专题二微生物的培养与应用.docx
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专题二微生物的培养与应用
专题二微生物的培养与应用
【学习导航】
本专题包含三个方面的内容：
课题1.微生物的实验室培养；课题2.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数；课题3分解纤维素的微生物的分离。
课题1介绍了最基本的微生物技术，是开展其他两个课题的基础。
课题2和课题3要求分离某种特定的微生物，难度较大，探究性也更强。
此外，本专题中所强调的无菌操作技术，将有助于“专题3植物组织培养技术”的顺利完成。
学生通过本专题的学习，应当掌握培养基、消毒灭菌等有关微生物培养的基础知识，应当掌握培养基的制备、高压蒸汽灭菌和平板划线法等基本操作技术，并可以运用相关技术解决生产生活中有关微生物计数、微生物分离与培养等实际问题。
课题1微生物的实验室培养
【导学诱思】
1．培养基的配制原则是。
培养基可以分为
和。
2．培养基一般都含有、、、四类营养物质，
另外还需要满足微生物生长对、以及的要求。
思考：
为什么大多数培养基都需要含有四类营养物质？
3．获得纯净培养物的关键是。
4．避免杂菌污染的方法主要包括以下四个内容：
5．消毒是指
灭菌是指
思考：
消毒与灭菌的相同点与区别分别是什么？
6．实验室常用的消毒方法是，此外，人们也常使用化学药剂进行消
毒，如用、等。
常用的灭菌方法
有、、，此外，实验室里还用
或进行消毒。
7．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法步骤是⑴，⑵，
⑶，⑷，⑸。
思考：
⑴培养基灭菌后，需要冷却到50左右，才能用来倒平板。
你用什么方法来估计培养基的
温度？
⑵为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
⑶平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
⑷在倒平板的过程中，如果不小心瘵培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能
用来培养微生物吗？
为什么？
8．微生物接种的方法中最常用的是和。
平板划线法是
指
。
稀释涂布平板法是指
。
9．平板划线的操作步骤如下：
⑴
⑵
⑶
⑷
⑸
⑹
⑺
思考：
⑴为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？
在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？
为什么？
⑵在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
⑶在作第二次以及其后的划线操作是赤什么总是从上一次划线的末端开始划线？
10．系列稀释操作步骤：
⑴
⑵
⑶
11．涂布平板操作步骤：
⑴
⑵
⑶
⑷
【疑难点拨】
1．生物的营养
营养是指生物摄取、利用营养物质的过程。
营养物质是指维持机体生命活动，保证发育、生殖所需的外源物质。
在人及动物，营养物质包括水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类；在植物，营养物质包括矿质元素、水、二氧化碳等三类；在微生物，则有水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。
2．培养基的制作是否合格
如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2天后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。
3．无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
4．平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
5．为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？
在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？
为什么？
操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。
划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
【典例解析】
例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是
A.是碳源的物质不可能同时是氮源B.凡碳源都提供能量
C.除水以外的无机物只提供无机盐D.无机氮源也能提供能量
例2．下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是
A.防止杂菌污染B.消灭杂菌
C.培养基和发酵设备都必须灭菌D.灭菌必须在接种前
【课堂演练】
一、选择题﹙﹚
1．有可能作为异养微生物碳源的是
A．牛肉膏B．含碳有机物C．石油D．含碳无机物
2．含C、H、O、N的某大分子化合物可以作为
A.异养微生物的氮源、能源B.异养微生物的碳源、能源
C.自养微生物的碳源、氮源、能源D.异养微生物的碳源、氮源、能源
3．配制培养基的叙述中正确的是
A．制作固体培养基必须加入琼脂B．加入青霉素可得到放线菌
C．培养自生固氮菌不需氮源D．发酵工程一般用半固体培养基
4．自养型微生物与异养型微生物的培养基的主要差别是
A．碳源B．氮源C．无机盐D．特殊营养物质
5．下表是有关4种生物的能源、碳源、氮源和代谢类型的概述。
其中正确的是（）
生物
硝化细菌
根瘤菌
酵母菌
谷氨酸棒状杆菌
能源
氧化NH3
N2的固定
