Slowing down DNA Translocation through a Nanopore in Lithium Chloride的译文.docx

资源描述

Slowing down DNA Translocation through a Nanopore in Lithium Chloride的译文.docx

《Slowing down DNA Translocation through a Nanopore in Lithium Chloride的译文.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Slowing down DNA Translocation through a Nanopore in Lithium Chloride的译文.docx（10页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

Slowing down DNA Translocation through a Nanopore in Lithium Chloride的译文.docx

SlowingdownDNATranslocationthroughaNanoporeinLithiumChloride的译文

氯化锂使DNA通过纳米孔的速度减慢

StefanW.Kowalczyk,DavidB.Wells,AlekseiAksimentiev和CeesDekker

NanoLett.,2012

摘要：

对于很多DNA检测和操作（如凝胶电泳和芯片实验）而言，DNA分子的电荷是一个重要参数，在本篇文献中，利用纳米孔迁移实验和全原子分子动力学模拟来研究因与反离子结合而造成的DNA电荷部分减少，我们惊奇地发现当反离子体积不断变小时，从钾离子到钠离子再到锂离子，DNA分子穿过固态纳米孔的速度显著下降，双链DNA和单链DNA均是如此。

分子动力学模拟阐明了这一效应的微观原理，锂离子和钠离子与DNA的结合能力比钾离子更强，这一发现使分辨率至少提高了十倍，为纳米孔的应用提供了实用性方法。

关键词纳米孔DNA有效电荷氯化锂单分子分子动力学

DNA和抗衡离子间的相互作用对其物理性质有极大影响已为人们熟知[1-2]。

尽管一阶近似值有价值，但是聚电解质反离子相互作用的传统模型（即Manning[1]和Poisson−Boltzmann[3]理论）忽视了相关的细节，例如DNA电荷的离散本质、阳离子的类型、离子和离子间的相互作用。

此处，采用纳米孔实验和全原子分子动力学模拟相结合的方法定量揭示不同反离子（（K+，Na+和Li+）对DNA分子电荷减少的影响，惊奇地发现不同的一价离子产生的影响大不相同。

纳米孔对于带电生物分子的检测和操作是通用工具[4-9]，在典型设备中，外部电场驱使分子通过合成薄膜上纳米级的孔，使得穿过孔的离子流发生特征性的临时改变。

然而，到目前为止实验中的主要难题是DNA穿孔速度太快，穿孔的平均速度由电泳力驱动，但反过来电泳力又由DNA所带电荷决定，电荷低的迁移速度慢，因而读出的准确率较高。

本篇论文采用纳米孔测定电解质对DNA电荷的影响。

图1（a）设备的侧面示意图，包括嵌入在硅晶片的一个独立的20nm氮化硅窗口（蓝色层），一旦施加穿过孔的电场，DNA就会迁移通过孔。

（b）分子动态模拟系统，显示了DNA分子，0.1MKCl溶液和8nm纳米孔。

灰色表面为二氧化硅，黄色范德华尔斯球体为DNA，其中，红色代表磷酸盐，蓝色代表氯离子，绿色代表钾离子，水未表示出来。

（c）实验数据跟踪示例。

一旦加入DNA就会出现尖峰电流，一个尖峰代表有单个DNA分子穿过孔，数据在120mV，1MKCl时取得，并在1kHz时过滤显示。

结论。

图1a为双链DNA在KCl,NaCl,或LiCl离子溶液中的纳米孔实验图，简单地说，单个纳米孔是用透射式电子显微镜的聚焦电子束在低压氮化硅薄膜上制得的（见辅助材料插图S1）。

将膜置于充满一价盐溶液的隔室中，连续通入约0.1V的跨膜电压，产生约10nA的电流，当有分子通过孔时电流会暂时减小。

在此研究中采用直径为15-20nm的纳米孔和I-V线性关系以及良好的噪声特性。

正如先前报道的略微不同的孔隙形状，纳米孔宽的一端的电导与阳离子迁移率几乎是成比例的（见辅助材料图S1I-V曲线）[11]，所有的实验经过多次重复，结果基本相同。

图1c显示了一个电流跟踪示例，一旦加入双链DNA就会出现电流尖峰，每个尖峰代表一个双链DNA分子通过孔隙。

图2a从左至右显示的是48.5kbp双链DNA在1MKCl，NaCl和LiCl盐溶液中电流的典型事件，有趣的是，事件振幅是相似的（约1-1.5nS；散点图见辅助材料S2），依次改变溶液为KCl，NaCl和LiCl，迁移时间大大增加。

