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整理生物化学酶
第五章酶
第一节概述
一、酶的概念
酶是由活性细胞产生的、具有高效催化能力和催化专一性的蛋白质，又叫生物催化剂。
酶（enzyme）是由生物细胞合成的,以蛋白质为主要成分的生物催化剂。
不同生物体所含的酶在种类和数量上各有不同，这种差异决定了生物的代谢类型。
二、酶催化作用的特点
1、酶与非生物催化剂的共性：
1）用量少、催化效率高。
2）都能降低反应的活化能。
3）能加快反应的速度，但不改变反应的平衡点。
4）反应前后不发生质与量的变化。
2、酶作为生物催化剂的特性
1）催化效率极高（immensecatalyticpower）
可用分子比（molecularratio）来表示，即每摩尔的酶催化底物的摩尔数。
酶反应的速度比无催化剂高108－1020倍，比其他催化剂高107－1013倍
酶作为催化剂比一般催化剂更显著地降低活化能，催化效率更高。
通常用酶的转换数（turnovernumber,TN，或催化常数Kcat）来表示酶的催化效率。
它们是指在一定条件下，每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，或每秒钟每微摩尔酶分子转换底物的微摩尔数。
Kcat:
103～106
2）高度的专一性（highlyspecific）∶所谓酶的专一性是酶对反应物（底物）的选择性
绝对专一性：
一种酶只能作用于特定的底物。
发生特定的反应，对其他任何物质都没有作用。
相对专一性：
有些酶的专一性较低，对具有相同化学键或成键基团的底物都具有催化性能。
立体异构专一性（光学专一性）：
几乎所有酶对立体异构物的作用都具有高度专一性。
内肽酶
胃蛋白酶R1，R1：
芳香族氨基酸及其他疏水
氨基酸（NH2端及COOH端
胰凝乳蛋白酶R1：
芳香族氨基酸及其他疏水氨
基酸（COOH端）
弹性蛋白酶R2：
丙氨酸，甘氨酸，丝氨酸等短
脂肪链的氨基酸（COOH端
胰蛋白酶R3：
碱性氨基酸（COOH端）
外肽酶
羧肽酶ARm：
芳香族氨基酸羧肽末端的肽键
羧肽酶BRm：
碱性氨基酸羧肽末端的肽键
氨肽酶
氨肽末端的肽键
二肽酶
要求相邻两个氨基酸上的α-氨基和α-羧基同时存在
3）反应条件温和
4）酶的催化活性是受调节控制的
5）酶不稳定，容易失活
2.酶的分类
（1）氧化-还原酶Oxidoreductase
氧化-还原酶催化氧化-还原反应。
主要包括脱氢酶（dehydrogenase）和氧化酶（Oxidase）。
如，乳酸（Lactate）脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。
（2）转移酶Transferase
转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。
例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。
（3）水解酶hydrolase
水解酶催化底物的加水分解反应。
主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。
例如，脂肪酶（Lipase）催化的脂的水解反应：
（4）裂合酶Lyase
裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。
主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。
例如，延胡索酸水合酶催化的反应。
（5）异构酶Isomerase
异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。
例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。
（6）合成酶LigaseorSynthetase
合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的形成反应。
这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。
A+B+ATP+H-O-H===A
例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。
丙酮酸+CO2
草酰乙酸
第二节酶的化学本质和结构
一、酶的化学本质
酶的化学本质是蛋白质.
根据酶分子的组成划分为：
单纯蛋白质的酶∶分子组成全为蛋白质。
（simpleenzymes）
结合蛋白质的酶∶分子组成中除蛋白质外，
（complexenzymes）还有非蛋白质部分。
1、酶的分子组成
根据酶的组成情况，可以将酶分为两大类：
单纯酶：
它们的组成为单一蛋白质.
结合酶：
其分子中除了蛋白质外，还含有非蛋白组分.
结合酶的蛋白质部分称为酶蛋白，非蛋白质部分包括辅酶及金属离子（或辅因子cofactor）。
酶蛋白与辅助成分组成的完整分子称为全酶。
单纯的酶蛋白无催化功能.