分解糖类等有机物
光能
碳源
C02
糖类
糖类
糖类
氮源
NH3
N2
NH4+、NO3-
尿素
代谢类型
自养需氧型
异养需氧型
异养兼性厌氧型
自养需氧型
A．根瘤菌、谷氨酸棒状杆菌B．硝化细菌、酵母菌
C．酵母菌、谷氨酸棒状杆菌D．硝化细菌、根瘤菌
6．酵母菌培养液中常含有一定浓度的葡萄糖，但当葡萄糖浓度过高时，反而抑制微生物
的生长，原因是
A．碳源供应太充足B．细胞会发生质壁分离
C．改变了酵母菌的pH值D．葡萄糖不是酵母菌的原料
7．微生物（除病毒外）需要从外界吸收营养物质并通过代谢来维持正常的生长和繁殖。
下列有关微生物营养的说法正确的是
A．乳酸菌与硝化细菌所利用的碳源物质是相同的
B．微生物生长中不可缺少的一些微量的无机物称为生长因子
C．培养基中的营养物质浓度越高对微生物的增殖越有利
D．生长因子一般是酶或核酸的组成成分，微生物本身合成这些生长因子的能力往往
不足。
8．要将从土壤中提取的自生固氮菌与其他的细菌分离出来，应将它们接种在
A．加入氮源和杀菌剂的培养基上B．不加入氮源和不加杀菌剂的培养基上
C．加入氮源，不加杀菌剂的培养基上D．不含氮源和杀菌剂的培养基上
二、非选择题
9．培养蘑菇时常使用的原料为棉花壳、花生粉饼、朽木等，再喷洒适量的水，加入一定
量的尿素等。
请回答下列问题：
（1）按化学成分分类，该培养基为培养基，按物理性质分类该培
养基为培养基。
（2）培养过程中发现培养基上长出了其他杂菌，经鉴定为细菌，细菌与蘑菇的关系
为，在培养基上施用适量的即可抑制细菌生长。
（3）蘑菇的代谢类型为在生态系统的成分中属于。
课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
【课程标准】研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定
【课题重点】对土样的选取和选择培养基的配制。
【课题难点】对分解尿素的细菌的计数。
【基础知识】
一、理论基础
1．筛选菌株
（1）实验室中微生物筛选的原理：
人为提供有利于生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时或其他微生物生长。
分解尿素的细菌主要有，，。
（2）选择培养基：
在微生物学中，将允许种类的微生物生长，同时和其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。
2．统计菌落数目
统计菌落数目的方法主要有，，。
常用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。
当样品的足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个。
通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
为了保证结果准确，一般选择菌落数在的平板进行计数。
此外，测定微生物数量的常用方法还有直接计数。
3．设置对照
设置对照的主要目的是排除实验组中对实验结果的影响，提高实验结果的。
例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需以培养的培养基作为空白对照。
二、实验设计关于土壤中某样品细菌的分离与计数实验操作步骤如下：
1．取样：
从肥沃、湿润的土壤中取样。
先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的中。
2．制备：
准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基
将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。
3．微生物的与观察
将10g土样加入盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中（体积为250mL），充分摇匀，吸取上清液，转移至盛有的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取进行平板涂布操作。
每个稀释度下需要3个选择培养基、1个牛肉膏蛋白胨培养基。
将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养，及时观察和记录。
挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含培养基的斜面中，观察能否产生如教材中图2-lO的颜色反应。
4．细菌的计数
当菌落数目稳定时，选取菌落数在的平板进行计数。
在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。
土壤中的微生物大约有的细菌，绝大多数分布在。
测定土壤中细菌的数量一般选用倍的稀释液进行平板培养，一般在温度下培养天，每隔，小时统计一次菌落数目，选取时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足导致遗漏菌落数目。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数操作中需要注意的问题是
，，。
准确鉴定分解尿素细菌的方法是在以尿素为唯一氮源的培养基中加入，
出现的现象是
【典例分析】
类型一选择培养基的配制
【例1】分析下面培养基的配方：
KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H20、葡萄糖、尿素、琼脂。
请回答：
（1）在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是和。
（2）想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用?
如果具有，又是如何进行选择的?
