消毒液消毒效力及有效期验证.docx
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消毒液消毒效力及有效期验证
1目的
本文件用于验证洁净区按照规定的消毒程序消毒能够达到消毒、防止污染的目的，在消毒有效期内能确保其消毒效力符合要求。
2背景
公司拟定用75%乙醇和0.1%新洁尔灭对洁净区进行清洁消毒，两种消毒液每周进行更换，防止耐药菌株的产生，用0.5%84消毒液进行洁净服的消毒，本验证是为了确定消毒剂的消毒效果所作的验证，以确认该消毒剂是否能满足需要。
3范围
本验证用于验证消毒剂消毒效力的测试。
4参考文件
《消毒液配制使用管理程序（SOP-030）》、《检定菌管理程序（SOP-022）》
5术语和定义
N/A
6职责
质量法规部负责本验证方案的制定，验证的执行和完成验证报告；
微生物组负责验证中相关的测试；
生产技术部和质量法规部负责本方案和报告的审核；
7材料和设备
7.1材料
表1材料清单
序号
材料名称
备注
1
金黄色葡萄球菌
――
2
大肠埃希菌
――
3
枯草芽孢杆菌
――
4
白色念珠菌
――
7.2设备
表2设备清单
序号
设备名称
设备型号
设备编号
1
生化培养箱
SHP-080
2
霉菌培养箱
MJP-150
8验证程序
8.1为了确认消毒剂的消毒效力，通过定量悬浮试验法和表面实验法进行验证试验。
1）中和剂的选择：
通过该试验，确认所用的中和剂对对应的消毒剂有良好的中和作用，对试验用菌及其恢复期培养是否有害或不良影响。
菌种：
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌。
消毒剂的配制浓度：
乙醇溶液配制成75%的浓度、新洁尔灭配制成0.1%的浓度、84消毒液配制成0.5%的浓度。
中和剂的选择：
乙醇采用3%吐温80为中和剂，新洁尔灭1%的卵磷脂+0.1%吐温80为中和剂，84消毒液采用1.5%硫代硫酸钠为中和剂。
3%吐温80配制方法：
取吐温803.0ml，加纯化水至100ml，121℃高压灭菌15分钟，即可。
1%的卵磷脂+0.1%吐温80配制方法：
卵磷脂1g，吐温800.1ml加蒸馏水至100ml，121℃高压灭菌15分钟，即可。
1.5%硫代硫酸钠配制方法：
取硫代硫酸钠1.5g，加纯化水稀释至100ml，121℃高压灭菌15分钟，即可。
进行中和剂选择试验时需设置平行6组实验：
第一组消毒剂+菌悬液；第二组（消毒剂+菌悬液）+中和剂；第三组中和剂+菌悬液；第四组（消毒剂+中和剂）+菌悬液；第五组0.9%氯化钠溶液+菌悬液；第六组稀释液+中和剂。
●第1组
目的：
观察消毒液对试验菌有无杀灭或抑制能力。
操作方法：
吸取消毒剂4.5ml于试管内，吸加0.5ml菌悬液（含菌量为1×108cfu/ml～5×108cfu/ml），混匀。
作用10分钟，吸此样液0.5ml至含有4.5ml稀释液试管中混匀。
吸取该最终样液0.5ml，接种于平皿中，做活菌培养计数。
金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌用TSA培养基；白色念珠菌用SDA培养基。
●第2组
目的：
观察残留消毒剂被中和后受到消毒剂作用后的试验菌是否恢复生长。
操作方法：
吸取消毒剂4.5ml于试管中，加0.5ml菌悬液，混匀，作用10分钟，吸此样液0.5ml，加于含4.5ml中和剂溶液管中，作用10分钟，吸此样液0.5ml至含有4.5ml稀释液试管中混匀，吸取该最终样液0.5ml，接种于平皿中，做活菌培养计数。
●第3组
目的：
观察中和剂是否有抑菌性。
操作方法：
吸取中和剂4.5ml于试管内，再吸加0.5ml菌悬液，混匀，作用10分钟，吸取该最终样液0.5ml，用稀释液做10倍系列稀释至10-3，取相应稀释级各0.5ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
●第4组
目的：
观察中和产物，或未被完全中和残留消毒剂对试验菌的生长繁殖是否有影响。
操作方法：
吸取中和产物溶液（以1份消毒剂加9份中和剂，作用10分钟配制而成）4.5ml于试管内，再吸加0.5ml菌悬液，混匀，作用10分钟，吸取该最终样液0.5ml，用中和产物溶液做10倍系列稀释，稀释至10-3，取相应稀释级各0.5ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
●第5组
目的：
作菌落数对照用。
操作方法：
