色氨酸与TCBQ荧光性质的测定2.docx
《色氨酸与TCBQ荧光性质的测定2.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《色氨酸与TCBQ荧光性质的测定2.docx（17页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
色氨酸与TCBQ荧光性质的测定2
L-色氨酸与四氯苯醌（TCBQ）
荷移荧光光谱法的研究
摘要本文使用荧光光谱法研究了L-色氨酸与四氯苯醌（TCBQ）的荷移反应。
通过实验可得知，L-色氨酸与TCBQ在水中，以pH=10.9溶液，活性剂为代十六烷基吡啶溶液，在20℃的室温下加热10min以后，可生成稳定的荷移络合物。
此荷移络合物的最大激发波长λmax=284，最大发射波长λmax=364，△F=0.32857+25.48571c（µg/mL）（R=0.99902）,浓度在0~2.0μg/mL的范围内符合比尔定律，回收率在98.59～103.4%之内，相对标准偏差在0.96%以内,该方法最低检测限为0.037µg/mL。
关键词荧光猝灭法L-色氨酸四氯苯醌（TCBQ）荷移反应
1引言
L-色氨酸（L-trytophan）是人类和动物必需的八种氨基酸之一，化学名称为L-氨基吲哚基丙酸，别名L-胰化蛋白氨基酸、L-β-（3-吲哚基）-α-丙氨酸，它是含有吲哚基的芳香族氨基酸，呈白色或略带黄色的叶片状结晶或粉末，无臭有甜味，溶于热吡啶，微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚，在稀酸或稀碱中溶解。
L-色氨酸有促进机体生长发育，修补组织细胞的作用；有为肌体提供营养的作用；对肌体内各种酶、激素的分泌起调节的作用；提高肌体的免疫抵抗能力的作用；运输其它营养物质和解毒的作用。
L-色氨酸系氨基酸类药物，对抑郁症、失眠症、高血压、及止痛等有良效，在欧美一些国家已广泛应用于临床[1]。
目前定量测定L-色氨酸的方法主要有高效液相色谱法[2-4]、电位滴定法[5]、原子吸收光谱法[6]、荧光光谱法[7,8]、分光光度法[9-11]、毛细管电泳分析法[12]、阻抑速差催化光度法[13]、线扫伏安法[14]、化学发光法[15-17]等。
利用与四氯苯醌（TCBQ）发生荷移反应测定L-色氨酸含量的方法还未见报道。
本文选用TCBQ为电子接受体，研究了L-色氨酸与TCBQ形成荷移络合物的条件，探讨了反应机理，并对药物样品进行了含量测定，结果令人满意。
2实验部分
2.1主要仪器与试剂
仪器LS55发光分光光度计（美国PE公司）；WGY-10型荧光分光光度计（天津市港东科技发展有限公司）；HH-6电热恒温水浴锅（北京科伟永鑫实验仪器厂）；92M-202A-DR电子天平（普利赛斯国际贸易〈上海〉有限公司）；211型酸度计（意大利Hanna）,XYJ-802离心沉淀机（江苏医疗仪器厂）。
试剂L-色氨酸（天津市大茂化学仪器供应站），TCBQ（sigma-Aldrich），溴代十六烷基吡啶（天津市光复精细化工研究所）。
所用试剂中溴代十六烷基吡啶为化学纯，其余均为分析纯，实验用水为超纯水。
2.2溶液的配制方法
L-色氨酸溶液的配制：
准确称取0.25000gL-色氨酸，用水溶解，转移到250mL的容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，配成1g/L的溶液。
准确量取1ml1g/L的L-色氨酸，用水溶解，转移到100mL的容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，配成0.01g/L的溶液。
pH=10.9的三酸缓冲溶液：
分别取2.70mL磷酸、2.29mL冰醋酸、2.47g硼酸于1000mL容量瓶中并稀释至刻度，在酸度计下，用0.2mol/L的氢氧化钠调节至pH=10.9。
TCBQ溶液的配制：
准确称取0.25000gTCBQ，用少量的乙醇溶解，转移到250mL的容量瓶中，用乙醇稀释至刻度，摇匀，配成1g/L的溶液。
硼砂溶液的配制：
准确称取38.14g四硼酸钠，用水溶解，转移到1000mL的容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，配成0.1mol/L的溶液。
