高效好氧反硝化细菌的筛选鉴定及其反硝化反应条件脱氨氮特性的优化.docx

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高效好氧反硝化细菌的筛选鉴定及其反硝化反应条件脱氨氮特性的优化

高效好氧反硝化细菌的筛选鉴定及其反硝化反应条件、脱氨氮特性的优化

邵基伦1,曹　刚1,邹海明2（1.暨南大学环境学院,广东广州510630；2.安徽科技学院,安徽蚌埠233000）

摘要：

为了选择和研究一种好氧反硝化细菌，从我校师琴湖水中定向筛选好氧反硝化细菌,对分离得到的菌株进行初步鉴定,并研究了不同碳源、碳氮比、初始pH、接种量、转数以及温度等对其反硝化特性的影响。

结果表明,从初筛得到的35株具有反硝化活性的细菌中复筛得到一株具有较强反硝化能力的菌株ADB（AerobicDenitrificationBacteria）,该菌株属于假单胞菌属（Pseudomonassp.）。

在以乙醇为碳源、碳氮比15:

1,接种量1%,初始pH7.5,转数160r/min和温度30℃的条件下,脱氮效率最强,对模拟污水中硝酸盐氮和总氮的去除率分别为99.19%和53.83%。

同时该菌去除氨氮过程中也能降低化学需氧量（COD），并且不积累硝酸盐和亚硝酸盐．不同碳源种类下该菌株的脱氨氮能力从高到低顺序为：

丁二酸钠、乙酸钠、蔗糖、葡萄糖、柠檬酸三钠．除氨氮和COD的最适初始为pH7.5，最适温度为30℃．该菌株在最适条件下，24ｈ对氨氮的降解率可以达到100％，48ｈ对COD的降解率为73.44％．

关键词：

好氧反硝化；异养硝化；定向筛选;反硝化特性;假单胞菌属；氨氮

中图分类号：

　　　文献标识码：

A　　　文章编号：

Screeningandidentificationofaerobicdenitrifiersandtheoptimizationofdenitrificationconditionsandtakingoftheammonianitrogencharacteristics

Abstract:

AerobicdenitrifyingbacteriawereisolateddirectlyfromtheaquaculturewaterofShiqinglakeinourschool.Followingcharacterizingthephylogenyofthestrainswiththehighestdenitrifyingcapability,theeffectsofcarbonsource,C/Nratio,initialpH,inoculationquantity,rotationalspeedandtemperatureonthecharacteristicsofdenitrificationwerestudied.Theresultsshowedthat35strainsofaerobicdenitrifierswereobtainedbyprimaryscreeningonplatesofBromothymolBluemedium.OnestrainnamedADB,whichhadthehighestdenitrifyingcapabilitywasidentifiedaftersecondaryscreeningandwasdesignatedasPseudomonassp.Furthermore,theoptimumconditionsfordenitrificationwereasfollows:

carbonsourcesethanol,C/Nratio15:

1,inoculationquantity1%,initialpH7.5,rotationalspeed160r/min,andtemperature30℃.Undersuchcondition,theremovalrateofnitratenitrogenandtotalnitrogeninsimulationsewagewere99.19%and53.83%,respectively.Atthesametimethebacteriaintheprocessofremovingammonianitrogencanalsoreducechemicaloxygendemand（COD）,andnotaccumulationofnitrateandnitrite.Differentcarbonsourcetypethestrainstotakeofftheammonianitrogenabilityfromhightoloworder:

succinicacidsodium,aceticacidsodium,sucrose,glucose,citricacidthreesodium.ExcepttheammonianitrogenandtheoptimalinitialCODforPH7.5,thetemperaturefor30℃.Thestrainsintheoptimalcondition,24hofammonianitrogendegradationrateofupto100%,48hofthedegradationofCODratewas73.44%.

Keywords:

aerobicdenitrification;anaerobicnitrification;screening;denitrifyingcharacteristics;Pseudomonassp.;ammonianitrogen

1.引言

据统计，我国环境总体形势依然十分严峻．湖泊（水库）富营养化问题依然突出，在监测营养状态的26个湖泊（水库）中，富营养化状态的占42.3％．水体的富营养化问题主要由水体中的总氮超标所引起．由于氮元素污染的危害，脱氮已经成为水处理和防止氮素危害的重要一步．因此，生物脱氮是水处理中防止氮素危害最经济有效的方法之一．传统生物脱氮理论认为：

