ACC脱氨酶基因的检测和有ACC脱氨酶细菌的应用研究可编辑.docx
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ACC脱氨酶基因的检测和有ACC脱氨酶细菌的应用研究可编辑
ACC脱氨酶基因的检测和有ACC脱氨酶细菌的应用研究（可编辑）
ACC脱氨酶基因的检测和有ACC脱氨酶细菌的应用研究
洳专:
、
硕士学位论文
指导教师
塞土里亘熬拯
’,独创性声明
本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的
研究成果。
据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其
他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得浙婆太堂或其他教育机
构的学位或证书而使用过的材料。
与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献
均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。
日
学位论文作者签名:
签字目期:
年月
学位论文版权使用授权书
本学位论文作者完全了解有关保留、使用学位论文的规定,
浙江太堂
有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和
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导师签名:
学位论文作者
签字日期:
?
乃年厂月巧日
签字日期:
易
学位论文作者毕业后去向:
电话:
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通讯地址:
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致谢
这篇论文是在导师安千里副教授的悉心指导和热情关怀下完成的。
回顾攻读
硕士学位的这三年的时间,安老师对我的学和生活给予了极大的关怀和帮助。
他为我的研究工作创造了良好的条件,从论文的选题、实验设计、实验进展、开
题报告、读书报告到论文的撰写与修改,无不凝聚了安老师辛勤
的汗水和心血。
安老师为人平易近人,豁达开朗,治学严谨,具有高尚的人格情操。
对待学术工
作更是兢兢业业,一点业不马虎。
这种精神使我终生受益,时刻鞭策和激励着我。
在这三年的时间当中,我的各方面能力都得到了提高。
我相信安老师对我的积极
影响将会一直陪伴着我。
值此论文完成之际,谨向我的导师安千里表示由衷的敬
意和谢意
同时,我还要感谢生物所的各位老师的教导和帮助,尤其是梁五生副教授和
毛碧增副教授。
感谢我的德育导师谢艳老师和刘小红老师,你们在我攻读学位期
间对我提供了诸多帮助和关照,是我顺利完成学业的坚强后盾。
在这三年中,我要感谢在实验室与我一起度过的师兄、师姐、师弟、师妹们,
感谢师兄师姐的悉心指导和帮助。
我要特别感谢师兄李郑义和张新成,师姐林丽,
师妹叶舒婷和陈明月同学,你们在我的实验过程中给予的诸多的帮助,使得我能
够顺利完成学业。
感谢生物所与我朝夕相处的徐婷师姐、姚飞、
王亚婷、王伟、
金菊、陆广欣、陈丽闽、尚卫娜、侯虎威、任鹤、董静云等人,是你们在我需要
帮助的时候伸出援手,也是你们的关怀和帮助使我在这三年的研究生生活中感到
舒心和愉悦。
感谢武汉凯迪工程技术研究总院的李万里等老师帮助做根瘤菌接种刺槐苗
实验。
感谢我的室友唐乔梅,陈炜,张薇,徐佰鸽、袁慧丽,与你们在一起生活
的日子里总是充满了欢声笑语。
三年的时间一晃而过,即将毕业,很是不舍,
希望大家能够找到满意的工作。
最后,向一直以来给予我无限关爱和支持的父
母表示最衷心的感激和祝福向所有我尚未提及的朋友说一声感谢,谢谢你们
常四平
年月于杭州?
浙大紫金港目录
摘要?
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本论文中所用术语缩写与中英文对照?
?
一
.第一章有脱氨酶细菌与脱氨酶及其基因综述..
脱氨酶?
..脱氨酶基因的表达调控
..脱氨酶基因水平转移?
..有脱氨酶的细菌与植物的互作?
?
一.
第二章印度梨形孢的功能及其作用机制...印度梨形孢的功能一
..
印度梨形孢促植物生长和抗逆的机制?
一..
印度梨形孢在根部的定殖模式及寄主的防御反应?
?
一
..
和印度梨形孢与植物促生细菌的互作.第三章脱氨酶结构基因的检测?
..研究背景和目的?
..
..
材料和方法一
...
材料?
一
...
引物的设计一
...
引物特异性分析?
?
....一及克隆测序.....