溴代十六烷基吡啶溶液的配制：
准确量取5mL的溴代十六烷基吡啶于烧杯中，用500mL水溶解，配成0.1mol/L的溶液，摇匀后，置于试剂瓶中备用。
样品的制备：
血清1.0mL于10mL离心试管中，加3.0mL乙醇除蛋白,静置5min4000r/min离心10min,取上清夜于比色管中。
2.3实验方法
准确移取适量0.01g/L的L-色氨酸溶液分别于两支10mL比色管中，其中一支依次加入表面活性剂溴代十六烷基吡啶溶液0.7mL，用pH=10.9的三酸缓冲溶液稀释至刻度，另一支依次加入TCBQ乙醇溶液0.3mL、表面活性剂溴代十六烷基吡啶溶液0.7mL，并用pH=10.9的三酸缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，在室温下反应10min后，在负高压140，出射狭缝4nm，扫描间隔2min的条件下，用1cm石英比色皿，在284nm激发波长处，测定364nm处的发射荧光强度F1和F2，并计算荧光猝灭量△F=F1－F2。
3结果与讨论
3.1实验条件的选择
3.1.1吸收光谱
按照实验方法，用荧光分光光度计对水，TCBQ的乙醇溶液，色氨酸溶液，色氨酸-TCBQ溶液进行激发和发射光谱扫描，负高压为140，光谱通带均为4nm。
在220nm～800nm之间扫描。
结果（图1、2）表明，水中TCBQ的激发值和荧光值都很低，对测定无干扰，色氨酸溶液的激发峰和发射峰分别为284nm和364nm；加入TCBQ，峰高明显下降，而峰形和峰位都没有发生显著的变化。
实验选择的激发波长为284nm，发射波长为364nm。
图1不同浓度下的发射光谱谱图
注释：
从上至下谱线1~10分别如下：
1–色氨酸（2.0mL），2–色氨酸（1.0mL），3–色氨酸（2.0mL）–TCBQ，4–色氨酸（1.0mL）–TCBQ，
5–色氨酸（0.5mL），6–色氨酸（0.2mL），7–色氨酸（0.5mL）–TCBQ，
8–色氨酸（0.2mL）–TCBQ，9–色氨酸（0.1mL），10–色氨酸（0.1mL）–TCBQ
图2不同浓度下的激发光谱谱图
注释：
从上至下谱线1~10分别如下：
1–色氨酸（2.0mL），2–色氨酸（1.0mL），3–色氨酸（2.0mL）–TCBQ，4–色氨酸（1.0mL）–TCBQ，
5–色氨酸（0.5mL），6–色氨酸（0.2mL），7–色氨酸（0.5mL）–TCBQ，
8–色氨酸（0.2mL）–TCBQ，9–色氨酸（0.1mL），10–色氨酸（0.1mL）–TCBQ
3.1.2溶剂的影响
选用不同的溶剂按实验方法配制溶液，测定相应络合物的激发强度和发射强度并计算其猝灭量，结果（表1）表明，在乙醚、乙醇、乙腈、丙酮、二甲亚砜中试剂均有沉淀或分层现象，结果（表2）表明，溶剂用水和甲醇所得的结果差不多，但因考虑到甲醇有毒成本较贵，则本实验采用水为溶剂。
表1溶剂的影响
溶剂
乙醚
乙醇
乙腈
甲醇
水
丙酮
二甲亚砜
现象
分层
淡粉沉淀
乳黄沉淀
溶液
溶液
白色沉淀
乳黄沉淀
表2溶剂的影响
溶剂
L-色氨酸发射
L-色氨酸与TCBQ发射
△F
甲醇
44.9
25.7
19.2
水
33.1
18.9
14.2
3.1.3温度和时间的影响
按实验方法进行，测定不同温度下不同反应时间的猝灭量及发射峰位，结果（表3、4、5）表明，从表3、4、5中可看出，选取在室温，反应时间10min的条件下，发射的强度大且猝灭量较大且稳定。
表3温度（19.8℃）和时间的影响
时间（min）
1（nm）
2
3（nm）
4
△F
0
358.0
33.2
360.0
23.7
9.5
5
360.0
33.3
358.0
23.6
9.7
10
358.0
33.1
358.0
23.2
9.9
15
358.0
32.8
358.0
23.0
9.8
20
358.0
32.7
358.0
23.0
9.7
25
358.0
32.3
360.0
22.6
9.7
30
358.0
31.9
360.0
22.4
9.5
35
358.0
32.1
358.0
22.2
9.9
40
358.0
32.5
358.0