吸取稀释液4.5ml于试管内，再吸加0.5ml菌悬液，混匀，作用10分钟，吸取该最终样液0.5ml，用稀释液做10倍系列稀释至10-3，取相应稀释级各0.5ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
●第6组
目的：
作为阴性对照用。
操作方法：
分别吸取稀释液与中和剂各0.5ml于同一无菌小平皿内，倒入上述试验同批次的培养基15ml～20ml，培养观察。
如出现细菌生长，可能提示试验材料或操作过程中有污染，应重新进行试验。
样品培养：
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌于30～35℃培养3天，白色念珠菌于20～25℃培养5天，培养结束后点计菌落数。
结果判定：
第6组无菌生长
第3、4、5组有相似菌落数生长，其每组间菌落数误差率不超过15%，计算公式如下：
第1组无菌生长或仅有少数试验菌菌落生长
第2组菌落数比第1组菌落数多，但比第3、4、5组菌落数少，且符合下表要求
表3
第1组平板平均菌落数
第1组平板平均菌落数
0
＞5
x
＞（X+5）
y
＞（y+0.5y）
以上条件均符合要求时，判断所选中和剂及其浓度合格。
2）定量悬浮试验
试验目的：
通过浸泡或液封消毒的消毒剂应通过定量悬浮试验，确定其消毒效力是否符合要求。
操作：
将含菌量为1×108~5×108cfu/ml的菌悬液0.5ml加入到10ml的消毒剂溶液中，作用5分钟、10分钟、15分钟、20分钟后，取消毒剂与细菌混合样品0.5ml，接种于4.5ml中和剂中，中和10分钟后，10倍稀释稀释至10-4，取各稀释级1ml分别接种于平皿中，每个浓度平行2个平板。
阳性对照以0.9%氯化钠溶液代替消毒液，同法操作。
样品培养：
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌于30～35℃培养3天，白色念珠菌于20～25℃培养5天，培养结束后点计菌落数。
结果计算：
计算试验组和对照组的活菌浓度（cfu/ml），并换算为对数值（N），并按下式计算杀灭对照值
杀灭对数值（KL）=对照组平均活菌浓度的对数值（NO）－试验组活菌浓度对数值（NX）
可接受标准：
杀灭对数值（KL）应不低于3~5个对数单位。
3）表面试验法
试验目的：
通过擦拭消毒的消毒剂应通过表面试验法，确定其消毒效力是否符合要求。
染菌不锈钢载片制备
将经灭菌的载片平铺于无菌平皿内，滴加金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌，含菌量为1×108~5×108cfu/ml的菌悬液0.1ml，并均匀涂布于整个载体表面。
滴染菌液后，载片置超净工作台晾干后备用，每种菌平行制备两个染菌不锈钢载片。
染菌玻璃载片制备
因培养皿的材质为玻璃，故用培养皿代替玻璃载片进行染菌试验。
进行菌液滴染前，用记号笔在培养皿菌液滴染面的背面画出染菌面积（50mm×50mm），标注清晰，菌液滴染操作同染菌不锈钢载片制备。
操作
●试验组：
将消毒剂擦拭在制备好的染菌载片上，消毒剂作用时间分别为5分钟、10分钟、15分钟、20分钟，作用结束后，用接触碟取样，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌用TSA接触碟取样，白色念珠菌用SDA接触碟取样。
接触碟取样方法：
打开接触碟盖，使培养基表面与取样面直接接触，均匀按压接触碟，确保培养基表面与取样表面均匀接触10秒左右，再盖上碟盖。
●对照组：
对照组的活菌浓度计数见表9菌落计数表。
●阴性对照：
用接触碟在已灭菌未染菌的载片上按压取样，操作同上，每种载片及每种接触碟平行制备两个平皿。
样品培养：
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌于30～35℃培养3天，白色念珠菌于20～25℃培养5天，培养结束后点计菌落数。
结果计算：
计算试验组和对照组的活菌浓度（cfu/ml），并换算为对数值（N），并按下式计算杀灭对照值
杀灭对数值（KL）=对照组平均活菌浓度的对数值（NO）－试验组活菌浓度对数值（NX）
可接受标准：
杀灭对数值（KL）应不低于3~5个对数单位。
4）模拟现场消毒实验
擦拭区域：
微生物检验室不锈钢工作台面、墙面、超净工作台的台面三个区域的表面微生物取样进行擦拭取样。
擦拭方法：
清洁消毒前取灭菌的棉签1支，用灭菌的纯化水浸湿，握住棉签柄，在取样点处选择约25cm2取样面上，以30°角与取样表面接触，纵向缓慢并充分擦拭，反转棉签，同法横向擦拭，然后将棉签端用无菌剪刀剪断置于装有20m灭菌纯化水的瓶中，迅速封口，作为供试液。