系统发育分析~
..
结果与讨论?
...引物的特异性....
水平转移一
.
第四章筛选有脱氨酶的根瘤菌?
..
研究背景和目的?
一
..
材料和方法..
....,及克隆测序...茚三酮.比色法检测根瘤菌消耗?
一
..
.二硝基苯肼比色法检测根瘤菌的脱氨酶活性...
系统发育分析一
.,结果和讨论?
?
.
...
建立用?
快速筛选高效结瘤根瘤菌的方法....
有脱氨酶根瘤菌接种刺槐苗的效应?
一...
有脱氨酶刺槐根瘤菌的多样性分析?
一.
第五章有脱氨酶细菌接糟水稻的效应及致病性捡测?
..
研究背景和目的?
一
..
材料和方法..
...材料...细菌培养?
?
.....接种水稻?
?
..
....接种烟草叶片..
...
接种洋葱鳞茎,金桔和杏的果实?
....结果和讨论..
.
第六章有脱氨酶的细菌
.防治油菜茵核病的研究?
?
一
..研究目的和意义?
....
材料和方法一
...
材料?
一
...细菌培养?
?
.....
真菌培养?
?
一
...
.促生效应检测?
...
.防治油菜菌核病的检测..
结果和讨论一
...
在限菌培养下接种
.能促进油菜根的伸长?
。
...
.可能防治油菜菌核病?
.第七章印度梨形孢促植物抗逆与脱氨酶的关系
..
研究背景和目的?
一
..
材料和方法一...
材料.。
.
细菌培养?
?
一
...
真菌培养?
?
一
...印度梨形孢基因组的提取?
?
....
印度梨形孢脱氨酶活性的检测一
...
限菌培养下印度梨形孢促生效应的检测?
一...接种核盘菌条件下印度梨形孢效应的检测一.
结果和讨论一
...
印度梨形孢没有,不能消耗?
?
一
...
印度梨形孢能促进油菜的生长但不能防治油菜菌核病?
一
...
印度梨形孢可能与.联合防治油菜菌核病?
..参考文献?
?
.
附录..
附录主要耗材与仪器?
附录本研究所用试剂?
攻读硕士学位期间的研究成果?
?
.摘要
有.氨基环丙烷..羧酸脱氨酶的细菌能通过催化降解植物合成乙
烯前体而降低植物在逆境下产生胁迫乙烯的水平,从而缓解植物在逆境下
遭受的生长抑制。
有脱氨酶细菌的促植物生长特性在农林业和环保上有广
泛的应用前景。
建立高效的筛选有脱氨酶细菌的方法对其应用有重要意义。
本实验室之前建立了用茚三酮比色法检测细菌消耗和用广谱特异的
共有序列.简并杂合寡核苷酸引物扩增脱氨酶结构基因
的方法,并筛选出一批有脱氨酶的细菌。
本研究进一步完善了用
引物扩增的方法,筛选出了有脱氨酶的高效结瘤的刺槐根瘤菌,发现
了有脱氨酶细菌的致病性,检测了促植物生长内生真菌印度梨形孢
有无脱氨酶,并尝试利用有脱氨酶的细菌和
印度梨形孢协同防治油菜菌核病。
本研究基于脱氨酶的保守区设计了新引物,
与引物一起扩增的片段涵盖了脱氨酶的保守区,
有利于鉴定的真伪。
用/引物扩增测序从水稻根中
分离筛选到的有脱氨酶细菌的,发现在水稻根部定殖细菌没有发生
的属间水平转移,但和属的细菌在进化中可能
通过水平转移获得。
乙烯能够抑制根瘤菌在豆科植物根部的侵染和结瘤,有脱氨酶活性的
根瘤菌能够通过降解降低乙烯的水平而具有强的侵染和结瘤能力。
本研究
利用/和/引物从中国农业大学
提供的菌种库个刺槐根瘤菌中筛选出个有的菌株。
分析它
们的序列发现了在系统发育上不同于其他来源刺槐根瘤菌的新颖菌株。
对它们的和序列的系统发育进行比较发现个菌株有可能通过
水平转移获得了。