21.6
10.9
45
360.0
32.2
358.0
21.8
10.4
50
360.0
32.8
358/0
21.6
11.2
55
358.0
32.9
360.0
21.7
11.2
60
360.0
33.0
360.0
21.7
11.3
70
358.0
33.2
360.0
21.5
11.7
80
358.0
33.5
358.0
21.5
12.0
90
358.0
32.9
358.0
21.1
11.8
100
358.0
32.2
358.0
21.1
11.1
注释：
1—L-色氨酸的发射峰位；2—L-色氨酸的荧光强度；
3—L-色氨酸与TCBQ发射峰位；4—L-色氨酸与TCBQ荧光强度；
表4温度（30℃）和时间的影响
时间（min）
1（nm）
2
3（nm）
4
△F
0
358.0
29.9
358.0
25.4
4.5
5
360.0
27.4
358.0
22.0
5.4
10
360.0
25.8
360.0
20.3
5.5
15
358.0
25.8
360.0
19.8
6.0
20
360.0
26.0
360.0
19.3
6.7
25
358.0
26.3
360.0
18.7
7.6
30
360.0
25.8
360.0
19.0
6.8
35
360.0
25.9
360.0
18.1
7.8
40
360.0
25.6
360.0
18.0
7.6
45
360.0
25.8
360.0
17.7
8.1
50
358.0
25.2
358.0
17.6
7.6
55
358.0
25.7
360.0
17.6
8.1
60
358.0
25.9
358.0
17.4
8.5
70
360.0
25.8
358.0
17.5
8.3
80
358.0
25.6
360.0
16.8
8.8
90
358.0
25.6
360.0
16.0
9.6
100
360.0
25.1
360.0
16.2
8.9
注释：
1—L-色氨酸的发射峰位；2—L-色氨酸的荧光强度；
3—L-色氨酸与TCBQ发射峰位；4—L-色氨酸与TCBQ荧光强度；
表5温度（40℃）和时间的影响
时间（min）
1（nm）
2
3（nm）
4
△F
0
360.0
33.1
358.0
24.8
8.3
5
360.0
26.3
360.0
21.0
5.3
10
360.0
24.4
360.0
19.4
5.0
15
358.0
24.0
360.0
19.1
4.9
20
358.0
24.8
360.0
19.3
5.5
25
360.0
25.1
360.0
19.5
5.6
30
358.0
25.3
360.0
18.8
6.5
35
360.0
24.6
358.0
18.7
5.9
40
358.0
24.8
360.0
19.1
5.7
45
358.0
24.8
360.0
18.6
6.2
50
358.0
24.6
360.0
18.5
6.1
55
360.0
25.0
360.0
18.1
6.9
60
358.0
24.7
360.0
18.1
6.6
70
360.0
25.3
360.0
17.5
7.8
80
362.0
24.4
360.0
17.2
7.2
90
358.0
24.2
362.0
17.0
7.2
100
360.0
24.1
360.0
16.9
7.2
注释：
1—L-色氨酸的发射峰位；2—L-色氨酸的发射强度；
3—L-色氨酸与TCBQ发射峰位；4—L-色氨酸与TCBQ发射强度；
3.1.4表面活性剂的影响
按照实验方法配制溶液，分别加入不同的表面活性剂，浓度均为0.1mol/L，用量均为1mL，测定L-色氨酸的发射强度及其猝灭量，结果（表6）表明，十二烷基硫酸钠、曲拉通X-100、溴代十六烷基吡啶猝灭量较大，但由于（表7）表明，曲拉通X-100本身就有强的荧光，而溴代十六烷基吡啶的猝灭量相对于十二烷基硫酸钠较大，所以本实验采用溴代十六烷基吡啶溶液作为表面活性试剂。
表6表面活性剂的影响
表面活性剂
十六烷基三甲基溴化铵
十二烷基磺酸钠
不加表面活性剂
十二烷基硫酸钠
溴代十六烷基吡啶
曲拉通X-100
吐温20
吐温80
1（nm）
366.0
