高效好氧反硝化细菌的筛选鉴定及其反硝化反应条件脱氨氮特性的优化.docx

1、高效好氧反硝化细菌的筛选鉴定及其反硝化反应条件脱氨氮特性的优化高效好氧反硝化细菌的筛选鉴定及其反硝化反应条件、脱氨氮特性的优化邵基伦1, 曹刚1 , 邹海明2 (1.暨南大学环境学院,广东 广州 510630； 2.安徽科技学院,安徽 蚌埠 233000)摘要：为了选择和研究一种好氧反硝化细菌，从我校师琴湖水中定向筛选好氧反硝化细菌, 对分离得到的菌株进行初步鉴定, 并研究了不同碳源、碳氮比、初始pH、接种量、转数以及温度等对其反硝化特性的影响。结果表明, 从初筛得到的35株具有反硝化活性的细菌中复筛得到一株具有较强反硝化能力的菌株ADB(Aerobic Denitrification Bac

2、teria),该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。在以乙醇为碳源、碳氮比15 :1, 接种量1%, 初始pH 7.5, 转数160 r/min 和温度30的条件下, 脱氮效率最强, 对模拟污水中硝酸盐氮和总氮的去除率分别为99.19%和53.83%。同时该菌去除氨氮过程中也能降低化学需氧量（COD），并且不积累硝酸盐和亚硝酸盐不同碳源种类下该菌株的脱氨氮能力从高到低顺序为：丁二酸钠、乙酸钠、蔗糖、葡萄糖、柠檬酸三钠除氨氮和COD的最适初始为pH7.5，最适温度为30该菌株在最适条件下，24对氨氮的降解率可以达到100，48对COD的降解率为73.44关键词：好氧反硝化；异养

3、硝化；定向筛选; 反硝化特性; 假单胞菌属；氨氮中图分类号：文献标识码：A文章编号：Screening and identification of aerobic denitrifiers and the optimization of denitrification conditions and taking of the ammonia nitrogen characteristicsAbstract: Aerobic denitrifying bacteria were isolated directly from the aquaculture water of Shiqing lak

4、e in our school. Following characterizing the phylogeny of the strains with the highest denitrifying capability, the effects of carbon source, C/ N ratio, initial pH, inoculation quantity, rotational speed and temperature on the characteristics of denitrification were studied. The results showed tha

5、t 35 strains of aerobic denitrifiers were obtained by primary screening on plates of Bromothymol Blue medium. One strain named ADB, which had the highest denitrifying capability was identified after secondary screening and was designated as Pseudomonas sp. Furthermore , the optimum conditions for de

6、nitrification were as follows: carbon sources ethanol, C/ N ratio 15:1, inoculation quantity 1%, initial pH 7.5, rotational speed 160 r/min, and temperature 30. Under such condition, the removal rate of nitrate nitrogen and total nitrogen in simulation sewage were 99.19% and 53.83%, respectively. At

7、 the same time the bacteria in the process of removing ammonia nitrogen can also reduce chemical oxygen demand (COD),and not accumulation of nitrate and nitrite. Different carbon source type the strains to take off the ammonia nitrogen ability from high to low order: succinic acid sodium, acetic aci

8、d sodium, sucrose, glucose, citric acid three sodium. Except the ammonia nitrogen and the optimal initial COD for PH7.5,the temperature for 30.The strains in the optimal condition,24h of ammonia nitrogen degradation rate of up to 100%,48h of the degradation of COD rate was 73.44%. Key words: aerobic

9、 denitrification; anaerobic nitrification;screening; denitrifying characteristics; Pseudomonas sp.; ammonia nitrogen1. 引 言据统计，我国环境总体形势依然十分严峻湖泊（水库）富营养化问题依然突出，在监测营养状态的26个湖泊（水库）中，富营养化状态的占42.3水体的富营养化问题主要由水体中的总氮超标所引起由于氮元素污染的危害，脱氮已经成为水处理和防止氮素危害的重要一步因此，生物脱氮是水处理中防止氮素危害最经济有效的方法之一传统生物脱氮理论认为：氨氮的去除是通过硝化和反硝化两个相互

10、独立的过程实现的，由于对环境条件的要求不同，这两个过程不能同时发生，而只能序列式进行，即硝化反应发生在好氧条件下，反硝化反应则发生在严格的缺氧或厌氧条件下。在这种理论指导下，传统的生物脱氮工艺都是将缺氧区(或厌氧区)与好氧区分隔开，如A/O系统。在好氧区供氧充足，氨氮被硝化菌群氧化成硝酸盐氮，然后混合液一般被回流至前置式缺氧段；在缺氧条件下，反硝化菌利用硝酸盐氮和原污水中的有机物完成反硝化过程，达到脱氮的目的。近些年来，不断有好氧反硝化细菌的分离报道，好氧反硝化现象的出现突破了传统理论的束缚，使人们对生物脱氮技术的发展有了全新的认识已有文献报道一些好氧反硝化细菌同时具有异养硝化功能，这一发现为