本研究又从湖北武汉刺槐根瘤中分离到的个分离物中
发现一个菌株.有,而茚三酮比色法没有检测到它在自由培养状态能消耗
。
用该菌株接种刺槐后,刺槐苗根部的根瘤数量明显比对照组高,长势更好,
叶色更绿。
这表明法是快速筛选高效结瘤根瘤菌的有效方法。
本研究试图从以前获得的有脱氨酶的细菌中筛选能促进水稻生长的菌
株,但发现部分伯克氏菌和草螺菌能致病或抑制水稻生长。
接神烟草叶片、洋葱
鳞茎、杏和金橘果实的结果也证实了这些菌株的致病性。
这些结果提醒我们在应
用有脱氨酶细菌前要严格检测其致病性。
通过和茚三酮比色法检测发现能在逆境下促进植物生长的印度梨
形孢没有脱氨酶,印度梨形孢帮助植物抗逆的机制与脱氨酶无关。
有脱氨酶细菌
.和印度梨形孢不拮抗核盘菌
通过接种油菜发现
.能促进油菜
幼苗的生长,可能防治油菜菌核病。
印度梨形孢不能防治油菜菌核病,但可能与
.一起防治油菜菌核病。
关键词:
一氨基环丙烷一.羧酸,胁迫乙烯,脱氨酶,根瘤茵,细菌致病性,
印度梨形孢,油菜菌核病一一
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本论文中所用术语缩写与中英文对照.第一章有脱氨酶细菌与脱
氨酶及其基因综述
..脱氨酶
氨基环丙烷一羧酸脱氨酶广泛
存在于多种细菌和真菌中等,,如伉.变形菌纲中的根瘤菌等,,中华根瘤菌
等,,中慢生根瘤菌等,
等;‖.变形菌纲中的伯克氏菌.等,,贪噬菌等,,草螺菌括等,;,。
变形菌纲中的假单胞菌
等,,克雷伯氏菌等,;
真菌中的酵母等,、青霉菌等,
和木霉菌等,。
脱氨酶属于’.磷酸吡哆醛依赖酶色氨酸合酶‖亚基家族的一员。
依赖酶是一类在生物体内以为辅基,氨基酸为底物,催化诸如
氨
基转移,脱羧基,卢、,替换/消除以及外消旋等反应的酶等,。
脱氨酶和.半胱氨酸脱巯基酶都属于依赖酶家族。
已有的数据显
示,
脱氨酶结构基因与.半胱氨酸脱巯基酶基因,脱氨
酶和.半胱氨酸脱巯基酶具有较高的同源性,这给脱氨酶的研究鉴定工作
带来了一些困难。
等就曾将基因误认为是基因。
事实上,
除了.半胱氨酸脱巯基酶之外,还有一些其他脱氨酶同源蛋白也可能会被
一度被认为有
研究者错认为是脱氨酶。
热球菌
脱氨酶,直到等撰文指出该菌并不具有脱氨酶活性,而
仅具有一个和脱氨酶序列有较高相似度的同源蛋白。
已有研究表明
脱氨酶与其他同源蛋白的氨基酸序列保守区和酶活性关键位点在第,简
写,,,,和,位上以
的脱氨酶氨基酸序列计数的氨基酸残基是相同的,但在第位和
位上的氨基酸残基是不同的;脱氨酶在第位和位上的氨基酸残。
基是和,而其他同源蛋白往往是或图
这两个氨基酸残基决定了酶的催化特性,任何同时在这两个位点缺失谷氨酸和亮
氨酸的酶将不具有脱氨酶活性和,。
脱氨酶中
的被认为是与吡啶环上的原子形成氢键,对脱氨酶的活性
所必须的,将脱氨酶点突变为其他氨基酸后,酶则完全或几乎完
全
失去脱氨酶活性等,;等,;和.。
而则在稳定辅酶和结合位点时发挥重要作用,也为长链位点提供了存在的空间,将脱氨酶点突变为其他氨基酸后,酶则完全失去脱氨酶活性等,;等,;等,
。
而且,.半胱氨酸脱巯基酶在第位和位上对应位点的氨基酸残
基突变为和后,获得了脱氨酶活性和,。
””譬:
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圈.多种有脱氨酶活性微生物的假定的脱氨酶,.
