生化分离.docx
《生化分离.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生化分离.docx（14页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
生化分离
生化分离
第一章绪论
生化分离技术：
生物技术下游加工过程生化物质的提取分离精制，是生物化学工程的一个重要组成部分。
从发酵液或酶反应液或动植物细胞培养液中分离、纯化生物产品的过程。
生物技术下游加工过程的意义：
基因工程产物，提高了产量、降低了成本。
但是下游加工过程是十分艰难代价：
原料稀溶液-产物高纯度高活性。
生化分离的特点：
组分复杂：
细胞细胞碎片、蛋白质、核酸、脂类、糖类，无机盐等
浓度低：
青霉素：
3.6%、庆大霉素：
0.2%，胰岛素：
0.001%
分离过程中容易失活：
pH，离子强度、温度等变化
性质不稳定：
空气氧化、微生物污染、蛋白质水解等
具经验性，均一性的相对性
下游加工过程遵循的原则：
时间短、温度低、pH适中、勤清洗、消毒。
絮凝：
加入聚丙烯酸酰胺、聚乙烯亚胺，由天然高分子物质吸附架桥作用使微粒相互黏结的过程是絮凝。
作用：
絮凝和凝集加快重力沉降，大大提高过滤分离单元的速度和质量。
离心沉降：
分离细胞，除去或回收菌体或细胞、血球细胞、细胞器、病毒、蛋白质的分离。
（一）差速离心法
原理：
采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒在不同的分离速度及不同的离心时间下分批分离的方法，称为差速离心法。
常用于从组织匀浆中分离细胞和病毒。
（二）速率—区带离心
原理：
不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。
可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分
（三）等密度梯度离心
原理：
当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成区带，从而使不同浮力密度的物质得到分离。
等密度梯度离心一般常用CsCL、RuCL、蔗糖、甘油等做介质。
介质梯度不需预先制备，离心时把密度均一的介质液和样品混合后装入离心管，通过离心形成梯度，让颗粒在梯度中进行再分配。
常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。
梯度回收
1、穿刺法2、取代法3、虹吸法4、切割法
过滤：
利用薄片形多孔性介质截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法称为过滤。
悬浮液中的颗粒很细时，过滤时很容易堵死过滤介质的孔，或所形成的滤饼在过滤的压力差作用下，孔隙很小，阻力很大，使过滤困难.。
常用助滤剂：
（1）硅藻土：
由硅藻土经干燥或煅烧，粉碎、筛分而得到粒度均匀的颗粒，其中主要成分为含80～95％SiO2的硅酸
（2）珍珠岩：
珍珠岩粉末在1000℃下迅速加热膨胀后，经粉碎、筛分得到粒度均匀的颗粒，其主要成分为含70％SiO2的硅酸铝
（3）石棉：
石棉粉与少量硅藻土混合而成
（4）炭粉、纸浆粉等
常用的过滤设备：
板框压滤机、鼓式真空压滤机
细胞破碎：