氨氮的去除是通过硝化和反硝化两个相互独立的过程实现的，由于对环境条件的要求不同，这两个过程不能同时发生，而只能序列式进行，即硝化反应发生在好氧条件下，反硝化反应则发生在严格的缺氧或厌氧条件下。

在这种理论指导下，传统的生物脱氮工艺都是将缺氧区（或厌氧区）与好氧区分隔开，如A/O系统。

在好氧区供氧充足，氨氮被硝化菌群氧化成硝酸盐氮，然后混合液一般被回流至前置式缺氧段；在缺氧条件下，反硝化菌利用硝酸盐氮和原污水中的有机物完成反硝化过程，达到脱氮的目的。

近些年来，不断有好氧反硝化细菌的分离报道，好氧反硝化现象的出现突破了传统理论的束缚，使人们对生物脱氮技术的发展有了全新的认识．已有文献报道一些好氧反硝化细菌同时具有异养硝化功能，这一发现为同时硝化反硝化工艺（simultaneousntrificationdenitrification，SND）发展奠定了理论基础．许多菌属诸如：

Pseudomonasstutzeri,Thiosphaerpantotropha,Alcaligenesfaecalis,Pseudomonasputida等都具有良好的异养硝化－好氧反硝化作用。

本研究将通过富集分离到一株具有好氧反硝化能力的细菌,命名该菌株为ADB．通过形态观察和序列分析，对菌株ADB进行初步鉴定。

初步探讨了不同碳源种类、碳氮比、pH值、温度对菌株ADB脱氨氮作用的影响.以期为后面的实现同时硝化反硝化工艺做前期的理论研究和污水生物脱氮技术的应用提供科学依据。

2.实验部分

2.1实验材料

2.1.1菌种来源好氧反硝化细菌ADB菌种为本实验室从我校师琴湖水中分离获得

2.1.2培养基

①反硝化细菌富集分离培养基成分（g/L）：

为Na2HPO4·7H2O为7.9；KH2PO4为1.5；NH4Cl为0.3；Mg2SO4·7H2O为0.1；丁二酸钠为4.7；KNO3为2；NaNO2为0.5；微量元素溶液为2mL。

②微量元素溶液成分（g/L）：

EDTA为50.0；ZnSO4为2.2；CaCl2为5.5；MnCl2·4H2O为5.06；FeSO4·7H2O为5.0；CuSO4·5H2O为1.57；CoCl2·6H2O为1.61；PH为7.0-7.5.

③反硝化测定培养基：

不添加KNO3和NH4Cl，初始亚硝酸氮质量浓度为100mg/L，其它与反硝化细菌富集分离培养基基本一致。

④脱氨氮测定培养基不添加KNO3和NaNO2，（NH4）2SO4代替NH4Cl，（NH4）2SO4和丁二酸钠含量随实验内容而变其它与反硝化细菌富集分离培养基基本一致。

2.2实验方法

2.2.1菌株的富集分离纯化　　称取1g水样接种到装有四粒玻璃珠和100ml灭菌的反硝化细菌富集分离培养基的250ml锥形瓶中，锥形瓶用九层纱布封口，在30℃、180r/min的摇床中振荡48h．经过四次重复的富集后，取0.5ml进行10倍梯度稀释到10-7，从10-5到10-7分别取100ul进行平板涂布于30℃电热恒稳培养箱培养48h．通过四次平板划线得到三株纯化的菌株，分别命名为ADB1、ADB2和ADB3。

2.2.2好氧反硝化菌株脱NO2--N的测定　　在3个装有100ml反硝化测定培养基的250ml锥形瓶中，以体积分数30％的接种量分别加入富集扩大培养后的菌液ADB1、ADB2和ADB3，锥形瓶置于30℃、180r/min的摇床上振荡培养，每隔2h取1次样测定亚硝酸盐氮的浓度，并计算亚硝酸盐氮的减少量及去除率，以时效比指标选择优势菌株．用格利斯试剂定性测定去除亚硝酸盐氮过程中是否有硝态氮产生。

2.2.3供试菌株的形态观察　　细菌形态观察根据《微生物学实验》进行鉴定。

2.2.4供试菌株的脱氨氮特性的研究

①供试菌株脱氨氮最适碳源种类试验　　分别以葡萄糖、蔗糖、乙酸钠、柠檬酸三钠、丁二酸钠为碳源，配制C/N质量比为2:

