消毒剂消毒效果验证方案.docx
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消毒剂消毒效果验证方案
1、验证方案的起草
起草人
部门
日期
2、验证方案的审批
审核人
部门
日期
3、验证方案的批准
批准人
批准日期
1前言
2职责
3验证的方法及步骤
4异常情况及偏差处理
5.验证结果评价及建议
6、再验证周期
1.前言
消毒剂主要使用在洁净控制区域，用于控制生产环境、设备表面等的微生物污染
的一种化学剂。
由于没有一种消毒剂是完全理想的，因此有必要在实际工作中使用两种以上的消毒剂。
交替使用在理论上有利于防止形成相同环境的分离菌或抑制细菌的适应性。
本实验方案针对①75%乙醇、②1%新洁尔灭、③3%甲酚皂杀菌剂、④3%的过氧化氢溶液共4种消毒剂进行抑制或者杀灭微生物的效果确认。
1.1验证的目的
本验证的目的在于制定方法及可接受标准，来评价消毒剂对微生物的杀灭效果。
1.3验证的范围
75%乙醇、1%新洁尔灭、3%甲酚皂溶液、3%的H2O2
1.4验证内容：
本验证先在实验室对所使用的消毒剂，用六种控制菌做生物指示剂挑战性实验；然后做现场消毒考察实验，即现场消毒后用棉签取样法对消毒后的表面取样，做表面残留微生物限度检查。
通过对指示菌的杀灭对数值和现场消毒后洁净区表面微生物的残留限度来确认消毒剂的消毒效果。
2.职责
2.1验证小组成员：
部门
人员
2.2职责
2.3验证进度
3.验证方法及步骤
3.1实验材料
3.3.1菌株
（1）细菌：
金黄色葡萄球菌（ATCC6538）
铜绿假单胞菌（ATCC15442）
大肠杆菌（ATCC25922）
伤寒杆菌（ATCC6539）
（2）细菌芽孢：
枯草杆菌芽孢（ATCC9372）
（3）真菌：
白色念珠菌（ATCC10231）
3.3.2培养基
无菌大豆胰蛋白胨琼脂培养基（TSA）、营养肉汤培养基。
3.3.3稀释液：
1%蛋白胨-0.03mol/LPBS溶液
3.3.4中和剂：
0.1%卵磷脂+1%吐温80溶液；0.5%硫代硫酸钠（3%过氧化氢）
3.3.5无菌试管
3.3.6无菌平皿（90mm）
3.3.7消毒剂：
75%乙醇、1%新洁尔灭、3%甲酚皂溶液、3%的H2O2
3.3.8移液器及配套无菌吸头:
0-100ul，100-1000ul
3.2中和剂效力确认
①中和剂效力及毒性试验目的
在化学消毒试验中，达到规定消毒时间终点时，要求立即终止残留消毒剂的继续作用，以便准确检测出消毒体系中残留存活的微生物及其数量。
因为消毒体系中残留的消毒剂，可能对微生物的生长繁殖具有一定抑制作用，从而可导致对杀菌效果偏高的错误判断，甚至产生假阴性结果。
残留消毒剂的去除，可排除残留消毒剂对微生物的抑制，从而使试验获得正确结果。
中和法是指在消毒剂与微生物作用到达规定时间的终点时，取样加于适宜种类和浓度的中和剂中，将残留消毒剂迅速中和，使其不再持续抑制或杀灭微生物的方法。
本试验中所使用的中和剂必须既能有效抑制消毒剂的杀菌性（中和剂的效力试验）同时又不削弱微生物活力的恢复（中和剂的毒性试验）。
②中和剂效力、毒性确认
用稀释剂将试验菌制成5×105～5×106cfu/ml的的菌悬液备用。
准备无菌试管6支，按表一试验操作步骤表分组进行操作。
各组试昝充分震荡放置于振荡器震荡至少20秒或在手掌上振敲80次，然后移取Iml混合液到平皿中做平皿计数，轻轻转动平皿以使菌落在培养基表面均匀分散开来，每组做两皿平皿，并做好标记。
平皿在层流台下吹干，倒置于37℃下培养48小时后计数。
具体结果见附件一中和剂中和效力评估测试记录
