抗体的提取与纯化.docx

1、抗体的提取与纯化(关键词：抗体；抗体的提取与纯化；盐析法；冷酒精沉淀法；DEAE-SephadexA-50柱层析纯化免疫球蛋白；SPA-SepharoseCL-4B亲合层析纯化IgG；离子交换层析 )精制免疫球蛋白的方法很多。一般采用综合技术，避免蛋白变性。如分离IgG时，多结合使 用盐析法与离子交换法，以求纯化。提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。一、盐析法取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。4，3h以上，使其充分沉淀离心（3000rpm）,20min,充上清，以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴

2、加饱和硫酸铵x/2ml。置43h以上，此时，（NH4）2SO4的饱和度为33%重复上述第二步过程12次。末次离心后所得沉淀物为-球蛋白，以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml装入透析袋。对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意（参阅本章 第二节 ）。二、冷酒精沉淀法分离过程如下。血清加3倍体积的蒸馏水，调节 pH至7.7()冷却到0。在激烈搅拌的条件下，加预冷的酒精（-20

3、）到最终浓度为20%，保持在-5。产生的沉淀（A），含有大多数种类的免疫球蛋白。沉淀A悬浮于25倍体积的0.1520mol/L NaCl溶液（冷）中，加有0.05mol/L醋酸调节 pH到5.1，产生的沉淀（B），包括大部分的IgA和IgM，IgG留在上清液内。调节 上清液的pH到7.4，加冷酒精（-20-30）到最终浓度为25%，维持在-5。所得到的沉淀（C）含有90%98%IgG。不同动物，IgG分离的条件和产量略有不同。见表2-5。从沉淀（B）可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物：将沉淀（B）悬浮在0 水中，调节 pH到5.1，离心去除不溶的蛋白。调节 上清液离子强度到0.01

4、0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到最终浓度为10%，保持在2或-3低温，所得的沉淀（B-B）主要含IgA和IgM。表2-5 从几种动物和人血清沉淀A分离IgM的条件物 种 pH 沉淀条件 IgG产量 酒精浓度（%） 离子强度 人 5.1 15. 0.01 65山羊 5.2 0 0.01 65家兔 5.2 10 0.01 70大鼠 5.0 15 0.01 50豚鼠 5.1 15 0.01 70三、DEAE-Sephadex A-50 柱层析纯化免疫球蛋白原理：DEAE-Sephadex A-50（二乙氨基乙基-葡萄糖凝胶A-50）为弱碱性阳离子交换剂。用NaOH将Cl-型转变为OH-型后，

5、可吸附酸性蛋白。血清中的球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.857.5），其余均属酸性蛋白。PH7.27.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE- Sephadex A-50吸附，只有球蛋白不被吸附。因此，通过柱层析，球蛋白便可在洗脱中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG.（一）操作步骤1DEAE-SephadexA-50预处理 称DEAE-SephadexA-50（下称A-50）5g，悬于500ml蒸馏水内，1h后倾去上层细粒。按每克A-50加0.5mol/LNaOH 15ml的比例，将A-50浸泡于0.5mol/LNaOH液中，搅匀，静置30min，装入布氏漏斗（垫有2

6、层滤纸）中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至pH呈中性；再以0.5mol/LHCl同上操作过程处理，最后以0.5mol/LNaOH 再处理一次。处理完后，将A-50浸泡于0.1mol/LpH7.4PB中过夜 。2装柱（1）将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。（2）将0.1mol/L,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50。等A-50。等A-50凝胶沉降23cm高时，开启出水口螺旋夹，控制流速1ml/min，同时连续倒入糊状A-50凝胶至所需高度。（3）关闭出水口，待A-50凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤

7、纸片，以橡皮塞塞紧柱上口。通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。3平衡 启开出水口螺旋夹，控制流速1214滴/min。使约2倍床体积的洗脱液流出。并以pH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之pH值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。4加样及洗脱 启开上口橡皮塞入下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品（体积应床体积2%，蛋白浓度以100mg为宜）。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内，至与柱面相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱壁23次；再放开出水口，使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数毫升洗脱液，紧塞

8、柱上口，使整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速1214滴/min。5收集 开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集35ml。共收集1015管。6测蛋白 以751型紫外分光光度计分别测定每管OD280nm, 与OD260nm,按公式计算各管蛋白含量 。并以OD280nm为纵座标，以试管编号为横座标，绘制洗脱曲线。7合并、浓缩 将洗锐峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以PEG（MW6000）浓缩至所需体积，加入0.02%NaN3防腐，于4保存备用。长期保存时应贮于-40冰箱。8A-50凝胶的再生 在柱上先以2mol/LNaCl洗脱蛋白至流出液的OD280nm0.02，再以蒸馏水洗去柱中盐。