的脱氧酶与和
和
的阻半胱氨酸脱豌基酶的氨基酸序列联配图。
氯基酸序列在中的登
录号在括号中列出。
用,程序以默认参数运行序列联配。
脱氨
酶的第和氨基酸残基以尸的计数是和;.半胱氨
酸脱疏基酶相应位点是或。
这两个位点的氨基酸残基是区分脱氧酶与
一半胱氧酸脱巯基酶的关键,以阴影标记
,,,未
发表结果。
..脱氨酶基因的表达调控
编码脱氨酶的是脱氨酶结构基因。
和
对现已被改名为的
的上游序列进行了分析,发现在的上游有一段序列参与的表达调控
和,。
这段序列包括一个类亮氨酸响应调节蛋白编码区,
它编码的蛋白与
编码的亮氨酸响应调节蛋白高
度相似,被命名为,编码的基因是。
在和之间还有一个约
大小的基因片段,包括一个结合位点,一个延胡索酸盐.硝酸盐还原
反应调节蛋白结合位点,还有二分之一个受体蛋白结合
位点。
在这个调节区域存在三个启动子。
最强的启动子控制的转录,另两
个控制的转录,的转录方向与的相反。
这段序列对于的表
达是必须的,如当用基因替代,有上游的序列存在时,
蛋白才能呈现最大的活性和,。
通过酵母双杂交和共免疫沉淀
技术,证明与调控区结合蛋白共同调节的表达
等,。
当在无氧的条件下,脱氨酶活性表达更高,说明在
的表达中起调控作用。
往培养基中加入亮氨酸,脱氨酶活性明显下降,说
.
明亮氨酸在表达中起负调控作用。
的类的插入突变体不能合成脱氨酶,这也说明亮氨酸抑制的表达。
而在培养基中加入则能诱导的表达。
对于根瘤菌,的表达调控
更复杂一些。
一般情况下,有脱氨酶的细菌在自由生长的状态下就可表达脱氨酶,而菌株的表达却只能在根瘤
中检测到,表明的表达还受其他因子调节。
在中存在
两个/基因固氮正调节基因』和,用定量检测发现
缺失将会导致的表达量大大减少,并且结瘤率也降低。
因此根瘤菌中
的调控很可能需要刀溯的参与等,。
对中包括全
长的序列进行分析发现其附近都有。
.等将细菌的和在基因组中的分布作了细致的描述,见图.。
最近,等对个已获得基因组全序列的细菌的调控序列进行分析发现大多数的细菌包括许多的假单胞菌的基因附
近并没有
口调控序列。
但是,这个结论是错误的,因为它们认为是基因的多
数序
列其实并不是真正的序列,而是它的同源序列。
从图.中可以看
出,
总是和其调控序列在一起。
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、二二己二:
“互殛整互二正二
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图.和在细苗基因组中的分布情况?
等,。
..脱氨酶基因水平转移
有些研究的系统发育分析显示部分伊和.变形菌纲中细菌的基因
与垂
直进化的在系统发育树上的分布不一致,认为基因发生了水平转移等,;等,;等,。
但是,大部分系统
发育不一致的现象是不可靠的。
首先,
.