11、同时硝化反硝化工艺（simultaneous ntrification denitrification，SND）发展奠定了理论基础许多菌属诸如：Pseudomonas stutzeri, Thiosphaerpantotropha, Alcaligenes faecalis, Pseudomonas putida等都具有良好的异养硝化好氧反硝化作用。本研究将通过富集分离到一株具有好氧反硝化能力的细菌,命名该菌株为ADB通过形态观察和序列分析，对菌株ADB进行初步鉴定。初步探讨了不同碳源种类、碳氮比、pH值、温度对菌株ADB脱氨氮作用的影响. 以期为后面的实现同时硝化反硝化工艺做前期的理论研究和

12、污水生物脱氮技术的应用提供科学依据。2. 实验部分2.1 实验材料2.1.1 菌种来源 好氧反硝化细菌ADB菌种为本实验室从我校师琴湖水中分离获得2.1.2 培养基 反硝化细菌富集分离培养基成分(g/L)：为Na2HPO47H2O为7.9；KH2PO4为1.5；NH4Cl为0.3；Mg2SO47H2O为0.1；丁二酸钠为4.7；KNO3为2；NaNO2为0.5；微量元素溶液为2mL。微量元素溶液成分(g/L)：EDTA为50.0；ZnSO4为2.2；CaCl2为5.5；MnCl24H2O为5.06；FeSO47H2O为5.0；CuSO45H2O为1.57；CoCl26H2O为1.61；PH为7

13、.0-7.5 . 反硝化测定培养基：不添加KNO3 和NH4Cl，初始亚硝酸氮质量浓度为100mg/L，其它与反硝化细菌富集分离培养基基本一致。脱氨氮测定培养基不添加KNO3和NaNO2，(NH4)2SO4代替NH4Cl，(NH4)2SO4和丁二酸钠含量随实验内容而变其它与反硝化细菌富集分离培养基基本一致。2.2 实验方法2.2.1 菌株的富集分离纯化称取1g 水样接种到装有四粒玻璃珠和100ml 灭菌的反硝化细菌富集分离培养基的250ml 锥形瓶中，锥形瓶用九层纱布封口，在30、180 r/min的摇床中振荡48h经过四次重复的富集后，取0.5ml进行10倍梯度稀释到10-7，从10-5到1

14、0-7分别取100ul进行平板涂布于30电热恒稳培养箱培养48h通过四次平板划线得到三株纯化的菌株，分别命名为ADB1、ADB2和ADB3。2.2.2 好氧反硝化菌株脱NO2-N的测定在3个装有100ml反硝化测定培养基的250ml锥形瓶中，以体积分数30的接种量分别加入富集扩大培养后的菌液ADB1、ADB2和ADB3，锥形瓶置于30、180 r/min的摇床上振荡培养，每隔 2h 取1次样测定亚硝酸盐氮的浓度，并计算亚硝酸盐氮的减少量及去除率，以时效比指标选择优势菌株用格利斯试剂定性测定去除亚硝酸盐氮过程中是否有硝态氮产生。2.2.3 供试菌株的形态观察细菌形态观察根据微生物学实验进行鉴定。

15、2.2.4 供试菌株的脱氨氮特性的研究供试菌株脱氨氮最适碳源种类试验分别以葡萄糖、蔗糖、乙酸钠、柠檬酸三钠、丁二酸钠为碳源，配制C/N 质量比为2:1 ，氨氮为100 mg/l的培养基250ml 锥形瓶装液量、接种量、培养条件、离心参数等同上，在培养12h 和24h 测定其氨氮的去除率供试菌株脱氨氮最适温度试验以丁二酸钠为碳源，配制COD为500 mg/l、氨氮为100 mg/l的培养基250ml锥形瓶装液量、接种量、离心参数等同上，培养温度分别设定为20、25、30、35、37 ，摇床转速为180 r/min，在分别培养12和24h 测定其氨氮的去除率，48h 测定其COD 去除率供试菌株脱