364.0
364.0
312.0
364.0
﹥100
366.0
364.0
2
44.1
44.9
44.1
67.8
35.5
—
41.2
43.8
3（nm）
364.0
364.0
364.0
360.0
370.0
﹥100
366.0
364.0
4
25.9
31.9
286
39.4
9.0
—
32.9
28.9
△F
18.2
13.0
15.5
28.4
26.5
—
8.3
14.9
注释：
1—L-色氨酸的发射峰位；2—L-色氨酸的发射强度；
3—L-色氨酸与TCBQ发射峰位；4—L-色氨酸与TCBQ发射强度；
表7表面活性剂的影响
表面活性剂
十二烷基硫酸钠
曲拉通X-100
曲拉通X-100本身
溴代十六烷基吡啶
1（nm）
358.0
306.0
308.0
364.0
2
62.0
82.2
72.3
38.5
3（nm）
358.0
308.0
304.0
366.0
4
44.2
32.6
82.2
9.3
△F
17.8
49.6
—
29.2
注释：
1—L-色氨酸的发射峰位；2—L-色氨酸的发射强度；
3—L-色氨酸与TCBQ发射峰位；4—L-色氨酸与TCBQ发射强度；
3.1.5表面活性剂用量的影响
按实验方法改变溴代十六烷基吡啶溶液的用量，结果（表8）表明。
溴代十六烷基吡啶溶液的用量为0.7mL时，猝灭量较大，本实验采用用量为0.7mL。
表8表面活性剂用量的影响
用量（mL）
0
0.5
0.7
0.9
1.0
1.1
1.3
1.5
2.0
1（nm）
364.0
360.0
362.0
362.0
360.0
364.0
364.0
364.0
357.0
2
44.7
40.0
36.8
33.9
33.1
30.4
28.5
26.0
24.1
3（nm）
360.0
368.0
362.0
364.0
362.0
366.0
366.0
366.0
359.0
4
36.5
14.8
10.9
8.6
9.5
12.8
11.8
10.6
11.0
△F
8.2
25.2
25.9
25.3
23.6
17.6
16.7
15.4
13.1
注释：
1—L-色氨酸的发射峰位；2—L-色氨酸的发射强度；
3—L-色氨酸与TCBQ发射峰位；4—L-色氨酸与TCBQ发射强度；
3.1.6试剂TCBQ用量的影响
按照实验方法改变试剂TCBQ溶液的用量，结果（表9）表明，TCBQ的用量为0.30mL时，猝灭量最大。
但当TCBQ用量大于0.40ml时，试剂完全猝灭，没有定量关系，所以本实验采用TCBQ用量为0.30ml
表9试剂TCBQ用量的影响
用量（nm）
0
0.01
0.02
0.06
0.1
0.15
0.20
0.30
△F
—
2.6
5.6
16.8
19.1
24.5
29.3
30.8
图3试剂用量的选择
3.1.7酸度的影响
分别以0.1mol/L硼砂溶液和pH值不同的三酸溶液为缓冲溶液，按照实验方法测定其发射强度并计算其猝灭量，结果见表10、11、12、。
由表10可知，在pH=10—11L-色氨酸的发射强度最大并且猝灭量最大；表11表明，在pH=10.5—11.5L-色氨酸的发射强度最大并且猝灭量最大；表12表明，在pH=10.9猝灭量最大，则本实验选用pH=10.9为缓冲溶液。
表10酸度的影响
PH
1（nm）
2
3（nm）
4
△F
硼砂
358.0
34.4
360.0
22.2
12.2
0
354.0
15.9
356.0
3.4
12.5
1
354.0
9.9
356.0
6.9
3.0
2
356.0
12.3
357.0
8.6
3.7
3
357.0
18.0
357.0
13.1
4.9
4
357.0
21.7
353.0
13.0
8.7
5
351.0
20.8
349.0
15.4
5.4
6
345.0
19.9
343.0
13.5
6.4
7
339.0
19.4
335.0
13.7
5.7
8
331.0
21.9
330.0
14.3
7.6
9
334.0
25.9
332.0
18.4
7.5
10
334.0
43.1
332.0
28.0
15.1
11
332.0
54.3
332.0
32.7
21.6
12
