH及离子强度可洗脱结合于SPA-SepharoseCL-4B柱上的IgG或不同的IgG亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。

（二）操作步骤

用0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液浸泡SPA-SepharoseCL-4B凝胶，15min。

按1g干胶200ml上述缓冲液充分洗涤凝胶，（用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤）。

↓

装柱后用0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液平衡。

标本可用硫酸铵粗提物，先10000g离心除去杂质，必要时用0.22μm滤膜过滤，上样前用1mol/LpH9.0Tris液调整标本液pH至8.1或对平衡液透析过夜。

↓

加样，一般按25～30mgIgG/g湿胶比例加样，室温作用15min，用0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液充分淋洗，到淋洗液OD值为<0.02。

↓

用不同pH的枸橼酸洗脱液洗脱，流速20ml/h。

如纯化小鼠IgG1一般用pH6.0;纯IgG2a用pH4.0；纯化IgG2b用0.1mol/LpH3.0醋酸盐缓冲液0.1mol/LpH3.0glycine-HCl缓冲液洗脱。

↓

用pH3.0或4.0洗脱液洗脱时，用适量固体Tris直接中和含有IgG的洗脱液。

↓

收集洗脱液测OD值，根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定。

（三）试剂器材

（1）SPA-SepharoseL-4B（pharmacia）

（2）磷酸缓冲液0.1mol/LpH8.0+0.02%NaN3

（3）枸橼酸缓冲液0.1mol/LpH6.00.1mol/LpH4.0  +0.02%  NaN30.1mol/LpH3.0

（4）1mol/LpH9.0Tris溶液

（5）再生缓冲液：

①0.1mol/LTris含0.5mol/LNaCl调整pH至8.5+0.02%NaN3;②0.1mol/L醋酸钠含0.5mol/LNaCl调整pH至4.5+0.02%NaN3。

（四）注意事项

（1）SPA-SepharoseCL-4B凝胶价格昂贵，可再生后反复使用10～20次左右。

方法：

先用10倍柱体积0.1mol/LpH8.5Tris含0.5mol/LNaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；再用10倍柱体积0.1mol/LpH4.5醋酸钠缓冲液含0.5mol/LNaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液平衡，4℃贮存。

（2）SPA-SepharoseCL-4B亲合层析法还可用于：

①除去抗体液中IgG,检测非IgG抗体（如IgM）的生物学活性；②除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段；③吸收或纯化免疫复合物。

（3）狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgA和IgM也具有与SPA结合的能力。

金黄色葡萄球菌A蛋白（staphylococcalproteinA，SPA）可与IC中IgG的Fc段结合。

将待测血清用低浓度PEG沉淀后加至SPA包被的固相载体上，再以酶标记的SPA与之反应，即可检测样本中有无IC。

1、试剂

（1）5%与2.5%PEG用0.02mol/LpH7.4PBS配制；

（2）牛血清白蛋白（BSA）缓冲液：

用0.05mol/LpH7.4PBS配制。

含0.01mol/LEDTA、0.1%硫柳汞、0.05%Tween20及4%BSA；

（3）HRP-SPA用改良过碘酸钠法将SPA与辣根过氧化物酶（HRP）制成结合物，最适工作浓度以方阵法滴定；

（4）热聚合人IgG：

人IgG10mg/ml，63℃加热20min制成。

2、操作步骤

（1）用PBS稀释SPA成5Ps/ml，包被聚苯乙烯反应板微孔，每孔0.1ml（对照孔不包被），置4℃过夜后洗涤3次备用；

（2）待测血清0.05ml加PBS0.15ml和5%PEG0.2ml混匀，4℃过夜后1600r/min离心20min，弃上清，沉淀用2.5%PEG洗2次，加入PBS0.2ml和BSA缓冲液0.2ml，混匀，置37℃水浴30min，摇动，使完全溶解；

（3）将已溶解的待测血清沉淀物加至上述包被孔和对照孔中，置37℃60min，洗3次；各孔加底物溶液（OPD—H202）0.1ml，37℃20min使呈色。

每孔加2mol/LH2S041滴终止反应。

置酶标仪492nm测各孔吸光值；

（4）标准曲线制备：

取正常人血清0.2ml，加热聚合人IsC（120ug/ml）0.2ml，再加PBS0.4ml和5%PEG0.8ml，置4℃过夜。

同时做不加热聚合人耽的正常血清对照，以排除血清中干扰因素。

沉淀清洗同标本操作。

用稀释的BSA缓冲液（加等量0.01mol/LpH7.4PBS）1.6ml溶解并稀释成120、60、30、15、7.5ug/ml，与待测血清同法操作，制成工作标准曲线；