1，氨氮为100mg/l的培养基．250ml锥形瓶装液量、接种量、培养条件、离心参数等同上，在培养12h和24h测定其氨氮的去除率．

②供试菌株脱氨氮最适温度试验　　以丁二酸钠为碳源，配制COD为500mg/l、氨氮为100mg/l的培养基．250ml锥形瓶装液量、接种量、离心参数等同上，培养温度分别设定为20、25、30、35、37℃，摇床转速为180r/min，在分别培养12和24h测定其氨氮的去除率，48h测定其COD去除率．

③供试菌株脱氨氮最适pH试验　　培养温度为30℃，初始pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，其他试验设计同上．

④检测方法

NH4+-N：

纳氏试剂光度法；

NO2--N：

N－（1-萘基）－乙二胺光度法；

COD：

重铬酸钾法；

定性NO3--N：

格利斯试剂．

2.2.5好氧反硝化菌株的富集和定向筛选

取适量的样品加入装有100mL富集培养基（柠檬酸钠9.63g,硝酸钠0.85g,磷酸二氢钾1.36g,硫酸铵0.27g,酵母提取物1g,硫酸镁0.19g,微量元素1mL,加水至1L,PH7.3,121℃,灭菌30min的三角瓶（300mL）中,于30℃,160r/min摇床培养,3d后,取5mL富集培养液到新鲜的富集培养液中继续培养（此过程重复3次）。

富集后的样品经梯度稀释后涂布于溴百里酚蓝平板（BTB）（硝酸钾1g,柠檬酸钠1g,磷酸二氢钾1g,氯化亚铁0.05g,氯化钙0.2g,硫酸镁1g,BTB1mL（1%,用酒精溶解）,琼脂20g,加水至1L,pH7.3,121℃,灭菌30min）,30℃培养2-3d后,挑取蓝色和具有蓝色晕圈的单菌落,连续分离纯化,直到得到纯化菌株。

将纯化菌株接种到LB培养基中（各菌株设置3个平行）,待目测混浊时,将菌液置于无菌的离心管中,5000r/min,离心10min;弃去上清,用无菌水洗吹菌体后,再次离心（重复此操作3次）.以1%（V/V）的接种量接于DM反硝化培养液（KNO30.5g/L、KH2PO41g/L、MgSO4·7H2O1g/L、琥珀酸钠2.8g/L,121℃灭菌30min）中,于30℃,160r/min条件下,培养3d后进行相关指标检测。

2.2.6反硝化条件试验

①不同碳源对GC5反硝化活性的影响

采用DM反硝化培养基为基础培养基,分别加入葡萄糖、柠檬酸钠、乙酸钠、甲醇和乙醇为碳源,碳源终浓度为01585g·L-1。

其他条件为：

接种量1%、温度30℃,转速160r·min-1、装液量100mL（500mL三角瓶）。

每次试验各做3个平行组。

以不接菌的培养液作为空白对照。

摇瓶接种并培养3d后,检测氮元素变化指标。

②初始pH值和温度对GC5反硝化活性的影响

以乙醇为碳源的DM反硝化培养基,分别设不同初始pH值（分别为510,515,610,615,710,715,810,815,910,1010）和不同的温度（25℃,30℃,35℃,40℃）2组试验,探讨各自对反硝化活性的影响。

③分析方法

氨氮测定采用（GB7479）纳氏试剂分光光；度法；

硝态氮采用紫外分光光度法测定

亚硝酸盐氮采用（GB7493）N-（1-奈基）-乙二胺分光光度法；

总氮测定采用（GB11894）过硫酸钾氧化紫外分光光度法.

3.结果与分析

3.3.1好氧反硝化菌株脱NO2--N的测定

菌株WIT-1、WIT-2、WIT-3的去除NO2--N的结果如图1所示．由图1可知，在一定时间内，菌株WIT-1和WIT-2对亚硝酸盐氮有很好且较为稳定的去除效果．在去除亚硝酸盐氮过程中，经格利斯试剂定性测定WIT-1、WIT-2和WIT-3无硝态氮产生．可以判断菌株WIT-1、WIT-2和WIT-3为好氧反硝化菌株．比较WIT-1、WIT-2和WIT-3三条曲线，经计算菌株WIT-1、WIT-2和WIT-3在4h对NO2--N的去除率分别为99.995％、99.958％、33.082％，在10h内菌株WIT-3对NO2--N的去除率为99.999％．以时效比指标选择去除亚硝酸盐氮高优势菌株，菌株WIT-1能在短时间内去除亚硝酸盐氮．其次是菌株WIT-2和WIT-3．选择菌株WIT-1为进一步试验的供试菌株．