全酶（holoenzyme）=酶蛋白+辅助因子
apoenzymecofactor
金属离子metalion
辅助因子
小分子有机化合物
辅助因子本身无催化作用，但一般在酶促反应中起运输转移电子、原子或某些功能基团的作用。
小分子有机化合物：
辅酶coenzyme——与酶蛋白结合松弛，用透析法可以分开；
辅基prostheticgroup——与酶蛋白结合紧密
辅酶在酶促反应中的作用特点：
辅酶在催化反应过程中，直接参加了反应。
每一种辅酶都具有特殊的功能，可以特定地催化某一类型的反应。
同一种辅酶可以和多种不同的酶蛋白结合形成不同的全酶。
一般来说，全酶中的辅酶决定了酶所催化的类型（反应专一性），而酶蛋白则决定了所催化的底物类型（底物专一性）。
酶分子中的金属离子
根据金属离子与酶蛋白结合程度，可分为两类：
金属酶和金属激酶。
在金属酶中,酶蛋白与金属离子结合紧密。
如Fe2+/Fe3+、Cu+/Cu3、Zn2+、Mn2+、Co2等。
在酶促反应中传递电子，原子或功能团。
激酶是一种磷酸化酶类，在ATP存在下催化葡萄糖，甘油等磷酸化。
其中的金属离子与酶的结合一般较松散。
在溶液中，酶与这类离子结合而被激活。
金属离子对酶有一定的选择性,某种金属只对某一种或几种酶有激活作用。
2、酶的结构组成
根据酶蛋白分子的特点又可将酶分为三类∶
1）单体酶∶酶蛋白部分只有一条多肽链的酶称为单体酶（monomericenzyme）。
一般都是催化水解反应的酶。
它是一个具有完整生物功能的、具有独立三级结构的蛋白质分子。
分子量在13000-35000之间。
如∶溶菌酶、胰蛋白酶。
2）寡聚酶∶酶蛋白部分有一条以上多肽链的酶称为寡聚酶（oligomericenzyme）。
它以四级结构作为完整生物功能分子结构形式。
亚基可以是相同的，也可以是不同的。
亚基之间不是共价结合，彼此之间很容易分开。
分子量从35000到几百万。
如∶3-磷酸甘油醛脱氢酶。
3）多酶体系（multienzymesystem）：
由几种酶彼此嵌合形成的复合体。
它有利于一系列反应的连续进行。
这类多酶复合体分子量很高，一般在几百万以上。
如：
脂肪酸合成酶系
同工酶（Isozymes）
同工酶是指结构、性质不同，但却能催化相同的反应的两种或两种以上的酶群或酶型
同工酶一级结构上的差异是由遗传决定的。
它们的Km和Vmax各不相同
通常用电泳将它们分开
核酶（ribozyme）
抗体酶（abzyme）具有催化活性的抗体
二、酶分子的结构与功能
酶催化的高效率、高度专一性和酶活性可调节性都与酶蛋白本身的结构直接相关。
酶蛋白一级结构决定其空间结构，而酶的空间构象是酶催化功能的结构基础。
如果酶的高级结构被破坏（酶蛋白变性）、或某种功能基团被掩盖或破坏，酶即失去活性。
1、酶的活性部位（活性中心Activesites）
酶蛋白分子并不是所有基团都与酶的活性有关，只有少数特定AA残基的侧链基团和酶的催化活性由直接关系，这些功能基团称为酶的必需基团。
必需基团不一定在活性部位、有些在活性部位以外的地方起维持酶分子结构的作用。
酶的活性中心∶
在酶分子三级结构的构象中，有少数必需基团组成的，能与底物分子结合并完成特定催化反应的空间小区域，构成为酶的活性部位或酶的活性中心。
构成活性中心的必需基团主要是某些AA残疾的侧链基团。
有的必需基团负责与底物分子结合称之为结合基团或结合部位。
有些基团负责催化反应称之为催化基团或催化部位
必需基团：
这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。
活性部位：
酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位
活性中心：
酶分子三维结构上空间位置相互靠近的部位（空间构象）
结合部位：
底物与酶分子结合的部位
催化部位：
底物化学键发生化学变化的部位
酶活性中心的必需基团
主要包括：
亲核性基团：
含有多电子的原子，可以提供电子.如：
丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基。
它是十分有效的催化剂。
酸碱性基团：
天冬氨酸和谷氨酸的羧基，赖氨酸的氨基，酪氨酸的酚羟基，组氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巯基等。
2、酶的别构部位