菌株中被认为
“
.和
是部分的序列其实是的同源序列。
第二,
的序列与菌株的聚集在一起等,;等,;但后来.等发现菌株的是
与
伯克氏菌的聚集在一起的,见图.。
第三,
.的与伯
克氏菌的聚集在一起,图.;等,;等,,但是可
能不是假单胞菌,因为它的分类地位是基于有限的表型分析确定
的和
。
第四,的与
的聚集在一起图.;等,;
包括
等,。
等通过检测脂肪酸将菌株与归属于
。
但是,等最初根据这两个菌株在选择培养基
上的生长和荧光嗜铁素的分泌状况把它们归属为假单胞菌。
最近,根据菌株
的部分
序列,它又重新被归属为假单胞菌等,。
菌
株能产生抗生素,.二乙酰基间苯三酚和等,,这
是具有生防作用的荧光假单胞菌的一个普遍特征和,。
可能菌
株也属于假单胞菌。
总的来说,以前关于伊和一变形菌纲细菌的基
因发生了广泛的水平转移的结论是由对同源序列的错误认识和有脱氨
酶细菌不可靠的分类地位得出的。
本实验室对从数据库中检索到的真序列和相应菌株的
序列进行系统发育分析的结果并不支持伊和,.变形菌纲细菌的发生了
广泛的水平转移,,,,未发表的结果。
首先,伊或,.变形菌的与其对应的在系统发育树中的分布基本
一致;
明显不一致的也只是少数菌株,见图.和图.。
在的系统发育树中图
.,
和
和
明显与其他的伊变形菌分离;明显
与其他】,.变形菌分离。
还不清楚它们通过水平转移获得的供体是哪些菌。
一与
处于同一个分支上,表明从
转移到了。
第二,
等,,.,
菌株的存在质粒上,
.和一些
但与其的系统发育没有明显的不一致图.,没有发生过水平转移。
系统发育分析还表明仅.变形菌纲细菌的很可能发生了广泛的水平转移。
日系统发育树图.和与其他菌株分离等,;明显与和分离。
与或分离:
和与接近;与.接近。
.变形菌纲中的常常定位在质粒和
基因岛等可移动遗传元件内,这就为基因的水平转移创造了便利条件等,;?
等,。
图.用真序列和编码序列,假定的和序列构建的系统发育树。
没有标记的是真序列.标记的是和的真?
表示七个细菌全基因组中找到的假定的序列,表示七个细菌全基因组中找到的假定的序列?
表示等中使用的假定的序列.?
表示等中使用的假定的序列,?
表示等中使用的假定的序列。
这些序列在中的登录号在括号中列出。
用.程序的模型构建最大似然树。
分支节点数值是用类法和等测试计算,没有显示小于的节点数值。
左下方的标尺表示每个位点有.个核苷酸的替代。
,,,未发表的结果固.用中检索到的变形茵的真构建的系统发育树。
这些基因或细菌全基因组序列在中的登录号在括号中列出。
星号表示同一个细菌的和的进化不一致。
登录号后面的?
表示序列在可移动遗传元件上硐.程序的模型构建最大似然树。
分支节点数值是用粪法
和等,测试计算,没有显示小于的节点数值。
左下方的
标尺表示每个位点有.个核苷酸的替代。
截掉的区域表示分支的长度是个核苷酸的替
代。
,,,耒发表的结果
圈.用从中筛选的变形菌的构建系统发育树。
这些或细菌全基因组序列在中的登录号在括号中列出。
星号木表不司一个细菌的和
的进化不一致。
登录号后面的?
表示序列存在移动遗传元件上。
用.
程序的模型构建最大似然树。
分支节点数值是用类法
和等,测试计算,没有显示小于的节点数值。
左下方的
标尺表示每个位点有.个核苷酸的替代。
,,
未发表的结果
..有脱氨酶的细菌与植物的互作
植物因定植在土壤等介质中,当面临各种各样的非生物胁迫如干旱、高盐、
高浓度重金属、高温等和病虫害等生物胁迫时无法逃离,产生了多种抵抗胁迫
的机制。
植物除了用自身的物理特性阻挡病原物外,可以通过协调自身的生理机
能和代谢机能如产生水杨酸、茉莉酸和乙烯等信号分子诱导防卫反应,产生植保
素和降解真菌细胞壁的水解酶攻击病原微生物之外,还可以通过某些土壤中生活
的微生物来抵抗全部或部分环境的胁迫。
这些微生物能够帮助植物更好的吸收营