高速珠磨、压榨、高压匀浆、超声破碎、喷雾撞击破碎
化学法：
酸碱、化学试剂：
表面活性剂、有机溶剂、变性剂
酶法
物理方法：
微波法、物理渗透法9渗透压冲击）冻融、压力释放
干燥处理：
空气干燥、真空干燥、冷冻干燥、溶剂干燥
不同破碎方法的比较
第三章初级分离
泡沫分离：
根据表面吸附的原理利用通气鼓泡在液相中形成的气泡为载体对液相中的溶质或颗粒进行分离。
泡沫分馏：
分离对象：
真溶液、可溶解物质、表面活性剂
金属粒子、阴离子、蛋白质、酶
条件：
必须能和某类表面活性剂结合
泡沫浮选：
不溶解物质
矿物浮选、粗粒浮选、微粒浮选、离子浮选、分子浮选、沉淀浮选、吸附胶体浮选
条件：
必须加入捕集剂，形成难溶或不溶物，浮渣脱除
鼓泡分离：
底部鼓泡，表面活性物质被气泡富集上升至塔顶。
溶媒浮选：
溶液顶部与其不相容的溶剂萃取富集表面活性物质
泡沫分离的基本原理
表面活性剂：
加入少量的物质能使液体的表面张力显著降低
结构特点：
亲水基团、亲油基团组成
基本性质：
1、水中溶解，很快形成亲水基团向水，亲油基团向空气定向单分子排列，使空气、水接触面积减少，表面张力急剧下降，多余分子在溶液内部形成分子状态的聚集体－胶束，分布在液向主体内。
2、超过表面活性剂形成胶束的最小浓度后，溶液表面张力不再降低，在相界面由于定向排列的单分子层作用，具有选择吸附作用。
显著改变溶液界面性质造成各种界面作用。
基本过程：
待分离的物质吸附到气－液界面
被泡沫吸附的溶质的收集提取
操作方式：
间歇式泡沫分离过程、连续式泡沫分离过程
泡沫的破碎：
静置法、离心法、超声波、振动加热、声波、络合剂
影响泡沫分离的因素：
1、操作条件的影响
气流速度的影响：
缩短分离时间，降低分离后溶液的浓度，提高回收率，泡沫液体含量增加，降低富集比
泡沫区高度的影响：
泡沫停留时间延长，泡沫破碎排水增大，收集的泡沫数量减少，泡沫含水量减少，富集比增大，回收率降低
液相高度的影响：
高度增大，泡沫停留时间延长,有利于吸附平衡，对少数分离有影响
温度的影响：
温度增加，泡沫产生的数量增加，泡沫含水率减小，富集比增大。
2、溶液体系性质的影响
进料浓度的影响：
浓度低时，提高浓度，富集比增加，浓度过高，富集比降低回收率提高。
溶液pH值的影响溶液：
影响很大,等电点处,分离效果最好
表面活性剂种类，浓度的影响：
浓度不超过临界胶束浓度，但太低泡沫不稳定，分离效率降低。
溶液离子强度的影响：
改善界面吸附提高排液,增加泡沫的稳定性,加大泡沫产量；可以强化分离过程,提高回收率；泡沫含水量,降低富集比。
泡沫分离技术的应用：
分离固体粒子；分离溶液中的离子、分子，处理工业废水；回收、浓缩蛋白质等表面活性物质；分离全细胞
泡沫分离技术优点：
适合低浓度的分离回收；能在很低浓度（数量级在ｐｐｍ范围）下十分有效地除去表面活性物质；设备简单；投资少；能耗小；操作方便；温度低，利于生物活性的保持。
第四章膜分离
膜分离存在的缺陷
浓差极化：
在分离操作中，所有溶质均被透过液传送到膜表面，不能完全透过膜的溶质受到膜的截留作用，在膜表面附近浓度升高，这种膜表面附近浓度高于主体浓度的现象称为浓度极化。
膜表面附近浓度升高，增加了膜两侧的渗透压差，使有效压差减小，透过通量降低。
耐药性、耐热性、耐溶剂有限，使应用范围受限制；
单采用膜分离技术效果有限，需要将膜分离工艺与其它分离技术组合；污染
