人教版高中生物选修一专题五DNA和蛋白质技术知识点归纳.docx

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人教版高中生物选修一专题五DNA和蛋白质技术知识点归纳

Preparedon22November2020

人教版高中生物选修一专题五DNA和蛋白质技术知识点归纳

专题五ＤＮＡ和蛋白质技术

课题一　ＤＮＡ的粗提取与鉴定

一、提取DNA的溶解性原理包括哪些方面

在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精。

①DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点要使DNA溶解，需要使用什么浓度要使DNA析出，又需要使用什么浓度

在L时溶解度最小；较高浓度可使DNA溶解；L可使DNA析出。

②在溶解细胞中的DNA时，人们通常选用2mol/LNaCl溶液；将DNA分子析出的方法是向溶有DNA的NaCl溶液中缓慢注入蒸馏水，以稀释NaCl溶液。

酒精是一种常用有机溶剂，但DNA却不能溶于酒精（特别是95％冷却酒精），但细胞中蛋白质可溶于酒精。

2.从理论上分析，预冷的乙醇溶液具有以下优点。

一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；

二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；

三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。

3.采用DNA不溶于酒精的原理，可以达到什么目的

将DNA和蛋白质进一步分离。

4.提取DNA还可以利用DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性原理。

利用该原理时，应选用怎样的酶和怎样的温度值

蛋白酶，因为酶具有专一性，蛋白酶只水解蛋白质而不会对DNA产生影响。

温度值为60～80℃，因为该温度值蛋白质变性沉淀，而DNA不会变性。

补充：

DNA的变性是指DNA分子在高温下解螺旋，其温度在80℃以上，如在PCR技术中DNA变性温度在95℃。

5.洗涤剂在提取DNA中有何作用

洗涤剂将细胞膜上的蛋白质，从

而瓦解细胞膜。

6.当鉴定提取出的物质是否是DNA时，需要使用什么指示剂进行鉴定在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色。

原理总结：

通过利用不同浓度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以从细胞中提取和提纯DNA；再利用酒精进一步将DNA与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是DNA。

二、实验材料的选取

不同生物的组织中DNA含量不同。

在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。

本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。

一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；

二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。

鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。

三、破碎细胞，获取含DNA的滤液

1、若选用鸡血和洋葱作实验材料，则怎样获取含DNA的滤液

在鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并用玻棒搅拌，过滤后收集滤液；切碎洋葱，加入一定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，过滤后收集滤液。

2.为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂

答：

蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），从而释放出DNA。

3．在以上实验中，加入蒸馏水、洗涤剂和食盐的作用分别是什么过滤时应当选用（滤纸、尼龙布）。

血细胞在蒸馏水中大量吸水而张裂；洗涤剂瓦解细胞膜；食盐溶解DNA物质；选用尼龙布进行过滤。

4.在处理植物组织时需要进行研磨，其目的是什么研磨不充分产生什么结果

破碎细胞壁，使核物质容易溶解在NaCl溶液中；研磨不充分会使DNA的提取量减少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。

具体做法。

10mL鸡血＋20mL蒸馏水→同方向搅拌→3层尼龙布过滤→滤液

三、去除滤液中的杂质

1.为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质

用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。

因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。

最初获得的DNA滤液含有蛋白质、脂质等杂质，需要进一步提纯DNA。

方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。

方案二与方案三的原理有什么不同

答：

方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质

对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。

四、析出与鉴定

1.在滤液中仍然含有一些杂质，怎样除去这些杂质呢得到的DNA呈何颜色

滤液与等体积的冷却酒精混合均匀，静置2～3分钟，析出的白色丝状物就是DNA。

DNA呈白色。

2.怎样鉴定析出的白色丝状物就是DNA呢

具体做法。

试管2支，编号甲乙→各加等量5mLNaCl溶液→甲中放入少量白色丝状物，使之溶解→各加4mL二苯胺，混合均匀→沸水浴5min→观察颜色变化

五、实验操作

制备鸡血细胞液…………加柠檬酸钠，静置或离心

↓

破碎细胞，释放DNA…加蒸馏水，同一方向快速通方向搅拌

↓→过滤，除去细胞壁、细胞膜等。

溶解核内DNA…………加入NaCl至2mol/L，同一方向缓慢搅拌

↓

DNA析出………………加蒸馏水至L，过滤，在溶解到2mol/L溶液中

↓→除去细胞质中的大部分物质。

DNA初步纯化…………与等体积95％冷却酒精混合，析出白色丝状物

↓→除去核蛋白、RNA、多糖等。

DNA鉴定………………二苯胺，沸水浴，呈现蓝色

注意事项：

在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心以提高细胞悬液浓度；使用塑料烧杯；使用尼龙布过滤；玻棒沿同一方向搅拌；玻棒搅拌要缓慢（细胞破裂快速搅拌）；玻棒不要碰到烧杯壁；二苯胺试剂要现用现配等。

