b型流感嗜血杆菌结合疫苗.docx

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b型流感嗜血杆菌结合疫苗

b型流感嗜血杆菌结合疫苗

bXingLiuganshixueganjunJieheYimiao

HaemophilusInfluenzaeTypebConjugateVaccine

本品系用纯化的b型流感嗜血杆菌（Hib）荚膜多糖（Capsularpolysaccharide，CPS）抗原，通过己二酰肼（ADH）与破伤风类毒素（Tetanustoxoid，TT）蛋白共价结合制成。

用于预防b型流感嗜血杆菌引起儿童的感染性疾病，如脑膜炎、肺炎等。

1基本要求

生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

2制造

2.1菌种

生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。

2.1.1菌种名称及来源

采用b型流感嗜血杆菌CMCC58547或CMCC58534菌株，来源于中国药品生物制品检定所。

2.1.2种子批的建立

应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。

2.1.3种子批的传代

主种子批启开后传代次数不超过5代，工作种子批启开后至接种发酵罐培养传代次数不得超过5代。

2.1.4种子批菌种的检定

检定菌种可用含羊血的巧克力培养基或Hib综合培养基。

b型流感嗜血杆菌菌种在普通营养琼脂培养基上不生长，在含羊血的巧克力培养基或在Hib综合琼脂培养基上生长，生长需要X因子（氯化血红素）、V因子（β辅酶A）；卫星试验阳性，菌落形状灰白色、半透明、光滑凸起，湿润，边缘规则。

应为革兰氏阴性短小杆菌、有荚膜，有时连成线状，亦可有单个阴性球菌。

生化反应

发酵葡萄糖、木糖、半乳糖，产酸不产气。

不发酵蔗糖、乳糖和果糖。

赖氨酸脱羧酶反应呈阴性。

将在35～37℃培养的菌苔，与Hib免疫血清进行玻片凝集试验，应有强凝集反应。

2.1.5种子批的保存

种子批应冻干后保存于8℃以下。

2.2原液

2.2.1生产用种子

启开工作种子批菌种，接种在液体或固体Hib综合培养基上，制备数量适宜的生产用种子。

采用Hib综合培养基。

不得含有对人体有害或其他过敏原物质。

采用培养罐液体培养，在培养过程中取样进行纯菌试验、涂片革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。

于对数生长的后期或静止期的前期终止培养，取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，然后于培养物中加入适宜浓度的甲醛溶液或脱氧胆酸钠溶液杀菌，以确保杀菌完全及不损伤Hib荚膜多糖为宜。

2.2.5多糖提取和纯化

，离心去菌体后收集上清液，采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）沉淀收集复合多糖，乙醇沉淀收集粗制多糖，或超滤浓缩后乙醇沉淀，取上清，然后加入适宜浓度的乙醇溶液沉淀多糖，并依次用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀物，干燥后即为粗制多糖，-20℃或以下保存。

将粗制多糖溶解于1/10饱和醋酸钠溶液中，然后按适当比例用冷酚溶液重复抽提数次。

收集上清液，并透析或超滤脱酚，再加乙醇至最终浓度为60%-80%，离心后收集沉淀物，或超滤浓缩后乙醇沉淀，取上清，然后加入60%-80%的乙醇溶液沉淀多糖，依次用无水乙醇、丙酮于离心洗涤，真空干燥，所得固体即为精制多糖。