膜的分类
按膜孔径大小分为：
微滤膜：
0.025~14m，超滤膜：
0.001~0.02m；反渗透膜：
0.0001～0.001m；
纳米过滤膜：
平均直径2nm。
按膜结构分为：
对称性膜，不对称膜、复合膜等。
按材料分为：
有机膜和无机膜等。
凝胶极化：
膜表面附近浓度超过溶质的溶解度时，溶质会析出，形成凝胶层。
在分离含有菌体、细胞或其它固形成分的料液时，也会在膜表面形成凝胶层。
凝胶层的形成对透过形成附加的传质阻力。
微滤和超滤
根据膜的微孔对不同大小和形状的杂质的截留作用而实现的,当待分离的溶液经过膜时，只有颗粒度小于孔径的物质才允许通过。
二者的差别在于孔径不同，需要的压力差不同。
微孔过滤的孔径大约在0.05~10μm之间，压力差大约是50~500KPa，超滤的孔径范围为0.001~0.2μm,压力差则需100~1000Kpa。
微滤技术是目前所有膜技术中应用最广、经济价值最大的技术。
主要用于悬浮物分离、制药行业的无菌过滤等。
超滤主要用于浓缩、分级、大分子溶液的净化等
渗透：
基于渗透压的作用而实现分离。
浓溶液比稀溶液具有较高的渗透压。
反渗透：
当在浓溶液一侧加一外界压力，且此压力大于浓溶液与稀溶液的渗透压之差时，溶剂就会向相反的方向转移，这一过程叫反渗透。
主要用于低分子量组分的浓缩、水溶液中溶解盐类的脱除等。
特点：
反渗透是把膜分离技术综合地应用到生物产品的浓缩和脱盐，
优点：
不需加热升温，不发生蒸发、汽化、无相变。
应用：
污水处理、海水淡化、纯水制造。
纳滤：
其截留分子量介于反渗透膜和超滤膜之间,约为200~2000，由此推测纳滤膜可能拥有1nm左右的微孔结构,故称之为“纳滤”。
膜组成：
大多数的纳滤膜是多层聚合物组成的复合型膜，表面分离层由聚电解质构成，通常带负电荷基团，对无机盐具有一定的截留率。
特性：
纳滤膜的孔径和表面荷电特征使其分离具有两个特性，即筛分效应和电荷效应。
纳滤膜对盐的截留性能主要是由膜的电荷效应决定的；纳滤膜对中性不带电荷的物质（如,乳糖、葡萄糖、麦芽糖）的截留则是由膜的筛分效应决定的。
特点：
集浓缩与脱盐为一体；由于在膜上或膜中常带有荷电基团,可实现不同价态离子的分离,故有时也称“选择性反渗透”；操作压力低，因为无机盐能通过纳滤膜而透析，使得纳滤的渗透压远比反渗透为低
纳滤技术的应用：
水处理；浓缩乳清及牛奶；调味液脱色；分离单糖、双糖；回收大豆低聚糖；浓缩果蔬汁；分离氨基酸；调节酿酒发酵液组分；脱除低聚木糖中的NaCl
电渗析利用分子的荷电性质和分子大小的差别进行分离的膜分离法，可用于小分子电解质（氨基酸、有机酸）的分离和溶液的脱盐。
电渗析多用于海水和苦水的淡化以及废水处理。
膜亲和过滤法
亲和膜分离技术：
制备带有亲和配基的分离膜，直接进行产物分离；
首先要在膜的某些官能团上联接一个“间隔臂”分子,合适的亲和配基与间隔臂分子以共价键结合,形成带有亲和配基的亲和膜。
当样品混合液缓慢地通过膜时,样品中欲分离的目标物与配基产生生物特异性结合,生成复合物而被保留,其它分子则随流动相被冲洗掉。
最后,改变流动相的组成,使被吸附的生物分子从配基上选择性地解吸出来从而被分离。
操作过程：
1、分离膜的改性2、亲和膜的制备3、亲和络合4、洗脱5、亲和膜再生
条件：
膜表面有足够数量的可利用化学基团，以便接着间隔臂和配基；
有足够高的表面积、足够大的孔径；