表一中和剂效力、毒性确认试验操作步骤及结果判断
分组
试验操作
试验目的
试验结果判断
A
4.5ml消毒剂+0.5ml菌悬液作用10min取0.5ml作用液4.5ml稀释液试管中混匀，吸取1ml最终作用液于平皿中，做活菌计数。
观察消毒剂对试验菌有无杀灭或抑制能力。
应无试验菌生长或极少数菌落生长
B
4.5ml消毒剂+0.5ml菌悬液作用10min取0.5ml作用液4.5ml中和剂试管中混匀，吸取1ml最终作用液于平皿中，做活菌计数。
观察残留消毒液被中和后受到消毒剂作用后的试验菌是否能恢复生长。
B组菌落数比C、D、E组少，并符合下列要求：
A组平均菌落数B组平均菌落数
0
＞5
X（1～10）
＞X+5
Y（＞10）
＞Y+0.5Y
C
4.5ml中和剂+0.5ml菌悬液作用10min取0.5ml作用液4.5ml中和剂试管中混匀，吸取1ml最终作用液于平皿中，做活菌计数。
观察中和剂是否抑菌。
D
4.5ml中和产物液+0.5ml菌悬液作用10min取0.5ml作用液4.5ml中和剂试管中混匀，吸取1ml最终作用液于平皿中，做活菌计数。
观察中和产物，或未被完全中和的残留消毒剂对试验菌的生长繁殖是否有影响。
E
4.5ml稀释液+0.5ml菌悬液作用10min取0.5ml作用液4.5ml稀释液试管中混匀，吸取1ml最终作用液于平皿中，做活菌计数。
作为菌数对照
F
分别吸取1ml中和剂和1ml灭菌0.9%氯化钠溶液于平皿中做活菌计数。
作阴性对照
应无菌落生长
备注
若菌落太多不能计数，则移取1ml上述混合物，到9ml灭菌注射的生理盐水中（稀释10倍），充分振荡后再移取1ml做平皿计数。
试验结果符合上述所有条件，所测中和剂才可判为合格。
3.3消毒剂杀菌效率确认（定量悬浮试验）。
3.3.1原理将定量的细菌悬液加入消毒剂溶液中，作用一定时间。
去除残留的消毒剂影响后，以上液定量接种于营养琼脂平板上。
经培养后计算其菌落数。
与未经消毒剂作用的对照菌液平板计数相比较，计算出杀菌效率。
3.3.2菌悬液的制备
用第三代的菌悬液按1：
10用9ml的稀释剂稀释5次，计数培养，大约70-80之间，以获得10-4-10-6数量级的菌悬液。
将最终稀释的10-4、10-5、10-6三个数量级，即三个稀释梯度的菌悬液，各取2份1ml均匀接种涂布在培养基平板上进行培养计数。
将涂布的6块平板在37℃进行培养，7天后进行读数，以确认稀释浓度。
3.3.3试验方法：
4.5ml消毒剂+0.5ml菌悬液，作用10min，取0.5ml作用液，加到4.5ml中和剂试管中混匀，吸取1ml最终作用液于平皿中，做活菌计数。
白色念珠菌23～28℃培养72h后计数，其它菌液30～35℃培养48h后计数。
记录每个梯度1.0ml样品的菌落数（a1,a2），a和a1的平均值都应处于30-300CFU之间。
记录结果见附件二
3.3.4阳性对照：
用稀释剂代替消毒剂，进行平行试验，作为阳性对照。
计算每一种挑战菌种的Log下降值，并记下消毒剂的浓度和各自的接触时间。
3.3.5杀灭对数值计算
杀灭对数值（KL）＝对照组平均活菌浓度对数值-试验组活菌浓度对数值
3.3.6判定标准
消毒剂对挑战菌的杀灭对数值≥3判为合格。
3.3.7结论
根据实验结果进行计算，如果计算结果符合接受标准，即在一定的接触时间内，消毒剂能够使挑战菌水平下降99.9%（下降3个对数单位），则表明消毒剂能够进行日常消毒使用
3.4消毒剂的消毒效果现场考察
消毒剂对物体表面消毒模拟现场鉴定试验
3.4.1采样计划汇总表
试验位置
试验采样时间及频率
风险分析