菌株ADB1形态观察

通过形态观察，菌株ADB1为革兰氏阴性菌，杆状，菌落为淡黄色

3.3.2脱氨氮条件的研究

①菌株ADB1脱氨氮最适碳源种类试验　

菌株WIT-1脱氨氮最适碳源种类试验，发现菌株WIT-1能够利用多种碳源进行脱氨氮．由图3可知，在12h以丁二酸钠为碳源其对氨氮的去除率最高为34.12％．在24h分别以蔗糖、乙酸钠、丁二酸钠为碳源其对氨氮的去除率都达到了100％．所以，丁二酸钠为菌株WIT-1的最适碳源．

②菌株WIT-1脱氨氮最适温度　　

在不同的温度条件脱氨氮的试验表明，菌株WIT-1在25～37℃之间时，能够最大程度地去除氨氮，24h氨氮的去除率在97％左右．WIT-1在20℃时，虽然能够最大程度地去除COD，其去除率为82.99％，但是其24H氨氮的去除率只有64.7％．说明低温不利于菌株WIT-1脱氨氮．在30℃时，其去除COD的能力高于25、35和37℃，COD去除率为70.73％．综合考虑菌株脱氨氮同时去除COD的能力，菌株WIT-1的最适温度为30℃．

③菌株ADB1脱氨氮最适pH值　　

在不同初始pH值条件下脱氨氮的试验表明，菌株WIT-1在pH值为7.0～7.5之间时，能够最大程度地去除氨氮，24h氨氮的去除率在100%.这说明该菌株在脱氨氮时适应于中性略偏碱性的环境．菌株WIT-1在pH值为6.5时，虽然能够最大程度地去除COD，其去除率为89.98％，但是其24h氨氮的去除率只有76.55%.综合考虑菌株脱氨氮同时去除COD的能力，菌株WIT-1的最适pH值为7.5.

3.3.3菌株的分离与纯化

通过反硝化细菌培养基共筛选、分离到具有反硝化作用的细菌35株。

定量实验显示其中14株菌有较强的的好氧反硝化活性（表1）。

由表1可知,NB13,NQ2,NQY3,NQY4,NQY6和GC5等6株菌的硝酸盐氮去除率都在88%以上,总氮去除率在20%~50%之间。

其中,菌株GC5的反硝化活性最强,在48h内硝酸盐氮的去除率高达9519%,总氮的降解率为4513%,故将此菌株确定为本试验的目标菌株。

反硝化条件的研究

①碳源对GC5反硝化活性的影响

不同碳源对菌株GC5反硝化作用影响的结果下图表明,以乙醇为碳源时,硝酸盐氮的去除率最高,达到90199%,说明乙醇是菌株GC5进行好氧反硝化作用的较适碳源。

②初始pH值对GC5反硝化活性的影响

随着培养基初始pH值的升高,硝酸盐氮的去除率也随着提高（图32a）。

当培养液的初始pH值在510时,GC5基本无反硝化活性,当pH值在715~1010时,硝酸盐的去除率均超过92%,表明菌株GC5在中性至碱性较广的pH值范围下,均有较强的反硝化活性。

其中在初始pH值为715时,硝酸盐的去除率高达93141%,菌株GC5的反硝化活性最高。

③温度对GC5反硝化活性的影响

从图42b可以看出,温度对菌株GC5降解硝酸盐氮的影响并不是很明显。

温度在30~40℃时,硝酸盐氮的去除率均在90%以上。

其中,当温度为30℃时,硝酸盐氮的去除率高达96127%。

3.3.4反硝化工艺的优化

根据单因素的试验结果,对显著影响反硝化活性的因素如碳源、初始pH值和温度等探究。

结果表明（表2）,影响GC5反硝化活性的最主要因素为C,即碳氮比,反硝化活性最优的试验组是A3B1C3,即接种量110%、初始pH值为715、碳氮比15B1,此时硝酸盐氮的去除率为98120%。

但由3因素的水平趋势图可知（图5）,GC5反硝化的理论最优条件为A3B3C3,即接种量110%,pH值为815、碳氮比15B1。

两组条件中,pH值不一致（这是因为3个主效因素中某2个之间存在交互效应）,因此对这2组条件进行验证试验,每组重复3次,每个重复3个平行。

验证试验结果表明（表3）,A3B1C3组的硝酸盐氮和总氮的去除率都比A3B3C3的高,分别为99119%和53183%,即理论最优条件不及正交试验获得的最优条件,因此GC5最优的反硝化条件为:

以乙醇为碳源、碳氮比15B1、初始pH715,接种量为1%、转数160r·min-1、温度30℃。

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