多糖检定

按3.1项进行。

保存及有效期

保存于-20℃或以下，保存时间按批准的执行。

，按适宜比例加入溴化氰进行活化，然后向反应液中加入适宜浓度的己二酰肼溶液，反应过夜。

再将反应液超滤或透析。

可冻干收集固体衍生物。

多糖衍生物检定

按3.2项检定。

保存及有效期

保存于－20℃或以下，保存时间不超过30天。

2.2.7载体蛋白

载体蛋白为破伤风类毒素。

破伤风类毒素原液制造和检定应符合“吸附破伤风疫苗”2.1-2.2项规定。

可采用柱色谱或其他经批准的方法对破伤风类毒素原液进一步纯化，并配制至适宜浓度。

2.2.8多糖蛋白结合物的制备

多糖衍生物与破伤风类毒素蛋白等量混合，加入碳二亚胺（EDAC）进行反应。

然后透析或超滤透析。

结合物用柱色谱纯化,收集Vo附近的洗脱液，合并各次层析收获的洗脱液即为纯化的结合物，除菌过滤后,即为结合物原液。

2.2.9原液检定

按3.3项检定。

保存及有效期

保存于2～8℃，保存时间不超过6个月。

2.3半成品

2.3.1配制

用氯化钠注射液稀释多糖结合物原液，每1毫升疫苗溶液含Hib荚膜多糖应不低于20µg。

2.3.2半成品检定

按3.4项进行。

2.4成品

2.4.1分批

应符合“生物制品分批规程”规定。

2.4.2分装

应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。

2.4.3规格

每瓶0.5ml，每1次人用剂量0.5ml，含纯化b型流感嗜血杆菌荚膜多糖10µg。

2.4.4包装

应符合“生物制品包装规程”规定。

3检定

3.1多糖检定

3.1.1鉴别试验

采用免疫双扩散法（附录VIIIＣ），应与b型流感嗜血杆菌免疫血清形成明显沉淀线。

3.1.2化学检定

固体总量

依法测定（附录VIIM）。

核糖含量

以D-核糖为对照，应为320-410mg/g（附录XXXX）。

磷含量

应为68-90mg/g（附录VIIA）。

蛋白质含量

应小于10mg/g（附录VIB第二法）。

核酸含量

应小于10mg/g，核酸在波长260nm处的吸收系数（E1%1cm）为200（附录IIA）。

多糖分子大小测定

采用SepharoseCL-4B凝胶柱（1.6×100cm）测定，KD≤0.5的多糖回收率应不低于50%。

（附录XXX）。

3.1.3细菌内毒素检查

应不高于25EU/µg（附录XIIE）。

3.2多糖衍生物检定

3.2.1己二酰肼含量

应为16–45µg/mg（附录XXXX）。

3.2.2残余氰化物含量

应不高于10ng/mg（附录XXXX）。

3.3结合物原液检定

3.3.1鉴别试验

采用免疫双扩散法（附录VIIIＣ），应与b型流感嗜血杆菌免疫血清及破伤风类毒素免疫血清形成明显沉淀线。

3.3.2化学检定

以D-核糖为对照，按核糖含量计算结合物中多糖含量，应不低于28µg/ml（附录XXXX）。

蛋白质含量

应不低于48µg/ml（附录VIB第二法）。

多糖与蛋白质的比值

按，应为0.30-0.59。

高分子结合物含量

高分子结合物应为80%-100%或游离多糖≤20%（附录XXXX）。

分子大小测定

采用SepharoseCL-4B凝胶柱（1.6×100cm）测定，KD值应不高于0.20，KD值小于0.20的洗脱液回收率应不低于60%。

（附录VIIIG）

EDAC残留量

采用N.wilchek方法测定，EDAC残留量应低于10µmol/L（附录XXXX）。