实验结束后操作人员按《微生物检验室清洁消毒管理程序（SOP-025）》对洁净区进行清洁消毒，清洁消毒完毕15分钟后，再用灭菌的棉签按以上方法对以上区域进行擦拭。
每个测试点的瓶子均振摇3分钟，使微生物充分释放。
取以上各瓶供试液分别用0.22um的滤膜全部过滤，过滤完毕取出滤膜菌面朝上贴于TSA培养基平板上，30～35℃培养3天，点计菌落数。
结果判定：
≤25cfu/25cm2。
8.2消毒剂有效期确认试验
1）试验目的：
通过该试验，确定消毒剂在有效期内是稳定的，并且消毒效力不会变化，符合要求。
2）试验操作：
配制75%乙醇、0.1%新洁尔灭、0.5%84消毒液
8.3验证记录：
见表4至表10。
表4中和剂选择实验结果
消毒剂
菌种
稀释度
结果
3、4、5
组间误差率
结论
第一组
第二组
第三组
第四组
第五组
第六组
新洁尔
灭液
金黄色
葡萄球菌
大肠
埃希菌
枯草
芽孢杆菌
白色
念珠菌
乙醇
溶液
金黄色
葡萄球菌
大肠
埃希菌
枯草
芽孢杆菌
白色
念珠菌
84
消毒液
金黄色
葡萄球菌
大肠
埃希菌
枯草
芽孢杆菌
白色
念珠菌
操作人/日期：
复核人/日期：
表5消毒剂定量悬浮试验结果
消毒剂
菌种
稀释级
结果
杀灭
对数值
试验组活菌浓度对数值
试验组活菌浓度对数值
0.1%新洁尔灭
金黄色葡萄球菌
10-1
10-2
10-3
10-4
大肠埃希菌
10-1
10-2
10-3
10-4
枯草芽孢杆菌
10-1
10-2
10-3
10-4
白色念珠菌
10-1
10-2
10-3
10-4
75%乙醇
金黄色葡萄球菌
10-1
10-2
10-3
10-4
大肠埃希菌
10-1
10-2
10-3
10-4
枯草芽孢杆菌
10-1
10-2
10-3
10-4
白色念珠菌
10-1
10-2
10-3
10-4
结论：
。
操作人/日期：
复核人/日期：
消毒剂
菌种
稀释级
结果
杀灭
对数值
试验组活菌浓度对数值
试验组活菌浓度对数值
0.5%84消毒液
金黄色葡萄球菌
10-1
10-2
10-3
10-4
大肠埃希菌
10-1
10-2
10-3
10-4
枯草芽孢杆菌
10-1
10-2
10-3
10-4
白色念珠菌
10-1
10-2
10-3
10-4
结论：
。
操作人/日期：
复核人/日期：
表6表面试验法试验记录
消毒剂
菌种
不锈钢载片
玻璃载片
对照组
阴性对照组
①
②
①
②
0.1%新洁尔灭
金黄色葡萄球
大肠埃希菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
75%乙醇
金黄色葡萄球
大肠埃希菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
0.5%84消毒液
金黄色葡萄球
大肠埃希菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
结论：
。
操作人/日期：
复核人/日期：
表7模拟现场消毒实验记录（清洁消毒前）
测试点
菌落数
判定标准
结论
微生物检验室不锈钢工作台面
微生物检验室墙面
微生物检验室超净工作台台面
操作人/日期：
复核人/日期：
表8模拟现场消毒实验记录（清洁消毒后）
测试点
菌落数
判定标准
结论
微生物检验室不锈钢工作台面
微生物检验室墙面
微生物检验室超净工作台台面
操作人/日期：
复核人/日期：
表9菌种信息
菌种信息
菌种名称：
金黄色葡萄球菌
菌种编号：
菌种代数：
菌种来源：
领用日期：
领用人：
稀释至含菌量小于100cfu
菌种名称：
枯草芽孢杆菌
菌种编号：
菌种代数：
菌种来源：
领用日期：
领用人：
稀释至含菌量小于100cfu
菌种名称：
大肠埃希菌
菌种编号：
菌种代数：
菌种来源：
领用日期：
领用人：
稀释至含菌量小于100cfu
菌种名称：
白色念珠菌
菌种编号：
菌种代数：
菌种来源：
领用日期：
领用人：
稀释至含菌量小于100cfu
表10菌落计数表
菌液名称
金黄色葡萄球菌
稀释级
10-5
10-6
10-7
10-8
菌落数
菌液名称
大肠埃希菌
稀释级
10-5
10-6
10-7
10-8
菌落数
菌液名称
枯草芽孢杆菌
稀释级
10-5
10-6
10-7
10-8
菌落数
菌液名称
白色念珠菌
稀释级
10-5
10-6
10-7
10-8
菌落数
结论：
。
操作人/日期：
复核人/日期：
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