孔分布窄而均匀；
有一定机械强度；
耐酸、碱、高浓度的缓冲液和有机溶剂。
亲和-错流膜过滤：
将水溶性或非水溶性高分子亲和载体与产物进行特异反应，然后用膜进行错流过滤。
将亲和层析与超滤技术结合,高分子底物经专一可逆的亲和反应后,用膜进行错流过滤,兼有亲和层析和膜过滤的优点。
原理：
基质常是聚合物组成的内核；大分子的亲和配基连接在内核表面；配基对目标物专一可逆的吸附，形成复合体；用膜对混合液进行错流过滤，复合体因分子巨大可被保留，杂质则随液体透过膜；洗脱，分离得到产物。
基质：
多为亲水性聚合物：
聚丙烯酰胺等。
非水溶性基质：
如各种菌类的完整细胞（酵母、芽孢杆菌、链球菌等细胞）。
其它：
纳米硅石微粒、琼脂糖、凝胶、脂质体
所用的膜需具备如下条件：
对溶剂具有高渗透压;
分子截流范围窄;
具有相应的机械强度、化学及热稳定性;
抗污染能力强;
容易清洗和灭菌;
操作寿命长。
渗透蒸发特点：
渗透蒸发单级选择性式是其最大特点；
操作简单，易于掌握，有相变，能耗较高；
不需加压，膜不会压密，自动溶胀活性层，对膜寿命和通过率有利；
渗透蒸发通量较小，2000g/m2.h,高选择性的才100g/m2.h。
渗透蒸发膜分离应用：
从液体中脱除水分；从水中除去有机物；有机物与有机物的分离；气渗透：
混合料液是蒸气时，渗透蒸发即为蒸气渗透。
空气中回收有机物：
污染物处理。
（酒精浓缩、空气污染处理）
膜蒸馏：
膜分离与蒸发过程结合的分离过程，具有相变化，近年迅速发展。
原理：
利用疏水性微孔膜提供很大传质表面，实现水溶液气化和传质的分离过程。
传质推动力：
膜热水侧和冷水侧温度差，形成蒸汽差，形成传递组分的气相压差。
必需条件:
膜孔中仅有气体不能有液体，否则热冷贯通，无分离效果。
优点：
常压或稍微高于常温工作，可从分利用废热或低温余热；
设备要求低操作方便；
溶液浓度变化影响小；
制取纯水和溶液脱水浓缩的有前景的方法。
膜蒸馏的形式：
直接接触膜蒸馏：
水吸式或外冷式
气隙式膜蒸馏：
内冷式
低压膜蒸馏：
真空膜蒸馏
吹气膜蒸馏:
吹惰性气体，带走水气
膜蒸馏应用：
海水淡化；
超纯水制备（优点：
没有颗粒，病菌，用于制药）；
水溶液浓缩（温度低，利于保持活性）：
浓缩维生素浓、缩结晶回收牛磺酸；
含有挥发性物质水溶液处理：
3.6-7%乙醇溶液浓缩到75%
膜萃取技术：
利用微孔膜将有机相和水相分开，在微孔膜的油水接触面上进行萃取和反萃取。
避免了乳化液膜分离中制乳与破乳工序和支撑液膜引起的膜泄漏问题，是液膜萃取的替代技术。
基本原理：
液液萃取:
液相以细小液滴分散在另一相中，在两相接触面传质。
膜萃取萃取剂和料液在微孔膜两侧流动，传质过程在分隔两液相的微孔膜表面进行，没有相分散行为发生。
过程：
被萃取组分由水相主体到膜面；组分由膜面扩散到膜的另一面；目标组分由膜的另一面进入有机相主体。
膜萃取的优点：
避免液滴分散在另一相引起夹带现象和溶剂损失；
两相分开流动，互不影响，选择萃取剂主要考虑选择性和溶解性，使萃取剂
选择余地大。
普通萃取还要考虑粘度、密度、表面张力对两相接触与相对运
动的影响；
逆流萃取中避免一般萃取柱中严重影响传质效果的轴向返混现象。
膜萃取的形式：
采用疏水膜：
有机溶剂从膜的一侧浸透疏水膜的微孔，渗入到膜的另一侧，在该膜面实现传质。
采用亲水膜：
水相料液浸透亲水膜的微孔，并渗入膜另一侧，在该膜面传质。