课题二多聚酶链式反应扩增DNA片段

基础知识

PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似：

1．细

胞内DNA复制条件分析：

条件

组分

作用

模板

DNA的两条单链

提供复制的模板

原料

四种脱氧核苷酸

合成DNA子链的原料

酶

解旋酶

DNA聚合酶

打开DNA双螺旋

催化合成DNA子链

能量

ATP

为解螺旋和合成子链供能

引物

RNA

为DNA聚合酶提供合成的3’端起点

2．细胞内DNA复制过程的解析：

解旋：

解旋酶、ATP，DNA两条链打开，形成两条DNA单链。

引物结合：

在DNA单链3’端与DNA反向配对结合。

DNA聚合酶结合：

DNA聚合酶与模板链结合，标志着单链合成开始。

子链合成：

DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。

后续加工：

D

NA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来（半不连续合成。

先导链，滞后链）

3．DNA分子复制的人工控制

实验操作步骤

照

PCR反应体系配方配制反应液；

②将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（）中；

③将微量离心管放到PCR仪中；

④设置PCR仪的工作参数。

⑤DNA在PCR仪中大量扩增。

4．实验注意事项

（1）避免外源DNA污染：

所用仪器、缓冲液、蒸馏水等

使用前高压灭菌。

（2）缓冲液和酶分装

成小份，－20℃低温保存。

（3）每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。

（4）混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。

总结、点评

课题三血红蛋白的提取和分离

一、实验原理

蛋白质的物化理性质：

形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。

1．凝胶色谱法（分配色谱法）：

（1）原理：

分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。

（2）凝胶材料：

多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

（3）分离过程：

混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子

洗脱：

从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

（4）作用：

分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。

2．缓冲溶液

（1）原理：

由弱酸和相应的强

碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。

（2）缓冲液作用：

抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。

3．凝胶电泳法：

（1）原理：

不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。

（2）分离方法：

琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

（3）分离过程：

在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。

二、实验步骤

1．样品处理

红细胞的洗涤

洗涤红细胞

的目的是去除杂蛋白，采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍

体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液

中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。

②血红蛋白的释放

在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。

注：

加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。

加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。

2．粗分离

①分离血红蛋白溶液

将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。

第一层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。

将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

②透析

取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中，透析12h。

透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。

3．纯化

调

节缓冲液面：

打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝

↓胶面平齐，关闭出口。

加入蛋白质样品：

用吸管将透析后的样品沿管壁环绕移动加到色谱柱的顶端。

加样后，

∣打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全渗入凝胶层后，

↓关闭出口。

调节缓冲液面：

加入20mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度

↓

洗脱：

连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。

↓

收集分装蛋白质：

待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集。

4.纯度鉴定------SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）

三

、注意事项

电泳技术

电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。

2.红细胞的洗涤

如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。

此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。

3．如何检测凝胶色谱柱的装填是否成功

由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。

此外，还可以加入大分子的有色物质，观察色带移动的情况。

如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。

如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。

4．为什么凝胶的装填要紧密、均匀

如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。

5．沸水浴处理加入洗脱液的湿凝胶的目的

不但节约时间，还能除去凝胶中可能带有的微生物和排除凝胶内的空气。

6．G-75

“G”代表凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水。

7．装填完后，立即用洗脱液洗脱的目的：

使凝胶装填紧密

8．加入柠檬酸钠有何目的为什么要低速、短时离心为什么要缓慢搅拌

防止血液凝固；防止白

细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。

9．与其他真核细胞相比，红细胞的特点及这一特点对进行蛋白质的分离的意义

哺乳动物及人的成熟的红细胞是双面凹圆饼状，没有细胞核和细胞器。

其含有的血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该

收集脱液。

这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

10．如何检测血红蛋白的分离是否成功

如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。