（5）结果判断：

从待测血清吸光度值查标准曲线，即可换算成相当于热聚合人IgG的CIC含量（ug/ml）。

以高于正常对照X+2S，即大于28.4ug/ml为阳性。

3、注意事项

（1）热聚合人IgC应分装贮存于-20℃，不宜反复冻融，否则易解聚；

（2）PEG的浓度影响CIC沉淀量，须严格配制。

五、高效和液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体

从小鼠腹水中纯化McAb的方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤和亲合层析等。

应用TSKDEAE-SPW离子交换层析柱从小鼠腹水中纯化McAb不仅纯化速度快，回收率和得率高，而且保持良好的生物学活性。

（一）原理

根据离子交换原理，将经硫酸铵粗提的含McAbγ球蛋白上样结合于层析柱上，通过增加洗

脱液中的离子强度，洗脱并收集蛋白峰。

（二）操作步骤

腹水离心10000g,10min，除去细胞和杂质，在4℃下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，使终浓度为40%饱和硫酸铵

↓搅拌20～30min

离心，沉淀用40%饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS，对缓冲液A（pH8.5,

20mmol/LTris缓冲液）透析除盐

↓4℃过夜

用带有1000μl样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样于经缓冲液A液平衡的TSK

DEAESPW离子交换层析柱

↓

洗脱流速1ml/min

0～1min：

0→5%缓冲液B（20nmol/L

Tris,Ph8.5,含2.0

mol/L醋酸钠）

1～2min（线性梯度洗脱）：

5→20%缓冲液B

20～22min：

20→0%缓冲液B

↓

洗脱液用紫外280nm进行监测

↓

收集蛋白峰，进行含量、纯度和活性测定

（三）试剂和器材

（1）TSK

DEAESPW离子交换层析柱（75mm×7.5mm,Bio

Rad）

（2）高效液相色谱仪（包括控制系统、溶剂传递系统、高压加压活门和紫外280nm监测系统）

（3）PBS，缓冲液A和B。

（四）注意事项

（1）所用缓冲液和加样粗提物均需0.2μm滤膜过滤。

（2）在本实验条件下，IgG1峰一般在线性梯度洗脱开始11-12min。

但不同类和亚类抗体以及不同特异性McAb

的存留时间（retention

time）有所差异。

【附录】

制备单克隆抗体常用的试剂

1．RPMT-1640培养液其中含2mmol/L谷氨酰胺，25

mmol/LHepes,5×10-5mol/L

2-巯基乙醇2.

RPMT-1640完全培养液上述溶液加10%～20%灭活小牛血清

3．HT母液×100

次黄嘌呤（H）

1.0×10-2mol/L　　　　　　　　

136.1mg

胸腺嘧淀核苷（T）1.6×10-3mol/L　　　　　　　38.8mg

蒸馏水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　100ml

4.A母液×100

氨基喋呤（A）　　　　　　　　　　4×10-3mol/L

1.76mg

蒸馏水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　90.0ml

1mol/LNaOH0.5ml

溶解后,加1mol/L

HCl0.5ml,再补加蒸馏水至100ml。

5．HAT选择培养液

RPMI-1640培养液

　　　　　　　　　　　　　80ml

灭活小牛血清　　　　　　　　　　　　　　　20ml

HT母液×100                

1ml

A母液×100                

1ml

用5%NaOH调节pH至7.4左右。

6．HT培养液

RPMI-1640培养液              

80ml

灭活小牛血清                

20ml

HT母×100                

1ml

用5%NaOH调节pH至7.4左右。

ProteinAPurificationofAntibody

1.Reagents

（1）Affi-gelProtein-AAgarose（BioRad#153-6153）

（2）MAPSIIBindingBuffer（BioRad#153-6161）

（3）0.314g/mldiH2O

（4）MAPSIIElutionBuffer（BioRad#153-6162）

（5）0.023g/mldiH2O

（6）MAPSIIRegenerationBuffer（BioRad#153-6166

（7）1MTris,pH9-11

（8）PBS

2.Procedure

（1）DiluteAb1:

5withBindingBuffer.Filterthrougha0.22mfilter.

（2）Equilibratecolumnwithatleast2bedvolumesofBindingBuffer

（3）ApplySample.

Washcolumnwith5-6bedvolumesofBindingBuffer.Collect1mlfractionsuntilbaselineisachieved.

EluteAbwith5bedvolumesofElutionBuffer.Collect1mlfractionsinto50ml1MTris,untilbaselineisachieved.

Take50mlaliquotsofeachfractionforELISA.

PoolfractionscontainingAb.Dialyzeagainst2x4LPBS,overnight,2-8℃.

Re-equilibratecolumnwithBindingBuffer.Storecolumnat2-8℃.

DetermineproteinconcentrationofAb,aliquot,andstoreat-20℃.

3.Note

ExtinctionCoefficientforIgG=1.4andforIgM=1.2