膜阻及补救：
被萃取组分在有机相中溶解度较大，膜阻主要是水相阻力，采用疏水膜；
被萃取组分在有机相中溶解度较小，膜阻主要是有机相阻力，采用亲水膜；
采用中空纤维膜可使膜萃取有较大比表面积。
膜萃取应用：
膜萃取发酵（特点：
集成化技术）；膜萃取法提取锌。
（酒精连续发酵，分离）
膜分离技术特点：
高效的分离过程；低能耗；接近室温的工作温度；品质稳定性好；连续化操作；灵活性强；环保
第五章萃取
双水相萃取：
将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时,当聚合物浓度达到一定值,体系会自然地分成互不相溶的两相。
双水相体系的形成是两种天然或合成的亲水性聚合物水溶液相互混合,由于较强的斥力或空间位阻,相互之间无法渗透,在一定条件下,即可形成双水相体系。
亲水性聚合物水溶液和一些无机盐溶液相混时,也会形成双水相体系。
双水相萃取的原理：
与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同、当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水键、氢键和离子键等）的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。
｛主要:
静电作用和疏水作用}
双水相萃取的优点：
1）条件温和2）操作方便3）回收率高4）易于大规模生产
双水相在医药工业上应用的工艺流程主要由三部分构成:
①目的产物的萃取；②PEG的循环；③无机盐的循环
双水相萃取技术的应用：
1、酶的提取和纯化2、核酸的分离和纯化3、人生长激素的提取
4、干扰素的提取5、病毒的分离纯化
反胶团萃取：
实质：
液—液有机溶剂萃取。
不同之处在于生物分子存在于反胶团的亲水微环境中，防止生物分子，特别是蛋白质等生物活性物质在有机相中的沉淀以及变性
表面活性剂：
是指能显著降低水的表面张力的一类物质。
表面活性剂从结构上看均为两亲分子，即同时具有亲水的极性基团和憎水的非极性基团。
胶束：
两亲分子溶解在水中达一定浓度时，其非极性部分会互相吸引，从而使得分子自发形成有序的聚集体，使憎水基向里、亲水基向外，减小了憎水基与水分子的接触，使体系能量下降，这种多分子有序聚集体称为胶束。
表面活性剂在溶液中开始形成胶束的最低浓度称为临界胶束浓度（CMC），在CMC附近，表面活性剂溶液的许多性质都会出现转折，如表面张力、电导率、去污能力等。
反胶团：
表面活性剂溶于有机溶剂,当浓度大于临界胶团浓度时,会在有机相中形成聚集体,称为反胶束。
反胶束萃取原理：
反胶束中极性头朝内,非极性尾朝外排列形成亲水内核,称为“水池”。
萃取时，待萃取的原料液以水相形式与反胶束体系接触,调节各种参数，使其中要提取的物质以最大限度转入反胶束体系（前萃取）,后将含该物质的前萃液与另外一个水相接触。
再次调节ｐＨ、离子强度等参数分出要提取物质。
优点：
成本低、溶剂可循环利用、萃取和反萃取率高。
影响反胶团萃取溶解作用的因素：
1）静电相互作用
在pI附近,由于蛋白质不带电荷,不易溶解;蛋白质与表面活性剂带电荷相反时,易溶于反胶团.
2）空间相互作用
①盐浓度增加,反胶团直径减小,空间排阻增加;
②pI附近,随着蛋白质分子量增加,排阻增加;均导致溶解性降低.