有些酶分子除了有与底物结合的活性部位外，还具有与非底物的物质结合的部位。
这种部位有别与活性部位，而且与之结合的物质对其催化能力有调节作用，故称这个部位为别构部位或调节部位（allostericsite）。
具有别构部位的酶称为别构酶（allostericenzyme）：
与别构部位结合的物质为调节剂或别构剂（allostericmodulator）
3、酶原和酶原激活
某些酶（特别是蛋白酶）在细胞内合成时并无催化活性，经过一些酶和酸的作用后激活，才能变成具有活性的酶。
这些无催化活性的酶分子前体称之为酶原（zymogen）。
酶原的激活∶使酶原转变为具有活性酶的作用称为酶原的激活。
如∶胰蛋白酶原的激活
胃蛋白酶原的激活
第三节酶催化作用机制
酶和底物的相互作用和变化过程称之为酶的作用机制。
一、与酶高效催化作用有关的因素
1、底物与酶的接近与定向效应（CatalysisbyProximityandOrientation）∶
底物的反应基团与酶活性中心的催化基团相互严格的定向，使得活性中心的底物浓度特别高，从而使反应速度增高。
2、底物分子的敏感键产生张力或变形（CatalysisbyBondStrain）
酶分子中某些基团可使底物分子的敏感键中电子云密度部分的增加或减少从而产生“电磁张力”使敏感键更敏感，更易于反应。
3、共价催化作用（CovalentCatalysis）
某些酶能与底物形成一个反应活性很高的共价中间复合物。
底物只需越过较低的活化能就可以形成产物。
4、酸碱催化（CatalysisInvolvingAcidsandBases）:
这里指出的是广义的酸碱催化。
酶活性中心提供H+或提供H+受体使敏感键断裂的机制称酸碱催化。
酶活性中心的一些基团（氨基、羧基、酚羟基、咪唑基）可作为质子供体或受体对底物进行催化，从而加快反应速度。
5、活性中心部位的微环境效应
酶活性中心多半靠近位于疏水微环境地凹陷中，疏水环境中介电常数较低，故在疏水环境中两个带电物（底物、酶中心）之间的作用力显著增加，从而使反应速度加快。
以上几点都可加速反应，但每种酶不同，可同时具有其中的几种因素。
酶活性中心为疏水环境，电荷之间的作用力远远大于高电介环境，大大加强了酶的催化基团与底物分子间的作用力，因而有利于降低反应活化能。
有机物的电介常数为7-10，而水的电介常数为80。
不同酶起主要作用的因素可能不同，各自都有特点。
一般说：
多种因素联合作用才是整个反应加快的原因。
二、关于酶对作用底物的专一性
1.锁钥学说：
认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。
酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样
2.诱导契合学说：
该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状.
诱导契合机制：
A.靠近定向B.诱导契合C.产物脱离
第四节酶反应动力学
一、酶反应速度的测定
概念：
反应速率下降的原因：
[1]、底物浓度的降低
[2]、酶的部分失活
[3]、产物的抑制
[4]、逆反应速度的增加
二、底物浓度对酶反应速度的影响
Michaelis和Menten提出了底物对反应速度影响的数学表达式
[1]、底物浓度较低时一级反应（firstorder）V=k[S]
[2]、当S增大时混合级反应（mixedorder）
[3]、当S很大时0级反应（zeroorder）
V=Vmax
酶活性中心被底物饱和反应趋向于极限Vmax。
3、米氏方程的意义
（1）、Km（米氏常数）∶
酶的特征性常数之一。
一般只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。
不同的酶有不同的Km值，各种酶的Km值在0.001-1mmol/L或更高一些的区间。
物理意义：
使反应速度达到最大速度一半时的底物浓度。
即∶使反应系统中有一半的酶分子处于被底物饱和状态时所必须具有的底物浓度。
Km的单位是浓度单位（mol/L）。
（a）如果一个酶有几种底物，则对每一种底物，各有一个特定的Km值。
Km值最小的底物一般称为该酶的最适底物或天然底物。
Km值受温度、pH的影响。
因此，Km作为只是对一定的底物、一定的pH、一定的温度条件而言。
测定酶的Km值可以作为鉴别酶的一种手段但是必须在指定的实验条件下进行。