9、然后按预处理过程将A-50再处理一遍即达到再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中4保存；近期不用时，以无水酒精洗2次，再置50温箱烘干，装瓶内保存。（二）注意事项（1）柱的选择：从理论上说，只要柱足够长，就能获得理想的分辨率，但由于层析柱流速同压力梯度有关，柱长增加使流速减慢，峰变宽，分辨率降低。柱的直径增加，使流体流动的不均匀性增加，分辨率明显下降。（2）纯化过程必须严格控制缓冲液的pH及离子强度。样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后，才能进行柱层析。（3）所装的柱床必须表面平整，无沟流及气泡，否则应重装。（4）洗脱过程中应严格控制流速，切勿过快。（5）上样的体积要小，浓度不宜过高。（6）加

10、样及整个洗脱过程中，严防柱面变干。四、SPA-Sepharose CL-4B 亲合层析纯化 IgG及IgG亚类（一）原理葡萄球菌A蛋白（SPA）具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。改变pH及离子强度可洗脱结合于SPA-SepharoseCL-4B 柱上的IgG或不同的IgG 亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。（二）操作步骤用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液浸泡SPA-SepharoseCL-4B凝胶，15min。按1g干胶200ml上述缓冲液充分洗涤凝胶，（用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤）。装柱后用0.1mol/L pH8.0磷酸缓

11、冲液平衡。标本可用硫酸铵粗提物，先10000g离心除去杂质，必要时用0.22m滤膜过滤，上样前用1mol/L pH9.0 Tris 液调整标本液pH至8.1或对平衡液透析过夜。加样，一般按2530mg IgG/g湿胶比例加样，室温作用15min，用0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液充分淋洗，到淋洗液OD值为0.02。用不同pH的枸橼酸洗脱液洗脱，流速20ml/h。如纯化小鼠IgG1一般用pH6.0;纯IgG2a用pH4.0；纯化IgG2b用0.1mol/LpH3.0醋酸盐缓冲液0.1mol/LpH3.0glycine-HCl缓冲液洗脱。用pH3.0或4.0洗脱液洗脱时，用适量固体Tris直接

12、中和含有IgG的洗脱液。收集洗脱液测OD值，根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定。（三）试剂器材（1）SPA-Sepharose L-4B （pharmacia）（2）磷酸缓冲液0.1mol/L pH8.0+0.02% NaN3（3）枸橼酸缓冲液 0.1mol/LpH6.0 0.1mol/LpH4.0 +0.02% NaN30.1mol/LpH3.0 （4）1mol/L pH9.0 Tris溶液（5）再生缓冲液：0.1mol/L Tris含0.5mol/L NaCl调整pH至8.5+0.02% NaN3;0.1mol/L 醋酸钠含0.5mol/L NaCl调整pH至4.5+0.02%

13、NaN3。（四）注意事项（1）SPA-Sepharose CL-4B凝胶价格昂贵，可再生后反复使用1020次左右。方法：先用10倍柱体积0.1mol/L pH8.5 Tris含0.5mol/L NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；再用10倍柱体积0.1mol/L pH4.5醋酸钠缓冲液含0.5mol/L NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液平衡，4贮存。(2)SPA-Sepharose CL-4B亲 合层析法还可用于：除去抗体液中IgG,检测非IgG抗体（如IgM）的生物学活性；除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段；吸收或纯化免疫复合物。（3）狗、猫的

14、多克隆IgM和IgA以及单克隆IgA和IgM也具有与SPA结合的能力。金黄色葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A，SPA）可与IC中IgG的Fc段结合。将待测血清用低浓度PEG沉淀后加至SPA包被的固相载体上，再以酶标记的SPA与之反应，即可检测样本中有无IC。1、试剂（1）5%与2.5%PEG用0.02mol/LpH7.4PBS配制；（2）牛血清白蛋白（BSA）缓冲液：用0.05mol/L pH 7.4PBS配制。含0.01mol/L EDTA、0.1%硫柳汞、0.05%Tween 20及4%BSA；（3）HRP-SPA用改良过碘酸钠法将SPA与辣根过氧化物酶（H

15、RP）制成结合物，最适工作浓度以方阵法滴定；（4）热聚合人IgG：人IgG 10mg/ml，63加热20min制成。2、操作步骤（1）用PBS稀释SPA成5Ps/ml，包被聚苯乙烯反应板微孔，每孔0.1ml（对照孔不包被），置4过夜后洗涤3次备用；（2）待测血清0.05ml加PBS0.15ml和5%PEG0.2ml混匀，4过夜后1600r/min离心20min，弃上清，沉淀用 2.5%PEG洗2次，加入PBS0.2ml和BSA缓冲液0.2ml，混匀，置37水浴30min，摇动，使完全溶解；（3）将已溶解的待测血清沉淀物加至上述包被孔和对照孔中，置3760min，洗3次；各孔加底物溶液（OPDH