3.3.3无菌检查

依法检查（附录XIIA），应符合规定。

3.3.4细菌内毒素检查

应不高于5EU/µg（附录XIIE）。

3.4半成品检定

无菌试验

依法检查（附录XIIA），应符合规定。

3.5成品检定

3.5.1鉴别试验

采用免疫双扩散法（附录VIIIＣ），应与b型流感嗜血杆菌免疫血清及破伤风类毒素免疫血清形成明显沉淀线。

3.5.2物理检查

外观检查

应为无色透明液体，无异物。

装量

按附录ＩＡ中装量项进行检查，应不低于标示量。

3.5.3化学检定

pH值

应为5.0～7.0（附录VA）。

氯化钠含量

应为7.5-9.5/L（附录VIIG）。

多糖含量

以D-核糖为对照，按核糖含量计算供试品中多糖含量，每１次人用剂量应为10～15µg（附录XXXX）。

高分子结合物含量

高分子结合物应为80%-100%或游离多糖≤20%（附录XXXX）。

分子大小测定

采用SepharoseCL-4B凝胶柱（1.6×100cm），KD值小于0.2的洗脱液回收率应大于60%（附录VIIIG）。

3.5.4效力试验

每批疫苗皮下注射体重12-14克NIH（或BALb/c）小鼠10只，另取同批小鼠10只作为对照，注射0.85%氯化钠溶液。

于第1、14日皮下注射两次，每次注射剂量为含2.5µg多糖的Hib结合疫苗，于第21～28日经眼眶后静脉采血，以ELISA法测定抗HibIgG抗体，以0.85%氯化钠溶液对照组小鼠血清的A值求出Cutoff值，疫苗组应有80％以上小鼠的血清抗HibIgG抗体水平高于Cutoff值。

3.5.5无菌检查

依法检查（附录XIIA），应符合规定。

3.5.6热原检查

依法检查（附录XIID），应符合规定。

注射剂量按家兔体重每1kg注射1.0µg多糖。

3.5.7异常毒性检查

依法检查（附录XIIF），应符合规定。

3.5.8细菌内毒素检查

每1次人用剂量应不高于25EU（附录XIIE）。

4保存、运输与效期

于2-8℃保存和运输，自生产之日起效期为24个月。

5使用说明

b型流感嗜血杆菌结合疫苗使用说明

【药品名称】

通用名：

b型流感嗜血杆菌结合疫苗

英文名：

HaemophilusinfluenzaeTypebConjugateVaccine

汉语拼音：

bXingLiuganshixueganjunJieheYimiao

【成分和性状】

本品系用纯化的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖与破伤风类毒素共价结合而成。

为无色透明液体，含防腐剂，不含异物或凝块。

辅料：

按批准的执行。

【接种对象】

2或3月龄婴儿～5周岁儿童。

【作用与用途】

本疫苗接种后，可使机体产生体液免疫应答。

用于预防由b型流感嗜血杆菌引起的侵袭性感染（包括脑膜炎、肺炎、败血症、蜂窝组织炎、关节炎、会厌炎等）。

【规格】

每瓶为0.5ml，每1次人用剂量为0.5ml，含纯化b型流感嗜血杆菌荚膜多糖应不低于10µg。

【免疫程序和剂量】

臀部外上方1/4处或上臂外侧三角肌附着处皮肤经消毒后肌肉注射。

免疫程序及剂量：

自2（3）月龄开始，每隔1个月或2个月接种一次（0.5ml），共三次，在18个月时进行加强接种一次；6～12月龄儿童，每隔1个月或2个月注射一次（0.5ml），共二次，在18个月时进行加强接种一次；1～5周岁儿童，仅需注射一次（0.5ml）。