分装机台面
消毒前、后，同一平面不同采样点分别进行3次
为保证消毒剂的效果，消毒前试验应在洁净室及设备运行之后，人员活动频繁，设备及洁净室墙面等最脏的时候进行消毒前的采样。
分装间墙面
分装间地面
3.4.2试验操作程序
（1）随机取物体表而（设备表面、台面、门等），用规格板标定2块面积各为25cm2的区块，一供消毒前采样，一供消毒后采样。
（2）消毒前，将无菌棉拭于含5ml中和剂试管中沾湿，对一区块涂抹采样，横竖往返各8次。
采样后，将棉拭采样端剪入原中和剂试管内，漩涡混合仪震荡20s或振打80次，作为消毒前样本。
（3）将配置好的消毒剂喷雾或涂擦于物体表面，保持湿润10分钟进行消毒。
消毒
后，将无菌棉签拭于中和剂试管中沾湿，并于试管壁上挤干后，对消毒区块涂抹采样，
横竖往返各8次。
采样后，以无菌操作方式将棉签拭采样端剪入原中和剂试管内，漩
涡混合仪震荡20s或振打80次，作为消毒组样本。
擦拭法取样示意图
（4）试验结束后，将用过的同批次中和剂各1.Oml接种培养基，作为阴性对照组样本。
每份吸取1．Oml，以琼脂倾注法接种平皿，每个样本接种2个平皿，放37℃恒温箱中培养48h，观察最终结果。
（5）计算杀灭对数值。
杀灭对数值N=lg消毒前平均菌落数-lg消毒后平均菌落数。
（6）判定标准
消毒剂杀灭对数值≥3判为合格。
（7）结论
根据实验结果进行计算，如果计算结果符合接受标准，即在一定的接触时间内，消毒剂能够使菌落数水平下降99.9%（下降3个对数单位），则表明消毒剂能够进行日常消毒使用
4异常情况及偏差处理
4.1异常情况处理程序
4.1.1日常监测过程中，应严格按照消毒标准操作程序进行操作。
4.2偏差或变更说明
验证过程中的偏差和异常必须详细记录和说明，并经过调查分析和处理。
5.验证结果评价及建议
质量保证部负责收集各项验证、试验结果记录，根据验证、试验结果起草验证报告，报验证领导小组核对。
验证领导小组对验证结果进行综合评审，做出验证结论，发放验证证书，确认该再验证周期。
对验证结果的评审应包括：
5.1验证试验是否有遗漏。
5.2验证实施过程中对验证方案有无修改，修改原因、依据以及是否经过批准。
5.3验证记录是否完整。
5.4验证试验结果是否符合标准要求，偏差及对偏差的说明是否合理，是否需要进一步补充试验。
6、再验证周期
6.1质量保证部根据验证结果确定再验证周期。
6.2当环境监控的结果出现偏差时，应重新评估目前使用的消毒剂，必要时更换消毒
剂的品种以及调整消毒剂的使用周期。
新消毒剂使用前均需经效果验证后方可使用。
附件一中和剂中和效力评估测试记录
1.1.
工作菌液为金黄色葡萄球菌时，中和剂鉴定试验结果
序号
项目类型
菌落计数结果（CFU/ml）
75%乙醇溶液
1%新洁尔灭溶液
3%甲酚皂溶液
3%的过氧化氢溶液
中和剂：
1%卵磷脂+0.1%聚山梨酯80
中和剂：
1%卵磷脂+0.1%聚山梨酯80
中和剂：
1%卵磷脂+0.1%聚山梨酯80
中和剂：
0.5%硫代硫酸钠
1
（消毒剂+工作菌液）+稀释液
2
（消毒剂+工作菌液）+中和剂
3
中和剂+工作菌液
4
（消毒剂+中和剂）+工作菌液
5
阳性对照组
6
第3、4、5组间误差率
可接受标准
第1组无菌生长，或仅有少数试验菌菌落生长；
第2组菌落数比第1组菌落数多，但比第3、4、5组菌落数少；
第3、4、5组有相似菌落数生长，其每组间菌落数是误差率不超过15%；
阴性对照组应无菌生长。
结论
符合规定
11
1.2工作菌液大肠埃希菌为时，中和剂鉴定试验结果
序号
项目类型
菌落计数结果（CFU/ml）
75%乙醇溶液