类型二统计菌落数目
【例2】用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中．得到以下几种统计结果，正确的是…（）
A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230
B．涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238
C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和2墨6，取平均值163
D．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是2l0、240和250，取平均值233
类型三设置对照
【例3】用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是（）
A．未接种的选择培养基B．未接种的牛肉膏蛋白胨（全营养）培养基
c．接种了的牛肉膏蛋白胨（全营养）培养基D．接种了的选择培养基
【基础自测】一、选择题
1．PCR技术要求使用耐高温的DNA聚合酶，这种酶要能忍受93℃左右的高温。
如果请你来寻找这种耐高温的酶，你会去哪里寻找………………………………………（）
A．土壤中B．海水中C．热泉中D．冷库中
2．下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是………………………………………（）
A．KH2PO4、Na2HP04、MgS04·7H20、葡萄糖、尿素、琼脂、水
B．KH2PO4、Na2HP04、MgS04·7H20、葡萄糖、琼脂、水
C．KH2PO4、Na2HP04、MgS04·7H20、尿素、琼脂、水
D．KH2PO4、Na2HP04、MgS04·7H20、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水；
3.某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL）…………………………（）
A．2.34×108B．2.34×109C．234D．23.4
4.在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应106培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。
A同学的结果产生原因可能有…………………（）
①由于土样不同②由于培养基污染③由于操作失误④没有设置对照
A．①②③B．②③④C．①③④D．①②④
5.关于土壤取样的叙述错误的是………（）
A．土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤B．先铲去表层土3cm左右，再取样
C．取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌D．应在火焰旁称取土壤
6.下列关于从土壤中分离细菌的操作步骤中，正确的是…………（）
①土壤取样②称取10g土壤取出加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中③吸取0.1mL进行平板涂布④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度
A．①→②→③→④B．①→③→②→④
C．①→②→④→③D．①→④→②→③
7.下列关于测定土壤中细菌数量的叙述，正确的是……………（）
A．一般选用103～107倍的稀液分别涂布
B．测定放线菌的数量，一般选用103、lO4和105倍稀释
C．测定真菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释
D．当第一次测量某种细菌的数量，可以将101～107倍的稀释液分别涂布到平板上培养
8.下列关于微生物的培养叙述错误的是（）
A．细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d
B．放线菌一般在25～28℃的温度下培养5～7d
C．霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d
D．不同种类的微生物，一般需要相同的培养温度和培养时间
9.下列操作需要在火焰旁进行的一组是（）
①土壤取样②称取土壤③稀释土壤溶液④涂布平板⑤微生物的培养
A．①②③④⑤B．②③④⑤④⑤C．③④⑤D．②③④
10.下列可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是……………………………………（）
A．以尿素为唯一氮源的培养基中加人酚红指示剂
B．以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂
C．以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂
D．以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂
11.土壤取样时最好选择哪种环境中的土壤做分离细菌的实验…（）
A．街道旁B．花盆中C．农田中D．菜园里
二、非选择题
12.统计菌落数目一般用稀释涂布平板法，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个，来源于样品稀释液中的一个。
计数时一般选择菌落数在的平板计数。
13.在做本课题实验时，一位同学在稀释倍数为106的培养基中涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212和256，该同学以这3个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
你认为这一结果是否接近真实值?
如果需要改进，如何改进?
14.在进行操作本课题实验时应特别注意：
、、。
15．在做本课题实验时，甲同学筛选出的菌落与其他同学不同，并且他在设计实验时并没有设置对照。
思考下列问题：
（1）你认为出现甲同学这种结果的原因可能是什么?
（2）要帮助甲同学排除可能影响实验结果的因素，需要设置，实验方案有两种：
一种方案是可以由其他同学用与甲同学进行实验，如果结果与甲同学一致，则证明甲同学，如果结果不同，则证明甲同学存在操作或的配制有问题。
另一种方案是将甲同学配制的培养基在不加的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到。
（3）由此问题你得出的启示是什么?
16．在105稀释度下求出3个平板上菌落数的平均值是63，那么每克样品中的菌落数是多少?
知识拓展
1．土壤中采集菌样
由于在土壤中几乎可找到任何微生物，所以土壤是首选的采集目标。
土壤采样必须考虑以下几个问题：
（1）土壤中有机物的含量有机物含量高，土质就肥，一般在其中微生物数量也越多，反之亦然。