图2d为迁移时间（τ）的柱状图。

我们发现对于1M溶液，双链DNA实验迁移时间的比率为KCl：

NaCl：

LiCl=1：

1.7：

4.8。

这是一篇震惊的观察报告，因为之前的人认为一价的钾、钠、锂离子行为非常相似。

注意，我们研究的是一价离子，而实验表明有二价离子（MgCl2）存在时，DNA会粘附在膜上，这并不出人意料，因为像Mg2+这样的二价离子经常被用于将DNA粘附在无机物的表面，如云母或二氧化硅。

图2实验时在LiCl中DNA迁移减慢。

（a）示例为48.5kbpλ-dsDNA在5kHz下过滤，1MKCl（左）,1MNaCl（中）和1MLiCl（右）时的电流记录。

（b）在1MLiCl,2MLiCl和4MLiCl中的电流记录，其他条件同（a）。

（c）经过热休克处理并加入8M尿素的M13mp18ssDNA，在30kHz下过滤的电流记录，其他条件同（a）。

（d-f）为与（a-c）相应的柱状图。

发现对于双链DNA，在1MKCl,1MNaCl,1MLiCl,2MLiCl和4MLiCl中迁移时间分别为τ=1.72±0.29,2.94±0.55,8.23±1.44,12.1±1.9和16.5±2.2；对于单链DNA，在1MKCl,NaCl和LiCl中，迁移时间分别为τ=52±10,71±13和530±190μs。

氯化锂的浓度越高，DNA迁移时间甚至更长，当氯化锂浓度分别为1M、2M、4M时，迁移时间比为1：

1.5：

2（见图2b典型事件和图2e迁移时间柱状图），另外还可以观察到盐溶液浓度越高，电流阻塞越大。

值得注意的是将纳米孔实验中的典型测量缓冲液（1MKCl）改变为4MLiCl可使DNA穿过纳米孔的速度降低10倍，这非常有利于提高读出分辨率，还发现随着所测迁移时间的增加，每秒钟电流阻塞的次数反而减少（见辅助材料图S3），可以理解为，在固定电压下，低带电物体的捕获概率减少[12]。

这些结果与DNA电泳迁移率的大量测量值是定性一致的[13]，然而，在纳米孔实验中离子类型影响更大。

其原因可能是大量的测量是在非常低的离子强度下（30mM）进行的，而在纳米孔实验中采用较高的离子强度，导致了更强的筛选。

对于单链DNA而言，不同溶液时事件振幅相似（散点图见辅助材料S2）。

为了确定7.2kb长圆形M1mp18单链DNA是在变性状态（无二级结构）下，实验前将单链DNA进行热休克处理，在8M尿素中测量（见材料和方法）。

测得事件振幅为1.5-2nS（示例事件见图2c），由于所用单链DNA是环形的，导致在穿孔的每个时间点存在两条单链DNA。

测得每条链的振幅约为1nS，表明单链DNA确实已变性[9]，因为在相近条件下未变性的单链DNA会产生较高（约10nS）的事件振幅，这是由于未变性的单链DNA形成大的斑区而阻塞在孔隙入口[14]。

通过改变溶质，单链DNA的迁移速度也减慢，这与双链DNA得到的结果相似，但从定量上更加明显，单链DNA迁移时间比为KCl：

NaCl：

LiCl=1：

1.4：

10.2（见图2f迁移时间柱状图）。

由于8M尿素溶液在盐浓度约为1.5M时饱和，因而不能进行在更高盐浓度时的研究。

应怎样理解只改变缓冲溶液（从KCl到LiCl）就会减慢DNA迁移速度这一显著而又出乎意料的结果？

为了说明DNA迁移速度依赖于电解液类型和浓度的微观原理，采用一些纳米系统的全原子分子动态模拟，每个系统都包含一个双链DNA片段，一个圆形纳米孔以及电解液，如图1b所示，从立体化角度看，每个系统都是周期性的，因此表现为无限的DNA分子限制在无限的纳米通道内。

从径切方向看，DNA片段协调地保持在接近孔的几何中心处；从轴向看，在大量DNA片段和纳米孔中心有附加的调和电位。

由于受到沿着纳米孔轴向的外加电场力，可以观察到DNA片段向电场方向的反方向移动，直到调和电位与电场施加于DNA的有效力平衡，材料和方法部分提供有模拟方法和拟定草案的详细描述。

用上面描述的设备模拟阻塞力，其依赖于电解液种类和浓度以及纳米孔直径，选择模拟阻塞力而不模拟迁移速率是因为实验中采用长链DNA（λ-DNA），其迁移速率取决于外界电场力与DNA受到的流体动力阻力的平衡，尽管随着迁移的进行，DNA迁移速率发生变化（增加），但假设流体动力阻力仅仅有赖于电解液的黏度，那么模拟的阻塞力应理想地与所测的由于黏度而变慢的迁移速率相一致。