1%新洁尔灭溶液
3%甲酚皂溶液
3%的过氧化氢溶液
中和剂：
1%卵磷脂+0.1%聚山梨酯80
中和剂：
1%卵磷脂+0.1%聚山梨酯80
中和剂：
1%卵磷脂+0.1%聚山梨酯80
中和剂：
0.5%硫代硫酸钠
1
（消毒剂+工作菌液）+稀释液
2
（消毒剂+工作菌液）+中和剂
3
中和剂+工作菌液
4
（消毒剂+中和剂）+工作菌液
5
阳性对照组
6
第3、4、5组间误差率
可接受标准
第1组无菌生长，或仅有少数试验菌菌落生长；
第2组菌落数比第1组菌落数多，但比第3、4、5组菌落数少；
第3、4、5组有相似菌落数生长，其每组间菌落数是误差率不超过15%；
阴性对照组应无菌生长。
结论
符合规定
1.3工作菌液为铜绿假单胞菌时，中和剂鉴定试验结果
序号
项目类型
菌落计数结果（CFU/ml）
75%乙醇溶液
1%新洁尔灭溶液
3%甲酚皂溶液
3%的过氧化氢溶液
中和剂：
1%卵磷脂+0.1%聚山梨酯80
中和剂：
1%卵磷脂+0.1%聚山梨酯80
中和剂：
1%卵磷脂+0.1%聚山梨酯80
中和剂：
0.5%硫代硫酸钠
1
（消毒剂+工作菌液）+稀释液
2
（消毒剂+工作菌液）+中和剂
3
中和剂+工作菌液
4
（消毒剂+中和剂）+工作菌液
5
阳性对照组
6
第3、4、5组间误差率
可接受标准
第1组无菌生长，或仅有少数试验菌菌落生长；
第2组菌落数比第1组菌落数多，但比第3、4、5组菌落数少；
第3、4、5组有相似菌落数生长，其每组间菌落数是误差率不超过15%；
阴性对照组应无菌生长。
结论
符合规定
1.4
工作菌液为伤寒杆菌时，中和剂鉴定试验结果
序号
项目类型
菌落计数结果（CFU/ml）
75%乙醇溶液
1%新洁尔灭溶液
3%甲酚皂溶液
3%的过氧化氢溶液
中和剂：
1%卵磷脂+0.1%聚山梨酯80
中和剂：
1%卵磷脂+0.1%聚山梨酯80
中和剂：
1%卵磷脂+0.1%聚山梨酯80
中和剂：
0.5%硫代硫酸钠
1
（消毒剂+工作菌液）+稀释液
2
（消毒剂+工作菌液）+中和剂
3
中和剂+工作菌液
4
（消毒剂+中和剂）+工作菌液
5
阳性对照组
6
第3、4、5组间误差率
可接受标准
第1组无菌生长，或仅有少数试验菌菌落生长；
第2组菌落数比第1组菌落数多，但比第3、4、5组菌落数少；
第3、4、5组有相似菌落数生长，其每组间菌落数是误差率不超过15%；
阴性对照组应无菌生长。
结论
符合规定
1.5工作菌液为枯草芽孢杆菌时，中和剂鉴定试验结果
序号
项目类型
菌落计数结果（CFU/ml）
75%乙醇溶液
1%新洁尔灭溶液
3%甲酚皂溶液
3%的过氧化氢溶液
中和剂：
1%卵磷脂+0.1%聚山梨酯80
中和剂：
1%卵磷脂+0.1%聚山梨酯80
中和剂：
1%卵磷脂+0.1%聚山梨酯80
中和剂：
0.5%硫代硫酸钠
1
（消毒剂+工作菌液）+稀释液
2
（消毒剂+工作菌液）+中和剂
3
中和剂+工作菌液
4
（消毒剂+中和剂）+工作菌液
5
阳性对照组
6
第3、4、5组间误差率
可接受标准
第1组无菌生长，或仅有少数试验菌菌落生长；
第2组菌落数比第1组菌落数多，但比第3、4、5组菌落数少；
第3、4、5组有相似菌落数生长，其每组间菌落数是误差率不超过15%；
阴性对照组应无菌生长。
结论
符合规定
1.6
工作菌液白色念珠菌为时，中和剂鉴定试验结果
序号
项目类型
菌落计数结果（CFU/ml）
75%乙醇溶液
1%新洁尔灭溶液
3%甲酚皂溶液
3%的过氧化氢溶液
中和剂：
1%卵磷脂+0.1%聚山梨酯80
中和剂：
1%卵磷脂+0.1%聚山梨酯80
中和剂：