332.0
8.0
334.0
4.7
3.3
13
326.0
7.9
326.0
3.9
4.0
14
无蜂
—
—
—
—
注释：
1—L-色氨酸的发射峰位；2—L-色氨酸的发射强度；
3—L-色氨酸与TCBQ发射峰位；4—L-色氨酸与TCBQ发射强度；
表11酸度的影响
pH
1（nm）
2
3（nm）
4
△F
10.0
360.0
41.9
360.0
31.3
10.6
10.5
360.0
47.1
360.0
35.5
11.6
11.0
360.0
50.8
360.0
36.8
14.0
11.5
360.0
33.1
362.0
22.7
10.4
12.0
360.0
7.2
362.0
3.2
4.0
注释：
1—L-色氨酸的发射峰位；2—L-色氨酸的发射强度；
3—L-色氨酸与TCBQ发射峰位；4—L-色氨酸与TCBQ发射强度；
表12酸度的影响
PH
1（nm）
2
3（nm）
4
△F
10.5
364.0
43.1
278.0
31.7
11.4
10.7
364.0
45.9
278.0
31.1
14.8
10.9
364.0
44.1
278.0
28.6
15.5
11.0
364.0
45.2
278.0
31.6
14.6
11.1
364.0
43.8
278.0
29.9
13.8
11.3
364.0
39.9
280.0
29.1
10.8
注释：
1—L-色氨酸的发射峰位；2—L-色氨酸的发射强度；
3—L-色氨酸与TCBQ发射峰位；4—L-色氨酸与TCBQ发射强度；
3.1.8加入次序的影响
按照实验方法配制溶液，改变L-色氨酸、TCBQ、缓冲溶液及溴代十六烷基吡啶溶液的加入次序，测定其猝灭量，结果（表13）表明，加入次序为L-色氨酸、TCBQ、溴代十六烷基吡啶缓冲溶液时，测得的猝灭量最大。
表13加入次序的影响
序号
1
2
3
4
5
6
△F
14.3
15.1
15.8
14.4
14.9
14.1
各序号加入次序分别为：
1，L-色氨酸、TCBQ、溴代十六烷基吡啶、PH缓冲溶液
2,L-色氨酸、溴代十六烷基吡啶、TCBQ、PH缓冲溶液
3,TCBQ、L-色氨酸、溴代十六烷基吡啶、PH缓冲溶液
4,TCBQ、溴代十六烷基吡啶、L-色氨酸、PH缓冲溶液
5,溴代十六烷基吡啶、L-色氨酸、TCBQ、PH缓冲溶液
6,溴代十六烷基吡啶、TCBQ、L-色氨酸、PH缓冲溶液
3.2精密度的测定
在选定的最佳条件下，移取相同量的L-色氨酸溶液，按实验方法平行测定10次，结果（见表14）。
计算得，相对标准偏差为0.96%。
表14精密度的测定
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
△F
44.2
44.4
43.8
43.6
44.8
44.5
43.5
44.1
44.3
44.0
3.3工作曲线的绘制
按实验方法，准确移取不同量的L-色氨酸溶液，在选定的最佳条件下，分别测色氨酸本身和色氨酸-TCBQ体系的荧光值，求两者荧光猝灭量，并绘制工作曲线（数据见表15，见图3），结果表明，该方法下得L-色氨酸含量0~2.0μg/mL时荧光猝灭量与色氨酸的含量呈良好的线性关系，线性回归方程△F=25.48571C+0.32857（单位为µg/mL），相关系数R=0.99902，该方法下最低检测限为C=0.037µg/mL（以3S／K计算，S为试剂空白测定值的标准偏差，S=0.425，K为工作曲线的斜率）。
即在该方法中，当其信噪比为3时，该方法最低检测限为0.037µg/mL。
表15工作曲线的测定
加入体积（mL）
0.0
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
浓度C（µg/mL）
0.0
1.0
1.5
2.0
2,5
3.0
F1
0.0
28.2
43.6
56.6
67.5
77.7
F2
0.0
2.4
3.7
6.3
7.8
10.0
△F
0.0
25.8
39.9
50.3
59.7
67.7
3.4反应机理的探讨
按实验方法，分别在20℃和30℃下,准确移取不同量的L-色氨酸溶液，反应后测定络合物的猝灭量，并绘制曲线（数据见表16,
升级会员 