图3分子动态模拟。

（a）离子浓度为4.0M时，迁移时间与孔径尺寸的函数关系。

可以看到无论孔径的大小，LiCl的迁移时间是最长的，其次是NaCl，最后是KCl，呈现一次线性关系。

（b）孔直径为16nm时，迁移时间与离子浓度的函数关系。

迁移时间τ由公式τ=αη/Fstall计算而得，其中η是溶液黏度，Fstall是分子动态模拟中确定的阻塞力，α=62μm2是一个参数，它与1MKCl，迁移时间为1.7ms的实验相对应。

得到与数据一致的一次直线。

图3a，b描绘的是模拟阻塞力与迁移时间的比较试验。

采用Stormetal将阻塞力转化为迁移时间，在此阻碍迁移的主要是未迁移DNA的粘性阻力，DNA的持久长度与离子条件无关[31]，因此，迁移时间τ可由τ=αη/Fstall计算而得，η是溶液黏度[33]，Fstall是由分子动态模拟决定的阻塞力，α=62μm2是实验中1.0MKCl迁移时间为1.7ms时的参数，模拟是在KCl，NaCl和LiCl浓度分别为0.1，0.5，1.0和4.0M，纳米孔直径为8，16和22nm的条件下进行的，模拟的结果与实验中观察到的定性一致，迁移速度依赖于盐的种类和浓度，如图3c。

图S4为迁移时间随实验电压的变化。

毫不奇怪，对于所有的溶液，正如之前用KCl时发现的结果一样，迁移时间总与施加的电压成反比。

无论孔径的大小，当孔径相同时，对于4.0M的LiCl，NaCl,KCl溶液而言，其阻塞力依次增大。

分子动态模拟准确的得到与我们之前一致的结果[35]，即随着孔直径的增加，阻塞力减小，见辅助材料的图S5.

图4（a）分子动态模拟中，离子浓度为4M，孔直径为8nm时，每个碱基上吸附的抗衡离子数随最小结合持续时间的变化。

通过一个中间的水分子，离子与DNA结合，可以看到瞬时的离子吸附数（即结合持续时间最小值为0）与离子类型无关，然而，当最小结合持续时间较大时，吸附的离子数目由多到少依次为锂离子、钠离子和钾离子。

（b）分子动态模拟中抗衡离子锂离子吸附在DNA上。

灰色代表DNA，黄色代表锂离子，红色和白色代表中间的水，图中仅显示了与吸附有关的水分子。

（c）孔直径为8nm，浓度均为4M的LiCl（•）,NaCl（■）和KCl（⧫）溶液的分子动态模拟中，结合持续时间对每个碱基上吸附离子数目作图。

每个数据点代表与单一类型的DNA原子结合，图中显示并示踪出吸附最多的五个位点，原子名称是用于CHARMM力场的那些，可以看到，改变离子类型后，每个结合位点结合的离子数基本相同，然而，结合强度高度依赖于离子类型，结合时间最久的是LiCl,其次是NaCl，最后是KCl。

值得注意的是尽管磷酸氧O1P和O2P结合离子数目最多（即n值大），但其结合强度相对较弱（即τ小），最持久的是小凹槽O4′。

（d）KCl浓度分别为0.1M（+）,1M（×）,and4M（⧫）时，结合持续时间对每个碱基上吸附吸附离子数作图。

可以看到，改变离子浓度，结合的离子数发生变化，但正如所料，结合强度不变。

为了研究有LiCl存在时DNA迁移减慢的微观机理，我们计算了动态分子模拟轨迹上DNA表面结合离子的平均数，在动态分子模拟轨迹中很少观察到离子直接与DNA结合，然而普遍存在的是离子与第一溶剂化层结合，见图4b。

图4a显示的是离子浓度为4.0M，纳米孔直径为8nm时，每个碱基吸附的抗衡离子数N随最小结合持续时间（见材料和方法）的变化，该图说明吸附离子的瞬时数目（最小结合持续时间为0ps）与离子类型无关。

而重要的是结合强度不相同，平均而言，结合强度由大到小依次为Li+、Na+、K+，例如，4.0MLiCl系统中，平均每个碱基上有0.5的锂离子结合时间不少于50ps，而4.0MKCl系统中，结合时间不少于50ps时，每个碱基上不足0.1钾离子，结合强度的不同导致合力不同，因此DNA在不同溶液中的迁移速度不同。