1%卵磷脂+0.1%聚山梨酯80
中和剂：
0.5%硫代硫酸钠
1
（消毒剂+工作菌液）+稀释液
2
（消毒剂+工作菌液）+中和剂
3
中和剂+工作菌液
4
（消毒剂+中和剂）+工作菌液
5
阳性对照组
6
第3、4、5组间误差率
可接受标准
第1组无菌生长，或仅有少数试验菌菌落生长；
第2组菌落数比第1组菌落数多，但比第3、4、5组菌落数少；
第3、4、5组有相似菌落数生长，其每组间菌落数是误差率不超过15%；
阴性对照组应无菌生长。
结论
符合规定
附件二消毒剂效力评估测试记录
2.1消毒剂杀菌对数值菌落数记录
挑战细菌名称：
金黄色葡萄球菌
实验组
第一次试验
第二次试验
第三次试验
消毒剂
平皿1
平皿2
平皿1
平皿2
平皿1
平皿2
75%乙醇
平均菌落数
杀菌对数值
1%新洁尔灭
平均菌落数
杀菌对数值
3%甲酚皂
平均菌落数
杀菌对数值
3%过氧化氢
平均菌落数
杀菌对数值
阳性的对照
平均菌落数
2.2消毒剂杀菌对数值菌落数记录
挑战细菌名称：
大肠杆菌
实验组
第一次试验
第二次试验
第三次试验
消毒剂
平皿1
平皿2
平皿1
平皿2
平皿1
平皿2
75%乙醇
平均菌落数
杀菌对数值
1%新洁尔灭
平均菌落数
杀菌对数值
3%甲酚皂
平均菌落数
杀菌对数值
3%过氧化氢
平均菌落数
杀菌对数值
阳性的对照
平均菌落数
2.3消毒剂杀菌对数值菌落数记录
挑战细菌名称：
铜绿假单胞菌
实验组
第一次试验
第二次试验
第三次试验
消毒剂
平皿1
平皿2
平皿1
平皿2
平皿1
平皿2
75%乙醇
平均菌落数
杀菌对数值
1%新洁尔灭
平均菌落数
杀菌对数值
3%甲酚皂
平均菌落数
杀菌对数值
3%过氧化氢
平均菌落数
杀菌对数值
阳性的对照
平均菌落数
2.4消毒剂杀菌对数值菌落数记录
挑战细菌名称：
伤寒杆菌
实验组
第一次试验
第二次试验
第三次试验
消毒剂
平皿1
平皿2
平皿1
平皿2
平皿1
平皿2
75%乙醇
平均菌落数
杀菌对数值
1%新洁尔灭
平均菌落数
杀菌对数值
3%甲酚皂
平均菌落数
杀菌对数值
3%过氧化氢
平均菌落数
杀菌对数值
阳性的对照
平均菌落数
2.5消毒剂杀菌对数值菌落数记录
挑战细菌名称：
枯草芽孢杆菌
实验组
第一次试验
第二次试验
第三次试验
消毒剂
平皿1
平皿2
平皿1
平皿2
平皿1
平皿2
75%乙醇
平均菌落数
杀菌对数值
1%新洁尔灭
平均菌落数
杀菌对数值
3%甲酚皂
平均菌落数
杀菌对数值
3%过氧化氢
平均菌落数
杀菌对数值
阳性的对照
平均菌落数
2.6消毒剂杀菌对数值菌落数记录
挑战细菌名称：
白色念珠菌
实验组
第一次试验
第二次试验
第三次试验
消毒剂
平皿1
平皿2
平皿1
平皿2
平皿1
平皿2
75%乙醇
平均菌落数
杀菌对数值
1%新洁尔灭
平均菌落数
杀菌对数值
3%甲酚皂
平均菌落数
杀菌对数值
3%过氧化氢
平均菌落数
杀菌对数值
阳性的对照
平均菌落数
2.7消毒剂杀菌对数值菌落数下降记录
消毒剂
金黄色葡萄球菌
大肠杆菌
铜绿假单胞菌
伤寒杆菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
消毒剂作用后菌落数
菌数下降log值
消毒剂作用后菌落数
菌数下降log值
消毒剂作用后菌落数
菌数下降log值
消毒剂作用后菌落数
菌数下降log值
消毒剂作用后菌落数
菌数下降log值
消毒剂作用后菌落数
菌数下降log值
1%新洁尔灭
75%乙醇
3%甲酚皂溶液
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