（2）采土的深度土壤的深度不同，其通气、养分和水分的分布情况也不同。
表层的土壤由于直接受日光暴晒，故较干燥，微生物也不易大量繁殖。
在离地面5～20cm处的土壤，微生物含量最高。
（3）植被情况植被的种类与微生物的分布有着密切的关系。
例如，在冬天灌水的水稻田土壤中，真菌的分布较多。
（4）采土的季节：
以春秋两季为宜。
这时土壤中的养分、水分和温度都较适宜，微生物的数量多。
（5）采土方法选择好适当地点后，用小铲子除去表土，取5～20cm处的土样几十克，盛人事先灭过菌的防水纸袋内，并在上面记录采土时间、地点和植被等情况。
等。
课题3分解纤维素的微生物的分离
【课程标准】1．能简述纤维素酶的种类及作用，
2．能从土壤中分离出分解纤维素的微生物，了解这类微生物的应用。
3．能掌握从土壤中分离某种特定微生物的操作技术。
【课题重点】从土壤中分离分解纤维素的微生物。
【课题难点】从土壤中分离分解纤维素的微生物。
【基础知识】
一、纤维素与纤维素酶
1．纤维素的化学组成：
三种元素，是一种糖。
2．纤维素的分布：
是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。
3．纤维素酶的作用：
纤维素酶是一种，一般认为它至少包括三种组分，即酶、酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成。
二、纤维素分解菌的筛选
1．筛选方法：
染色法。
常用的刚果红染色法有两种即
。
2．筛选原理：
刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。
三、土壤中纤维素分解菌的分离的实验方案
1．土壤取样采集土样时，应选择富含的环境。
2．选择培养
（1）目的：
增加纤维素分解菌的，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。
（2）制备选择培养基：
参照课本旁栏中的比例配制。
（3）选择培养：
称取土样20g，在无菌条件下加入装有30mL培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在上，在一定温度下振荡培养1～2d，直至培养液变。
也可重复选择培养。
3．梯度稀释
参照专题1的稀释操作，依次将培养液稀释101～107倍。
4．将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
（1）制备培养基：
参照课本旁栏中的比例。
（2）倒平板操作。
（3）涂布平板：
将稀释度为104～106的菌悬液各取0．1mL涂布在平板培养基上，30℃倒置培养。
5．挑选产生透明圈的菌落
参照课本刚果红染色法，挑选产生的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。
【例1】纤维素酶可以将下列哪种物质分解…………………………………………（）
A．牛肉片B．鱼片C．滤纸条D．塑料条
【例2】在加入刚果红的培养基中出现透明圈的菌落是……………………（）
A．分解尿素的细菌B．硝化细菌C．分解纤维素的细菌D．乳酸菌
【例3】本实验关于选择培养目的叙述正确的是…（）
A．可以增加纤维素分解菌的浓度B．可以减少纤维素分解菌的浓度
C．所用培养基是固体培养基D．所用培养基是平板培养基
基础自测
一、选择题
1．下列材料中纤维素含量最高的是……（）
A．杨树B．小麦C．玉米D．棉花
2．纤维素酶能够分解……………………（）
A．纤维素的微生物B．淀粉的微生物C．纤维素D．淀粉
3．刚果红能与哪项物质形成红色复合物（）
A．纤维二糖B．纤维素C．葡萄糖D．麦芽糖
4．寻找纤维素分解菌应到………………（）
A．湿润的环境中B．富含纤维素的环境中
C．富含无机盐的环境中D．池塘中
5．纤维素分解菌的选择培养基有选择作用，原因在于其含有………………………（）
A．NaNO。
B．KClC．酵母膏D．纤维素粉
6．下列哪种生物能产生纤维素酶…（）
A．纤维素分解菌B．牛c．羊D．兔
7．选择培养时应将锥形瓶固定在………（）
A．桌子上B．温箱里C．窗台上D．摇床上
8．选择培养的结果：
培养液变…………（）
A．清澈B．浑浊C．红色D．产生透明圈
9．刚果红染色时，加入刚果红可在……（）
①制备培养基时②梯度稀释时③倒平板时④涂布时⑤培养基上长出菌落时
A．①③B．②⑤C．③⑤D．④⑤
10．两种刚果红染色法的结果是………（）
A．均会出现透明圈B．均不会出现透明圈
C．方法一出现，方法二不出现D．方法一不出现，方法二出现
二、非选择题
11．纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括种组分，即、
和。
12．当纤维素被分解后，刚果红一纤维素自合物就无法形成，培养基中会出现以
为中心的透明圈。
这样，我们就可以通过是否产生来筛选纤维素分解菌。
13．为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维分解菌?
14．请分析下面的培养基配方，回答下面的问题：
纤维素分解菌的选择培养基
纤维素粉5g
NaN031g
Na2HP04·7H201.2g
KH2P040.9g
MgS04·7H200.5g
KCl0.5g
酵母膏0.5g
水解酪素0.5g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL
（1）上述配方是液体培养基还是固体培养基?
为什么?
（2）这个培养基对微生物是否具有选择作用?
如果具有，又是如何选择的?
（3）如果要证明该培养基的选择培养作用可用 培养基做 实验。
15.请你设计实验来证明纤维素酶的作用。
实验步骤：
（1）取2支20mL的试管,分别放入1cm×6cm的 。
（2）再分别加入pH为4.8，物质的量浓度为0.1mol·L-1的 缓冲液10mL、11mL。
（3）在加入lOmL缓冲液的试管中加入1mL 。
（4）将2支试管固定在摇床上，振荡反应1ｈ。
结果：
加纤维素酶的滤纸条被分解，另一支中的未分解。
则证明：
。
知识拓展
1．为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物
在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。
2．两种刚果红染色法的比较
刚果红染色法在本课题中我们给出了两种方法：
方法一是传统的方法，缺点是操作烦琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。
方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。
但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。
方法二的另一缺点是有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易
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