值得注意的是将氯离子考虑在内，当最小结合持续时间接近0ps时，每个碱基上结合的瞬间离子总数接近于1，见辅助材料图S6a。

与阳离子相比，氯离子更不易吸附在DNA表面，见辅助材料图S6b。

图5力转移时势垒高度的影响。

（a）模型系统，用微型模型代表DNA电荷，向离子施加按正弦曲线变化的电势，图中势垒高度为1and2kBT，电势的一个周期代表一个结合位点，图中显示的是三个结合位点，与DNA相似，模型系统中每6.4nm包含有20个结合位点。

（b）由电场力归一化,每个离子施加于电位的平均力随势垒高度的变化。

（c）与图4a相似，势垒高度为1,2和2.25kBT时的吸附曲线。

改变势垒高度对吸附时间和施加于代表DNA电势的有效力都会产生影响，实线是与数据相符的指数函数。

我们采用向离子施加周期性电压的方法来阐明离子与DNA不同结合强度对力转移的影响，如图5a。

电位代表分散在DNA分子上电荷的简化模型，分子动态模拟系统揭示不同势垒高度随离子施加于DNA分子表面电位的有效力和离子在每个结合位点停留时间的变化，图5b为Fapplied/qE，Fapplied是电位施加于每个离子的平均力强度（即离子施加于DNA分子表面电位的平均力），q是离子电荷，E是施加的电场强度。

势垒高度为0.25kBT时，离子对电位产生的力很小，因为热能和电能占主要地位，离子不能与结合位点紧紧结合，另一方面，势垒高度为2.25kBT时，离子产生几乎最大的力（qE），因为离子紧密并相对长时间的结合在每个结合位点，因此电场将力集中在DNA上而不是分散到溶液中去。

当势垒高度居中时，尽管所有的离子在所有时间都被吸附（即占据结合位点），仍可以看到力的全部范围。

图5c表征了当势垒高度取一些中间值时，吸附在势阱上的离子数目（与图4a比较）随结合持续时间的变化，这样的结果清楚地显示了势垒高度对DNA的影响，包括离子对DNA施加的有效力和电场中DNA的有效电荷。

通过考察单个位点进一步阐释抗衡离子和离子类型对DNA吸附的情况，为此绘制了吸附曲线图，以指数形式ne−t/τ表示的图4a适合于模拟中能看到的每个结合位点，n和t是相应的参数。

图4c，d为n最大，4.0MLiCl8nm系统时的五个位点，从图4c可以看到每个位点结合的离子数与离子类型无关，但结合持续时间τ为锂离子最长，其次为钠离子，最后是钾离子。

图4d显示的是离子浓度的影响，和预期的一样，离子浓度仅仅影响结合的离子数，而不影响结合持续时间。

讨论。

通过分子动态模拟与纳米孔迁移实验，我们表征了在一价电解质中DNA分子的有效电荷，虽然已经了解到DNA分子电荷对抗衡离子的化合价敏感[17-18]，此处我们论证抗衡离子的大小对DNA有效电荷有相当大的影响，从而影响穿孔的平均速度。

有人会问DNA之间的相互作用及DNA与纳米孔表面之间的相互作用是否会减慢平均穿孔速度，据报道，当孔非常小（直径远小于5nm）时，DNA与孔壁的相互作用会使DNA迁移减速[19-20]，同时导致事件具有很大的分散度[21]。

然而在我们的实例中采用直径约为20nm的大孔，这种影响还未有报道，而且由于膜表面和DNA都带负电荷，因此不会产生吸附。

事实上，通过用LiCl和KCl做石墨烯纳米孔实验[22]，我们得到相似的不同迁移速度，证实了减速是Li−DNA的内部作用，而不是由于外部原因，如吸附在SiN表面。

在分子水平上，我们发现由于抗衡离子的短暂结合而使DNA电荷部分中和。

虽然对于每种离子类型，DNA结合抗衡离子的数目相同，但是持续时间和强度却不同，事实上，与DNA结合时间最长的是锂，其次是钠，最后是钾，我们用一套简化的离子系统演示了结合强度的变化确实影响力从离子转移到DNA，从而影响DNA迁移速度，如果与直接的实验测量比较，KCl模拟系统定量地低估了DNA的净力，然而考虑到分子动态模拟模型的相对简单，已知的经典分子动态模拟（例如，将黏度低估3倍）中不合格的水模型以及阻塞力对离子与DNA相互作用的敏感性，模拟系统与实验的定性一致是令人满意的。