16、氨氮最适pH试验培养温度为30 ，初始pH 分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，其他试验设计同上检测方法NH4+-N：纳氏试剂光度法；NO2-N：N（1-萘基）乙二胺光度法；COD：重铬酸钾法；定性NO3-N：格利斯试剂2.2.5 好氧反硝化菌株的富集和定向筛选 取适量的样品加入装有100mL富集培养基(柠檬酸钠9.63g,硝酸钠0.85g,磷酸二氢钾1.36g,硫酸铵0.27 g, 酵母提取物1g,硫酸镁0.19 g,微量元素1mL ,加水至1 L,PH7.3,121,灭菌30min的三角瓶(300mL)中,于30,160r/min摇床培养,3d后,取5mL富集培养液到新鲜的富集培

17、养液中继续培养(此过程重复3次)。富集后的样品经梯度稀释后涂布于溴百里酚蓝平板(BTB)(硝酸钾1g,柠檬酸钠1g,磷酸二氢钾1g,氯化亚铁0.05g,氯化钙0.2g,硫酸镁1g,BTB1mL(1%,用酒精溶解),琼脂20g,加水至1 L,pH7.3,121,灭菌30min),30培养2-3d后,挑取蓝色和具有蓝色晕圈的单菌落,连续分离纯化,直到得到纯化菌株。将纯化菌株接种到LB培养基中(各菌株设置3个平行),待目测混浊时,将菌液置于无菌的离心管中,5000r/min,离心10 min;弃去上清,用无菌水洗吹菌体后,再次离心(重复此操作3次).以1% ( V/V) 的接种量接于DM 反硝化培养

18、液( KNO3 0.5 g/L、KH2PO4 1 g/L、MgSO47H2O 1g/L 、琥珀酸钠2.8 g/L, 121灭菌30min) 中, 于30, 160 r/min条件下,培养3d后进行相关指标检测。2.2.6 反硝化条件试验不同碳源对GC5 反硝化活性的影响采用DM 反硝化培养基为基础培养基, 分别加入葡萄糖、柠檬酸钠、乙酸钠、甲醇和乙醇为碳源, 碳源终浓度为0 1585 gL -1。其他条件为：接种量1% 、温度30 , 转速160 rmin - 1、装液量100 mL( 500 mL 三角瓶) 。每次试验各做3 个平行组。以不接菌的培养液作为空白对照。摇瓶接种并培养3 d 后,

19、 检测氮元素变化指标。初始pH 值和温度对GC5 反硝化活性的影响以乙醇为碳源的DM 反硝化培养基, 分别设不同初始pH 值( 分别为5 10,5 15, 6 10, 6 15, 7 10, 7 15, 8 10, 8 15, 9 10, 10 10) 和不同的温度( 25 , 30 , 35 , 40 ) 2 组试验, 探讨各自对反硝化活性的影响。分析方法氨氮测定采用(GB 7479 ) 纳氏试剂分光光；度法； 硝态氮采用紫外分光光度法测定 亚硝酸盐氮采用(GB 7493 ) N-(1-奈基) -乙二胺分光光度法；总氮测定采用(GB 11894 ) 过硫酸钾氧化紫外分光光度法.3. 结果与分

20、析3.3.1 好氧反硝化菌株脱NO2-N的测定菌株WIT-1、WIT-2、WIT-3 的去除NO2-N的结果如图1所示由图1可知，在一定时间内，菌株WIT-1和WIT-2对亚硝酸盐氮有很好且较为稳定的去除效果在去除亚硝酸盐氮过程中，经格利斯试剂定性测定WIT-1、WIT-2和WIT-3无硝态氮产生可以判断菌株WIT-1、WIT-2和WIT-3 为好氧反硝化菌株比较WIT-1、WIT-2和WIT-3 三条曲线，经计算菌株WIT-1、WIT-2和WIT-3 在4h 对NO2-N 的去除率分别为99.995 、99.958 、33.082 ，在10h 内菌株WIT-3对NO2-N的去除率为99.99

21、9 以时效比指标选择去除亚硝酸盐氮高优势菌株，菌株WIT-1能在短时间内去除亚硝酸盐氮其次是菌株WIT-2和WIT-3选择菌株WIT-1为进一步试验的供试菌株菌株ADB1形态观察通过形态观察，菌株ADB1为革兰氏阴性菌，杆状，菌落为淡黄色3.3.2 脱氨氮条件的研究 菌株ADB1脱氨氮最适碳源种类试验菌株WIT-1脱氨氮最适碳源种类试验，发现菌株WIT-1能够利用多种碳源进行脱氨氮由图3可知，在12h 以丁二酸钠为碳源其对氨氮的去除率最高为34.12在24h 分别以蔗糖、乙酸钠、丁二酸钠为碳源其对氨氮的去除率都达到了100所以，丁二酸钠为菌株WIT-1的最适碳源 菌株WIT-1脱氨氮最适温度在