16、202）0.1ml，37 20min使呈色。每孔加2mol/LH2S041滴终止反应。置酶标仪492nm测各孔吸光值；（4）标准曲线制备：取正常人血清0.2ml，加热聚合人IsC（120ug/ml）0.2ml，再加PBS0.4ml和5%PEG0.8ml，置 4过夜。同时做不加热聚合人耽的正常血清对照，以排除血清中干扰因素。沉淀清洗同标本操作。用稀释的BSA缓冲液（加等量 0.01mol/LpH7.4PBS）1.6ml溶解并稀释成120、60、30、15、7.5ug/ml，与待测血清同法操作，制成工作标准曲线；（5）结果判断：从待测血清吸光度值查标准曲线，即可换算成相当于热聚合人IgG的CIC含

17、量（ug/ml）。以高于正常对照X+2S，即大于 28.4ug/ml为阳性。3、注意事项（1）热聚合人IgC应分装贮存于-20，不宜反复冻融，否则易解聚；（2）PEG的浓度影响CIC沉淀量，须严格配制。五、高效和液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体从小鼠腹水中纯化McAb的方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤和亲合层析等。应用TSK DEAE-SPW离子交换层析柱从小鼠腹水中纯化McAb不仅纯化速度快，回收率和得率高 ，而且保持良好的生物学活性。（一）原理根据离子交换原理，将经硫酸铵粗提的含McAb球蛋白上样结合于层析柱上，通过增加洗 脱液中的离子强度，洗脱并收集蛋白峰。（二）操作步骤腹水离心100

18、00 g,10min，除去细胞和杂质，在4下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，使终浓度为40%饱和硫酸铵搅拌2030min离心，沉淀用40%饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS，对缓冲液A（pH8.5, 20mmol/L Tris缓冲液）透析除盐4过夜用带有1000l样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样于经缓冲液A液平衡的TSK DEAE SPW离子交换层析柱洗脱流速1ml/min01min ：05%缓冲液B（20nmol/L Tris, Ph 8.5,含2.0 mol/L醋酸钠）12 min( 线性梯度洗脱)：520%缓冲液B2022min：200%缓冲液B洗脱液用紫外280nm进行监测收集蛋白峰，进行含

19、量、纯度和活性测定（三）试剂和器材（1）TSK DEAE SPW离子交换层析柱 （75mm7.5mm,Bio Rad）（2）高效液相色谱仪（包括控制系统、溶剂传递系统、高压加压活门和紫外280nm监测系统）（3）PBS，缓冲液A和B。（四）注意事项（1）所用缓冲液和加样粗提物均需0.2m滤膜过滤。（2）在本实验条件下，IgG1峰一般在线性梯度洗脱开始11-12min。但不同类和亚类抗体以及不同特异性McAb 的存留时间（retention time）有所差异。【附录】制备单克隆抗体常用的试剂1RPMT-1640培养液 其中含2mmol/L 谷氨酰胺，25 mmol/L Hepes,510-5m

20、ol/L 2-巯基乙醇2. RPMT-1640完全培养液 上述溶液加10%20%灭活小牛血清3HT母液100次黄嘌呤（H） 1.010-2mol/L 136.1mg胸腺嘧淀核苷(T) 1.610-3mol/L 38.8mg蒸馏水 100ml4. A母液100氨基喋呤(A) 410-3mol/L 1.76mg蒸馏水 90.0ml1mol/LNaOH 0.5ml溶解后,加1mol/L HCl 0.5ml,再补加蒸馏水至100ml 。5HAT选择培养液RPMI-1640培养液 80ml灭活小牛血清 20mlHT母液100 1mlA母液100 1ml用5%NaOH调节 pH至7.4左右。6HT培养液R

21、PMI-1640培养液 80ml灭活小牛血清 20mlHT母100 1ml用5%NaOH调节 pH至7.4左右。Protein A Purification of Antibody1. Reagents(1) Affi-gel Protein-A Agarose (BioRad #153-6153)(2) MAPS II Binding Buffer (BioRad # 153-6161)(3) 0.314 g/ml diH2O(4) MAPS II Elution Buffer (BioRad #153-6162)(5) 0.023 g/ml diH2O(6) MAPS II Regener

22、ation Buffer (BioRad #153-6166(7) 1M Tris, pH 9-11(8) PBS2. Procedure(1) Dilute Ab 1:5 with Binding Buffer. Filter through a 0.22 m filter.(2) Equilibrate column with at least 2 bed volumes of Binding Buffer(3) Apply Sample.Wash column with 5-6 bed volumes of Binding Buffer. Collect 1 ml fractions u

23、ntil base line is achieved.Elute Ab with 5 bed volumes of Elution Buffer. Collect 1 ml fractions into 50 ml 1M Tris, until base line is achieved.Take 50 ml aliquots of each fraction for ELISA.Pool fractions containing Ab. Dialyze against 2 x 4L PBS, overnight, 2-8.Re-equilibrate column with Binding Buffer. Store column at 2-8.Determine protein concentration of Ab, aliquot, and store at -20.3. NoteExtinction Coefficient for IgG = 1.4 and for IgM = 1.2