（b）Km值的大小可以反映酶与底物的亲和力。
Km值越小表明酶对底物的亲和力越大。
（c）Km与Ks值的关系∶
只有当速度常数k2>>k3时，Km=k2/k1=Ks
Km值实际上是指中间产物ES分解速度与形成速度的比值，而Ks值是指ES的解离常数。
（2）、关于Vm
Vm是酶的理论最大反应速度，也是一个重要的动力学常数。
米氏方程的用途：
[1]、由所要求的反应速度（应达到Vm的百分数）求出加入底物的合理浓度。
[2]、根据已知的底物浓度求出该条件的反应速度。
应注意:
米氏方程只能反应简单的单底物酶促反应。
（3）、动力学参数KmVm的求法
双倒数法
三、酶浓度对反应速度的影响
用酶量来控制生产时间
四、pH对酶促反应速度的影响
[1]酶活性中心基团的解离和酶的构象。
[2]影响底物的解离。
[3]过酸过碱影响酶分子的稳定性使酶失活。
最适pH（optimumpH）是酶的一个特征参数
五、温度对酶促反应的影响∶
[1]、同一般的化学反应一样，温度升高，速度加快（一般用Q10表示）。
[2]、温度高于一定温度时蛋白质变性，速度降低。
最适温度（optimumtemperature）不是酶的特性物理常数，它也不是一个固定值。
它受反应时间、酶浓度、底物浓度等因素的影响。
酶的热稳定性（heatstability）概念：
在一定条件下，不使酶变性或极少变性的温度和温度范围。
六、激活剂对酶促反应的影响
凡是能提高酶反应活性的物质都称为激活剂（activator）。
七、抑制剂（inhibitor）对酶反应速度的影响
1、酶的失活（inactivation）：
可使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用。
2、酶的去激活作用：
有些金属鳌合剂（如EDTA）通过去除酶的辅助因子而间接影响酶活性。
因为这些金属离子大多是酶的激活剂，故将这类对酶活性的影响称为去激活作用。
3、酶的抑制：
一些化学物质对酶蛋白或其辅基的直接作用，使酶活力下降，但并不引起酶蛋白变性的作用。
抑制剂：
某些物质，它们并不引起酶蛋白变性，但能使酶分子上某些必需基团（主要指酶活性中心的一些基团）发生变化，因而引起酶活力下降，甚至丧失，致使酶反应速度降低，能引起这种作用的物质称为抑制剂。
抑制剂的特点：
a.结构上与底物或底物的过渡状态相似。
b.能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体。
抑制作用的类型：
1、不可逆抑制作用（irreversibleinhibition）：
这类抑制剂通常以比较牢固的共价键与酶蛋白中的基团结合而使酶失活，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂，而恢复酶活性。
如∶有机磷、砷、汞等重金属。
2、可逆抑制作用（reversibleinhibition）：
这类抑制剂与酶蛋白结合时是可逆的，可用透析法除去抑制剂，恢复酶的活性。
可逆抑制可分为以下三类：
（1）竞争性抑制
某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竞争与酶活性中心结合。
当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。
竞争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。
（2）非竞争性抑制
酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。
由于这类物质并不是与底物竞争，所以称为非竞争性抑制剂。
如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。
（3）反竞争性抑制
抑制剂只能与ES结合形成无活性三元复合物ESI，而不能与游离酶结合。
这种情况与竞争性抑制相反，故称反竞争性抑制。
第五节酶活力的测定
一、酶活力、酶单位、比活力的概念
酶活力（也称酶活性）∶是指酶催化一定化学（enzymeactivity）的能力
1、酶活力与反应速度（reactionvelocity/rate）
酶活力的大小是用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的速度来表示的。