【不良反应】

注射后一般无副反应，有的接种部位有轻微红肿、硬结、压痛、低热或伴有皮疹，偶有局部瘙痒感，一般不须特殊处理，即行消退。

必要时可对症治疗。

全身反应：

主要为发热（多在38.5℃以下），偶有烦躁、嗜睡、呕吐、腹泻、食欲不振，少有会出现非典型的皮疹，症状一般可自行缓解。

【禁忌】

（1）患急性疾病、严重慢性疾病、慢性疾病的急性发作期和发热者。

（2）已知对该疫苗的任何成份有过敏反应，特别对破伤风类毒素过敏者。

（3）严重心脏病、高血压，患肝、肾脏病者。

【注意事项】

（1）以下情况者慎用：

家族和个人有惊厥史者、患慢性疾病者、有癫痫史者、过敏体质者。

（2）使用前应充分摇匀，如出现摇不散的凝块，有异物，疫苗瓶有裂纹，制品曾经冻结，

标签不清或过期失效者不可使用。

（3）接受免疫抑制治疗或免疫缺陷患者注射本疫苗可能影响疫苗的免疫效果。

（4）应备有肾上腺素等药物，以供偶有发生的严重过敏反应时急救用，接受注射者在注射后应

在现场观察至少30分钟。

（5）本疫苗如与其它疫苗同时接种，应在不同的部位注射。

（6）在任何情况下，疫苗中的破伤风类毒素不能代替常规破伤风类毒素的免疫接种。

【贮藏】

于2～8℃避光保存和运输。

【包装】

【有效期】

24个月。

【执行标准】

【批准文号】

【生产企业】

企业名称：

生产地址：

邮政编码：

电话号码：

传真号码：

网址：

附录1多糖含量测定

本法系依据可溶性糖经无机酸处理脱水产生糠醛（戊糖）或糠醛衍生物，生成物能与酚类化合物缩合生成有色物质，以此测定Hib结合物中多糖的含量。

试剂

（1）0.1%（w/v）三氯化铁浓盐酸溶液称取三氯化铁（FeCl3·6H2O）0.1加浓盐酸使溶解成100ml。

（2）地衣酚（3，5-2甲基间苯二酚）乙醇溶液称取地衣酚1g，放入10ml容量瓶中，加95%乙醇至10ml（临用前配制）。

（3）25µg/ml核糖对照品溶液称取D-核糖1.25mg加水至50ml。

测定法取2ml水加入2ml三氯化铁浓盐酸溶液，混匀后再加入0.2ml地衣酚乙醇溶液,混匀。

沸水浴20分钟，冰水浴，在670nm波长测A值，作为空白对照。

先将供试品用水稀释到核糖含量应不高于25µg/ml，然后取1.0ml待测样品，加水1.0ml，自“加入2ml三氯化铁浓盐酸溶液”起,同法操作。

分别取核糖对照品溶液（25μg/ml）0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml于10ml试管中，每管依次加水1.9ml、1.8ml、1.6ml、1.4ml、1.2ml、1.0ml，自“加入2m三氯化铁浓盐酸溶液”起，同法操作。

结果计算用核糖对照品溶液的浓度对其相应的A值作直线回归，得直线回归方程。

将待测样品的A值代入直线回归方程，求出待测样品核糖含量a（µg/ml）。

待测样品多糖含量（μg/ml）＝a×待测样品稀释倍数/0.41

附录2己二酰肼含量测定

本法系依据在四硼酸钠存在的条件下，己二酰肼中氨基基团能与三硝基苯磺酸（TNBS）发生显色反应，采用采用紫外-可见分光光度法测定Hib多糖衍生物中己二酸二肼（ADH）的含量。

试剂

（1）己二酰肼对照品贮备溶液（1mg/ml）取ADH0.100g，精密称定，加水定容至100ml，-20℃保存。

（2）己二酰肼对照品工作溶液（20µg/ml）精密量取ADH标准贮备液0.2ml加水定容至10ml。

（3）5%四硼酸钠溶液称取四硼酸钠（Na2B4O7·10H2O）25g加水定容至500ml，室温保存。

（4）3%TNBS溶液量取TNBS5ml，加水定容至50ml，-20℃保存。

测定法

量取5%四硼酸纳溶液1.0ml，加水1ml，混匀，再加入3%的TNBS溶液0.3ml，混匀，于室温放置15分钟，于500nm波长下测定A值，作为空白对照；

先将供试品用水稀释到ADH浓度应不高于20µg/ml，然后取1.0ml，加入5%四硼酸纳溶液1.0ml，自“加入3%的TNBS溶液0.3ml”起同法操作。

分别取ADH对照品工作溶液（20µg/ml）0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，每管依次加水0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml、0ml，加入5%四硼酸纳溶液1.0ml，自“加入3%的TNBS溶液0.3ml”起同法操作。