3）疏水作用
蛋白质的疏水性影响其在反胶团中的溶解形式,从而影响其分配系数。
反胶团萃取蛋白质的过程：
1,通过表面液膜扩散进入相界面2,在界面出进入反胶团3,含溶质反胶团进入有机相。
反胶团萃取操作：
液液接触法；注射法；溶解法（蛋白质粉末）适合非水溶性蛋白。
反胶团萃取的应用：
酶学研究：
酶活性的研究、酶的提取与分离纯化；
蛋白质的萃取：
蛋白质的分离提纯、肽和氨基酸的合成；
油脂的水解和合成脂肪酶催化；
从油料作物中同时分离油和蛋白质；
有毒物质的降解
CO2超临界萃取
超临界流体（Supercriticalfluid，SCF）技术中的SCF是指温度和压力均高于临界点的流体,如二氧化碳、氨、乙烯、丙烷、丙烯、水等。
高于临界温度和临界压力而接近临界点的状态称为超临界状态。
处于超临界状态时，气液两相性质非常相近，以至无法分别，所以称之为SCF。
超临界流体萃取分离原理：
是利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。
当气体处于超临界状态时，成为性质介于液体和气体之间的单一相态，具有和液体相近的密度，粘度虽高于气体但明显低于液体,，扩散系数为液体的10～100倍；因此对物料有较好的渗透性和较强的溶解能力，能够将物料中某些成分提取出来。
超临界流体萃取分离过程：
在超临界状态下，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地依次把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分萃取出来。
并且超临界流体的密度和介电常数随着密闭体系压力的增加而增加,极性增大,利用程序升压可将不同极性的成分进行分步提取。
当然，对应各压力范围所得到的萃取物不可能是单一的，但可以通过控制条件得到最佳比例的混合成分，然后借助减压、升温的方法使超临界流体变成普通气体，被萃取物质则自动完全或基本析出，从而达到分离提纯的目的，并将萃取分离两过程合为一体。
超临界CO2的溶解能力：
1．亲脂性、低沸点成分可在低压萃取（104Pa）,如挥发油、烃、酯等。
2．化合物的极性基团越多，就越难萃取。
3．化合物的分子量越高，越难萃取。
超临界CO2的特点：
1.CO2临界温度为31.1℃，临界压力为7.2MPa，临界条件容易达到。
（水：
374.2℃,22.7MPa）
2．CO2化学性质不活波，无色无味无毒，安全性好。
3．价格便宜，纯度高，容易获得。
因此，CO2特别适合天然产物有效成分的提取。
超临界流体萃取的特点：
1．萃取和分离合二为一：
当饱含溶解物的二氧化碳超临界流体流经分离器时，由于压力下降使得CO2与萃取物迅速成为两相（气液分离）而立即分开，不存在物料的相变过程，不需回收溶剂,操作方便；不仅萃取效率高，而且能耗较少，节约成本。
2．压力和温度都可以成为调节萃取过程的参数。
临界点附近，温度压力的微小变化，都会引起CO2密度显著变化，从而引起待萃物的溶解度发生变化，可通过控制温度或压力的方法达到萃取目的。
压力固定，改变温度可将物质分离；反之温度固定，降低压力使萃取物分离；因此工艺流程短、耗时少。
对环境无污染，萃取流体可循环使用，真正实现生产过程绿色化。
3．萃取温度低,CO2的临界温度为31.265℃,临界压力为7.18MPa,可以有效地防止热敏性成分的氧化和逸散，完整保留生物活性，而且能把高沸点，低挥发渡、易热解的物质在其沸点温度以下萃取出来。
4.安全无污染：
超临界CO2流体常态下是气体,无毒,与萃取成分分离后,完全没有溶剂的残留,有效地避免了传统提取条件下溶剂毒性的残留。
同时也防止了提取过程对人体的毒害和
对环境的污染,100%的纯天然。
5．应用范围广：
超临界流体的极性可以改变,一定温度条件下,只要改变压力或加入适宜的夹带剂即可提取不同极性的物质,可选择范围广。
超临界流体萃取技术的应用：
（1）超临界流体技术在国内天然药物研制中的应用
（2）超临界CO2萃取技术在中药开发方面的优点
（3）超临界流体技术在其他方面的应用
凝胶萃取
凝胶分类：
疏水有机凝胶,；亲水有机凝胶；非溶胀性无机凝胶
亲水凝胶特点：
胀缩特性：
具有胶联网络结构,吸收10-100倍于干胶重量的水分而溶胀。
形
成多孔性结构。
相变特性：
一定条件下,凝胶突然收缩释放出所吸收的水和溶剂，体积发生
急剧变化。
酸敏凝胶萃取循环步骤：
萃取分离用凝胶的要求：
溶胀量大，再生容易；
溶胀，收缩过程快，与溶液分离容易；
对溶质的吸收选择性高；
强度好，使用寿命长；
不溶解，不熔融，不污染溶液。
优点：
能耗小；再生容易；设备，操作简单；对物料不存在机械剪切；热力破坏，酸硷破坏。
应用：
稀溶液中提取大分子有机物；淀粉脱水；抗生素提取；蛋白质提取/浓缩
升级会员 