从实用角度，我们的结果表明在纳米孔应用中，LiCl相比传统用的离子溶液拥有更大的优势。

材料和方法。

1.分子动态模拟方法。

采用NAMD软件包[23]，2−2−6fs多重时间步长，CHARMM27参数[24]以及CMAP修正[25]，范德华尔斯7−8Å保险装置和短程静电力，经过1.0Å隔开网格计算得到的远程静电Ewald粒子网（PME）方法来完成所有的模拟，温度用Lowe-Andersen恒温器维持在295K，在NPT模拟中，Langevin活塞式方法用于2000fs的一段时间和200fs的衰退，离子参数由最近改善的BeglovandRoux离子参数生成[32]，每10ps保存轨迹帧数，用VMD完成视觉化和分析结果[26]。

模拟系统包括厚度为6.4nm的退火SiO2[27]阻塞物，沿着阻塞物的短轴心含有直径为8，16或22nm的圆形孔和0.1，0.5，1或4M的LiCl，NaCl或KCl离子溶液。

较大系统模拟中的孔与一个溶液池相连，溶液池中离子浓度与溶液本体浓度相同，系统包含20bp的随机序列，为了避免DNA与硅表面相互作用，DNA磷酸盐原子的质量中心放射性地控制在弹性参数为93.72kcalmol−1Å−2的孔中心，周期性边界条件是用于DNA共价键周期边界，有效地使模拟系统成为一个含有无限DNA的无限纳米孔，施加平行于纳米孔/DNA轴线的电场，报道的电势差异指的是单个6.4nm周期图像的差异，系统孔轴线方向不是完全受限，采用了零动力特性的NAMD[36]。

离子与DNA第二溶剂化层的结合按如下计算。

如果离子处在水的氧原子0.34nm以内，反过来，如果离子处在DNA重原子0.31nm处，那么则认为这个离子被绑定，这个距离由原子中心测量而得，相当于应用径向函数的最小值，当计算作为最小绑定持续时间的离子数目时，绑定是指相同的三种原子（离子，水氧原子和DNA重原子）在临近轨道结合在一起。

测得模型系统为2×2×6.4nm3，它仅含有40个离子（q=+1），没有水存在，应用周期边界条件，采用介电常数为80的NAMD模拟系统，对所有采用Tcl边界力的离子应用（U0/2）cos（2πmz/L）形式的正弦曲线电势[23]，势垒高度U0是在0.25−2.25kBT范围内的常数，z是沿着系统长轴的位置，m=20是结合位点数，系统以9.6ns运行，每个离子每48fs输出力，Langevin恒温器控制温度在295K，阻尼常数为5.0ps−1，沿着系统长轴方向施加500mV的电场，时间步长、保险装置和PME参数与全原子模拟所用一样，每次模拟中都记录电势施加于每个离子的平均力。

根据牛顿第三定律，力场强度等于施加于处于电场中DNA表面每个离子的力。

2.固态纳米孔。

固态纳米孔开始通过电子束光刻和湿法刻蚀，用20nm独立的SiN薄膜制作，采用透射电子显微镜的高度聚焦电子束在每个膜上制作所需尺寸大小的孔，制作过程详见别处[28]。

所报道的数据，关于双链DNA的是用15.3nm孔得到的，单链DNA的是用19.8nm孔得到的。

在用之前纳米孔两面均在氧等离子体中处理30s，随后，纳米孔安装在一个聚二醚酮（PEEK）微流体流动池中并且样品两侧都密封在液体隔室中。

测量是在室温下，pH值为8.0的规定摩尔浓度的氯化钾/氯化钠/氯化锂盐溶液中进行的，溶液中含有含有10mMTris-HCl和1mMEDTA，溶液黏度（分别为η=0.99,1.10,1.15×10−3Pa·s）差别不大。

二价离子的实验是在pH8.0，含有10mMTris-HCl和1mMEDTA的1MMgCl2溶液，Ag/AgCl电极用来检测离子电流并应用于电场，电流痕迹用电阻反馈放大器（Axopatch200B,AxonInstruments）在100kHz时测定，并在500kHz时数字化，必要时，进一步采用低通滤波器，仅用最小的低频电流噪声（<20PARMS）的孔[10]。

3.单链DNA的制备。

为了确保单链DNA中无二级结构，M13mp18环状DNA在90°C时进行10min热休克处理，这样一来移除了所有的二级结构，纳米孔实验中DNA的最后浓度是2ng/μL，测量在1M盐溶液中完成，其中添加了8M尿素来阻止单链DNA重新折叠。

由于黏度增加（8M尿素黏度为1.7×10−3Pa·s）和离子电泳淌度（总电流）与黏度的倒数成比例[30]，结果使宽孔电导比以前报道的减少了约40%（见辅助材料图S7）。