酶催化的反应速度越快，酶的活力越高
2、酶活力的单位（activityunit）
1961年国际生化学会酶学委员会规定：
在酶作用的最适条件下（最适底物、最适pH、最适缓冲液的离子强度及25℃）下，每分钟内催化1.0微摩尔底物转化为产物底酶量为一个国际酶活力的单位。
1972年国际生化协会酶学委员会推荐了一个新单位“katal”（简称kat）
即∶1个katal酶活力单位是指在特定的条件下，在1秒钟内能转化1mol底物的酶量。
Kat与U的换算关系如下∶
1kat=6×107U
1U=16.67nkat（n＝10－9）
3、比活力（specificactivity）
比活力的大小也就是酶含量（纯度）的大小，即每mg蛋白质所具有的酶活力，一般用U/mg蛋白来表示。
对于酶制剂来讲，有时也用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少个活力单位来表示（即U/g或U/ml）。
对同一种酶来说，比活力越高，表明酶越纯。
4、催化中心活性（转换数turnovernumber）∶
是指酶在底物饱和时，每分钟催化中心所转换底物的分子数。
κcat：
每秒钟每个酶分子转化底物的微摩尔数，在数值上κcat＝k3
二、酶活力测定法
常规测定酶活力的操作程序为：
[1]、样品酶液适当稀释。
[2]、在最适条件下进行酶促反应，并通过化学分析或仪器分析的方法测定反应物的消耗量或产物的生成量。
第六节酶的分离、纯化
目的：
[1]、为了研究酶的理化特性（包括结构与功能，生物学作用等）。
[2]、作为生化试剂及用作药物的酶，常常也要有较高的纯度。
胞内酶的分离提纯步骤：
1、选材
2、破碎细胞
3、抽取
4、分离及提纯[3]、根据酶单位定义和实验数据计算出酶活力。
在酶的纯化过程中应该注意∶
[1]、防止酶蛋白变性。
低温、快速、不能过度搅拌。
全部操作需在低温下进行，一般在0～5℃，用有机溶剂沉淀时，在零下15～20℃下进行。
[2]、随时测定酶活力和蛋白质含量，以便计算总活力和比活力。
[3]、酶制剂的纯度应与使用目的相适应。
5、纯化
除去杂蛋白及非蛋白杂质，并提高酶浓度常利用溶解性、电性、分子大小及某些条件下稳定性差异来纯化
1.盐析、分级盐析
2.有机溶剂沉淀
3.选择性变性沉淀
4.色谱法（层析法）
吸附色谱
包括离子交换色谱
凝胶过滤色谱
6、纯度鉴定
方法主要有：
电泳法
比活测定
注意相对纯的概念
7、保存
最后需将酶制剂浓缩、结晶，以便于保存。
[例题-2005年真题]《中华人民共和国环境影响评价法》规定，建设项目可能造成轻度环境影响的，应当编制（ ）。
酶制品一般应在-20℃下低温保存。
注意条件：
干燥、低温、避光、避氧
（2）生产、储存危险化学品（包括使用长输管道输送危险化学品）的建设项目；第七节固定化酶（immobilizedenzyme）
一、固定化酶概况
（二）安全预评价范围用物理或化学方法，将酶分子束缚在栽体上，使其即保持酶的天然活性，又便于与反应液分离，可以重复使用的酶，它是酶制剂中的一种新剂型。
优点：
[1]、极易将酶与底物，产物分开，简化了提纯工艺。
[2]、酶可以反复使用，并能装柱连续反应，有利于实现工艺连续化。
三、环境影响的经济损益分析[3]、在大多数情况下，可以提高酶的稳定性。
每名环境影响评价工程师申请登记的类别不得超过2个。
[4]、酶反应过程容易进行严格控制。
[5]、提高了酶的利用率，降低了成本。
缺点：
只能用于水溶性底物，适用于小分子底物。
（二）建设项目环境影响评价的工作等级二、固定化酶的制定方法
（3）环境影响技术评估。
1、载体结合法
用共价键，离子键或物理吸附法把酶固定在纤维素、琼脂糖、甲壳素、多孔玻璃或离子交换树脂等水不容性载体上。
（五）规划环境影响评价的跟踪评价2、交联法
（6）生态保护措施能否有效预防和控制生态破坏。
借助于双功能试剂的作用，使酶蛋白分子之间发生交联，结成网状结构而制成固定化酶。
3）应用污染物排放标准时，依据项目所属行业、环境功能区、排放的污染物种类和环境影响评价文件的批准时间确定采用何种标准。
综合性排放标准与行业性排放标准不交叉执行，即：
有行业排放标准的执行行业排放标准，没有行业排放标准的执行综合排放标准。
3、包埋法
将酶包埋的凝胶的微细格子中或用半透性的聚合物膜来包裹
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