养元素如、、等,或者是抑制病原真菌的繁殖,还有的细菌能够直接分泌
生长素等激素促进植物的生长。
已有大量的研究发现有脱氨酶的细菌能够帮助植物抗逆,促进植物在
逆境下生长等,;和,;等,;
等,;等,;等,;等,;
等,;等,;等,。
这其中又以脱氨酶
细菌帮助植物抗重金属毒害和盐胁迫的研究最多等,;等,
和;等;等;和,,
也有少量的研究发现有脱氨酶的细菌能够减轻植物病害等,
;许煜泉等,。
如等用有脱氨酶活性的甲
基杆菌和致病菌
.共同接种番茄,结果显示与只接种
.相比,接种的植株中病程相关蛋白显著增加,并伴
随着乙烯水平的降低,病症显著减轻。
有脱氨酶细菌帮助植物抗逆的特性与它们能降低植物在逆境下产生乙
烯的水平有关。
植物合成乙烯的前体是.氨基环丙烷一.羧酸。
而
脱氨酶能够催化的脱氨基反应,将降解为.酮丁酸和氨,
作为细菌可利用的碳氮源。
非生物和生物胁迫往往会刺激植物产生两个时相的乙烯迸发,第一个乙烯迸
发在胁迫发生几个小时后,产生的量小,消耗的是植物组织储备的,持续
的时间短,乙烯作为信号分子诱导植物的防御反应。
第二个乙烯迸发在胁迫发生
的一到三天后,产生的量大,需要的重新合成,持续的时间长,会抑制植
物生长:
促进植物衰老和器官脱落等,。
那有脱氨酶的细
菌是如何不影响乙烯所诱导的植物对胁迫的防御反应而只消减乙烯抑制植物生
长的作用的呢细菌中脱氨酶的水平在有诱导后才会提高,诱导产
生的速率比植物细胞诱导产生氧化酶的速率低,而且脱氨酶对
的亲和性比氧化酶低得多。
在植物细胞动用储备的产生乙烯时,细菌
可吸收的被植物细胞分泌到胞外的很少,通过脱氨酶消耗的就
很少,不会影响植物细胞产生少量乙烯而诱导植物的防御反应。
当胁迫持续,植
物细胞重新合成大量,会分泌出部分被细菌吸收而诱导细菌产生高水
平的脱氨酶降解;由于细菌不断地吸收消耗,产生了从植
物细胞到细菌细胞,相当于“源”到“库”的流动,使得供植物细胞合成乙烯的
减少而降低植物产生乙烯的水平,从而缓解了胁迫对植物生长的抑制等,
。
根瘤菌与豆科植物形成的共生固氮体系,通过固氮酶将大气中的氮气转化为
可供植物吸收利用的氮素。
根瘤菌若能高效结瘤和固氮,一方面侵染力要强,能
够躲避或压制植物把根瘤菌作为外来入侵物而产生的防卫反应,另一方面要适应
植物的生存环境,能耐受于旱、高盐、偏酸碱或高低温等逆境或称非生物胁迫。
早在世纪年代就有研究表明,豆科植物结瘤的过程中能产生乙烯,而乙烯
能够抑制多种根瘤菌侵染豆科植物并减少豆科植物的结瘤数等,
;和,;和,;等,;等,
;等,。
而乙烯水平的降低则能够促进其结瘤。
根瘤菌降低乙
烯水平的途径有两条,一是通过分泌根瘤菌毒素抑制植物合成,二是
脱氨酶催化降解等,。
有研究发现有些根瘤菌有脱氨
酶,它们的脱氨酶结构基因在根瘤中的表达量很高,如果把根瘤
菌的敲除,根瘤菌的结瘤能力会显著降低等,;;相反,
如果向原本没有脱氨酶的根瘤菌导入,那根瘤菌工程菌的结瘤率、占
瘤率和固氮效率显著高于野生型菌株等,;等,;
等,。
有脱氨酶能高效结瘤的根瘤菌在与豆科作物、牧草和树种相关
的农林牧业上有广阔的应用前景。
农杆菌是存在于土壤中的一种革兰氏阴性菌,它能在自然条件下趋化性地
感染大多数双孑叶植物的受伤部位,并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
根癌农杆
菌和发根农杆菌细胞中分别含有质粒和硝质粒,其上有一段,农杆菌
通过侵染伤口进入植物细胞,将插入到寄主植物基因组中,。
将目的基因插入到经过改造的区,借助农杆菌的感染可实现外源基因向
植物细胞的转移与整合等,。
在农杆菌介导的转化过程中,
基因表达蛋白使农杆菌识别寄主,从而将区域转移到植物基因组上,缺
失该基因的农杆菌不能介导基因的转化。
在农杆菌侵染植物过程中,植物产生乙
烯抵御农杆菌的侵染,抑制农杆菌所基因的表达,从而降低农杆菌的转化效率
等,;等,
升级会员 