22、不同的温度条件脱氨氮的试验表明，菌株WIT-1在2537之间时，能够最大程度地去除氨氮，24h氨氮的去除率在97左右WIT-1在20时，虽然能够最大程度地去除COD，其去除率为82.99，但是其24H氨氮的去除率只有64.7说明低温不利于菌株WIT-1脱氨氮在30时，其去除COD的能力高于25、35和37，COD去除率为70.73综合考虑菌株脱氨氮同时去除COD的能力，菌株WIT-1的最适温度为30 菌株ADB1脱氨氮最适pH值在不同初始pH 值条件下脱氨氮的试验表明，菌株WIT-1 在pH 值为7.07.5之间时，能够最大程度地去除氨氮，24h 氨氮的去除率在100%. 这说明该菌株在脱氨氮

23、时适应于中性略偏碱性的环境菌株WIT-1 在pH值为6.5 时，虽然能够最大程度地去除COD，其去除率为89.98 ，但是其24h 氨氮的去除率只有76.55%. 综合考虑菌株脱氨氮同时去除COD的能力，菌株WIT-1 的最适pH值为7.5.3.3.3 菌株的分离与纯化通过反硝化细菌培养基共筛选、分离到具有反硝化作用的细菌35 株。定量实验显示其中14株菌有较强的的好氧反硝化活性( 表1) 。由表1可知, NB13, NQ2, NQY3, NQY4, NQY6 和GC5 等6 株菌的硝酸盐氮去除率都在88%以上, 总氮去除率在20% 50% 之间。其中, 菌株GC5 的反硝化活性最强, 在48

24、 h 内硝酸盐氮的去除率高达95 19% , 总氮的降解率为45 13% , 故将此菌株确定为本试验的目标菌株。反硝化条件的研究 碳源对GC5 反硝化活性的影响不同碳源对菌株GC5 反硝化作用影响的结果下图表明, 以乙醇为碳源时, 硝酸盐氮的去除率最高, 达到90 199% , 说明乙醇是菌株GC5进行好氧反硝化作用的较适碳源。 初始pH 值对GC5 反硝化活性的影响随着培养基初始pH 值的升高, 硝酸盐氮的去除率也随着提高( 图3 2a ) 。当培养液的初始pH 值在5 10 时, GC5 基本无反硝化活性, 当pH值在7 15 10 10 时, 硝酸盐的去除率均超过92% , 表明菌株GC

25、5 在中性至碱性较广的pH 值范围下, 均有较强的反硝化活性。其中在初始pH 值为7 15 时, 硝酸盐的去除率高达93 141% ,菌株GC5 的反硝化活性最高。 温度对GC5 反硝化活性的影响从图4 2b 可以看出, 温度对菌株GC5 降解硝酸盐氮的影响并不是很明显。温度在30 40 时, 硝酸盐氮的去除率均在90% 以上。其中, 当温度为30 时, 硝酸盐氮的去除率高达96 127% 。3.3.4 反硝化工艺的优化根据单因素的试验结果, 对显著影响反硝化活性的因素如碳源、初始pH值和温度等探究。结果表明( 表2) , 影响GC5 反硝化活性的最主要因素为C, 即碳氮比, 反硝化活性最优的

26、试验组是A3B1C3 , 即接种量1 10%、初始pH 值为7 15、碳氮比15 B1, 此时硝酸盐氮的去除率为98 120% 。但由3 因素的水平趋势图可知( 图5) , GC5 反硝化的理论最优条件为A3B3C3 ,即接种量1 10% , pH 值为8 15、碳氮比15 B1。两组条件中, pH 值不一致( 这是因为3 个主效因素中某2 个之间存在交互效应) , 因此对这2 组条件进行验证试验, 每组重复3 次, 每个重复3 个平行。验证试验结果表明( 表3) , A3B1C3 组的硝酸盐氮和总氮的去除率都比A3B3C3 的高, 分别为99 119% 和53 183% , 即理论最优条件不

27、及正交试验获得的最优条件, 因此GC5 最优的反硝化条件为: 以乙醇为碳源、碳氮比15 B1、初始pH 7 15, 接种量为1% 、转数160 rmin -1、温度30。参考文献1 苏俊峰，马放，高珊珊，等好氧反硝化细菌处理硝酸盐废水的研究及微生物群落结构分析 J .应用基础与工程科学学报，（）：2 蔡昌凤, 梁磊. 高效好氧反硝化细菌的筛选及脱氮特性的研究 J .环境科学与技术, 2011, 34(1):42.3 沈萍, 陈向东. 微生物学实验M. 4版. 北京：高等教育出版社, 2007:81.4 国家环保局水和废水监测分析方法编委会编水和废水监测分析方法M. 4版北京：中国环境科学出版社

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