结果计算用ADH对照品工作溶液的浓度对其相应的A值作直线回归，得直线回归方程，将待检样品的A值代入直线回归方程，求出待检样品ADH含量B（µg/ml）。

ADH的含量可计算为：

B×稀释倍数×2

X（mg/ml）

式中B为样品中ADH含量；X为样品中衍生物多糖含量。

附录3残余氰化物含量测定

本法系依据在酸性条件下，溴化氰与吡啶联苯胺发生显色反应，采用采用紫外-可见分光光度法测定Hib多糖衍生物物中溴化氰的含量。

试剂

吡啶联苯胺溶液（临用前配制）：

取联苯胺0.5g，精密称定，加入60%的吡啶溶液50ml（取吡啶30ml,加水20ml）溶解，再加入2%盐酸10ml（取浓盐酸0.5ml,加水9.5ml），混匀。

对照品溶液的制备:

0.1mg/ml溴化氢对照品储备溶液:

临用前配制,取溴化氰10mg,精密称定，加水100ml（乙腈助溶）。

。

500ng／ml溴化氢对照品工作溶液：

精密量取溴化氢对照品储备液1ml加水至200ml，混匀。

供试品溶液制备：

取多糖衍生物适量，配制成10mg/ml，用于检测。

测定法

量取吡啶联苯胺溶液2.0ml，加水2.0ml，混匀，20℃以下、暗处放置15分钟后，于520nm下测定A值，作为空白对照。

取试品用2.0ml，吡啶联苯胺溶液2.0ml，混匀，20℃以下、暗处放置15分钟后，于520nm下测定A值。

分别取溴化氢对照品工作液（500ng/ml）0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，每管依次加水1.9ml、1.8ml、1.6ml、1.4ml、1.2ml、1.0ml，加入吡啶联苯胺溶液2.0ml，混匀，20℃以下、暗处放置15分钟后，于520nm下测定A值。

结果计算

用溴化氢对照品工作液的含量对其相应的A值作直线回归，得直线回归方程，将供试品的A值代入直线回归方程，求出供试品溴化氢含量B（ng/ml）。

供试品中溴化氰的含量（ng/mg）=B/20

式中B为样品中溴化氰含量（ng/ml）；20为样品中衍生物含量。

附录4高分子结合物含量测定

本法系利用高分子结合物与低分子结合物及游离多糖在不同乙醇浓度下，沉淀分离，采用采用紫外-可见分光光度法测定磷含量，以此确定高分子结合物的含量。

试剂

（1）5mol/L氯化钠溶液取氯化钠29.22g，精密称定，加水溶解并稀释至100ml，室温保存。

（2）1.5mol/L硫酸于1体积98％的浓硫酸中加入11体积的水，混匀制得。

（3）2.5％（w/v）钼酸铵称取钼酸铵2.5g加水溶解并稀释至100ml。

（4）10％（w/v）抗坏血酸称取抗坏血酸10g加水溶解并稀释至100ml。

（5）矿化试剂浓硫酸与70%高氯酸等体积混合制得。

（6）产色试剂水、1.5mol/L硫酸、2.5％（w/v）钼酸铵、10％（w/v）抗坏血酸按体积比2：

1：

1：

1混合制得。

（7）80μg/ml磷对照品贮备溶液取经100℃干燥的磷酸氢二钠0.3509g，精密称定，加水500ml、5mol/L硫酸溶液10ml溶解，补加水至1000ml。

临用时，将贮备液1/20稀释即为4µg/ml磷对照品工作溶液。

（8）1.0mol/l氢氧化钠溶液称取4g氢氧化钠加水溶解并稀释至100ml。

供试品的制备

（1）分步沉淀原液用生理盐水稀释至多糖含量20－28μg/ml或成品疫苗3ml，加入5mol/L氯化钠溶液0.75ml，混匀后加入无水乙醇15ml置-20℃冰箱放置72-96小时，于8000转/分钟、4℃离心90分钟，吸取上清为样品2；于沉淀中加入50%乙醇溶液0.5ml，加玻璃珠，混合后室温放置1小时。

再加入50%乙醇溶液1.5ml混合后室温放置2小时，然后于8000转/分钟、8℃离心1小时。

吸取1.8ml上清为样品3，沉淀再加入1.0mol/L氢氧化钠溶液0.5ml，混合后室温放置1小时，加水1.25ml，为样品4。

（2）取多糖含量20－28μg/ml或成品疫苗1.0ml为样品1

（3）样品矿化分别取1.0mm样品1、1.5ml样品2、0.7ml样品3、0.5ml样品4各2份；加入矿化试剂0.15ml，置150℃干燥1小时，然后升温至180℃干燥30分钟，再升温至250℃干燥1小时。

测定法

取水1.95ml，加矿化试剂50µl后加2.0ml产色试剂，混匀后于37℃水浴2小时，在825nm波长测定A值，作为空白对照。

于矿化好的供试品中加水1.85ml，加产色试剂2.0ml，混匀后置37℃水浴2小时，在825nm波长测A值。

分别量取磷对照品工作溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.0ml于试管中，每管依次加水1.85ml、1.75ml、1.55ml、1.15ml、0.95ml。

然后每管分别加入矿化试剂50µl后加2.0ml产色试剂，混匀后于37℃水浴2小时，在825nm波长测A值。

结果计算用磷对照品溶液的浓度对其相应的A值作直线回归，得直线回归方程。

将供试品的A值代入直线回归方程，求出磷含量。

供试品磷含量（µg/ml）分别为：

P1=（A1×3）/1.0

P2=（A2×18.75）/1.5

P3=（A3×2.0）/0.7

P4=（A4×2.0）/0.5–（P3×10）/100

试验有效性80%≤P1/（P2+P3+P4）≤120%

供试品高分子化合物含量（％）＝P4/（P2+P3+P4）×100%

供试品游离多糖含量（％）＝[1－P4/（P2+P3+P4）]×100%

式中P1、P2，P3，P4为样1，样2，样3，样4的磷含量；A1，A2，A3，A4为样1，样2，样3，样4中取样矿化后的磷含量。

附录5碳二亚胺（EDAC）残留量测定法

本法系依据二甲基巴比妥酸试液与碳二亚胺反应形成紫红色络合物，采用紫外-可见分光光度法测定碳二亚胺的含量。

试剂

（1）二甲基巴比妥酸试液（Dimelhybarbituricacid）（临用现配）

称取二甲基巴比妥酸1g于16ml吡啶中，并加水至20ml，混匀，即得。

（2）乙酸吡啶溶液（Aeclicacid-Pyridine）（临用现配）

将等体积的冰乙酸和吡啶混匀即得。

（3）100µmol/L碳二亚胺（EDAC）对照品储备液（临用现配）

称取0.0192gEDAC，以水溶解并定容至100ml，得1mmol/L溶液，准确量取1mmol/L溶液1ml于10ml容量瓶定容至刻度即得100µmol/LEDAC对照品储备液。

（4）EDAC对照品工作溶液的制备

取100µmol/L碳二亚胺（EDAC）对照品储备液，用水分别稀释至10、20、40、60、80µmol/L，即为EDAC对照品工作溶液。

测定法

取供试品和EDAC对照品工作溶液各0.2ml，分别加入二甲基巴比妥酸试液1.8ml，另取水0.2ml作为空白对照，同法操作，混匀各管，室温暗处静置30分钟，分别加入乙酸吡啶溶液2.0ml，混匀后于599nm波长处测定A值（如试验有干扰，在测吸光值前4000rpm离心5分钟）。

结果计算用EDAC对照品溶液的浓度对其相应的A值作直线回归，得直线回归方程。

将供试品的A值代入直线回归方程，求出含量，取其平均值。

供试品EDAC残留量（µmol/L）=EDAC的平均浓度×稀释倍数