实验报告.docx
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实验报告
实验报告
实验一金黄色葡萄球菌菌种的活化培养
一、实验目的
将金黄色葡萄球菌菌种活化培养
二、实验材料
2.1金黄色葡萄球菌菌种
2.2液体培养基
2.3主要试剂
营养肉汤:
牛肉浸膏4g；蛋白胨10g；葡萄糖5g；NaCl5g；蒸馏水1000ml,pH=7.4。
营养琼脂:
牛肉浸膏4g;蛋白胨10g;NaCl5g;琼脂25g;蒸馏水1000ml,pH=7.4。
1mol/L氢氧化钠：
称取40g氢氧化钠溶于1000ml蒸馏水中。
1mol/L盐酸：
移取浓盐酸90ml，用蒸馏水稀释至1000ml。
2.4仪器设备试管、量筒、烧杯、电子天平、药匙、称量纸、玻璃棒、电炉、石棉网、锥形瓶、棉塞、牛皮纸、棉线、高压灭菌锅、接种钩、酒精灯、火柴。
三、实验方法
3.1营养肉汤的制备
牛肉浸膏4g；蛋白胨10g；葡萄糖5g；NaCl5g；蒸馏水1000ml,pH=7.4。
将上述成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，调节PH，分装锥形瓶，121℃高压灭菌15min。
灭菌后冷却到约50℃，分装锥形瓶中培养基冷却备用。
3.2接种及培养
在无菌操作条件下，用接种钩挑取少许金黄色葡萄球菌菌种，接种在营养肉汤中，塞上塞子，贴好标签。
将试管置于36℃生化培养箱中培养2天。
3.3观察
观察金黄色葡萄球菌生长情况
四、实验结果
金黄色葡萄球菌生长良好，浅黄色，液体均匀。
实验二金黄色葡萄球菌的液体发酵培养
一、实验目的
将金黄色葡萄球菌扩大化培养
二、实验材料
2.1菌种活化后的金黄色葡萄球菌菌种。
2.2发酵用液体培养基营养肉汤：
蛋白胨；牛肉膏粉；酵母膏粉；葡萄糖；蒸馏水
2.3主要器材
高压灭菌锅、无菌操作台、250ml锥形瓶、烧杯、量筒、接种钩、纱布、牛皮纸、棉线等。
三、实验方法
3.1液体培养基的制备
营养肉汤：
蛋白胨10g;牛肉膏粉8g；酵母膏粉4g；葡萄糖20g;蒸馏水1000ml最终PH7.4，分装后121℃高压灭菌15min-20min。
3.2接种
接种操作前，把接种时需要的所有材料（菌种除外）置于无菌操作台，打开紫外灯和风机，进行30分钟的空间灭菌。
空间灭菌完后，关闭紫外灯，按照无菌操作的严格要求用接种钩从试管中取出适量的菌种接入装有营养肉汤培养基的锥形瓶中。
3.3培养
接种后，把锥形瓶置于36℃的恒温培养箱中培养48h。
四、实验结果
锥形瓶中培养基变浑浊，金黄色葡萄球菌生长良好，较均匀，不是很密集，也不稀薄。
实验三平板菌落计数法测金黄色葡萄球菌的菌落数
一、实验目的
通过平板计数测出系列样品匀液中金黄色葡萄球菌的菌落数，为标准曲线的制作做准备。
二、实验材料
2.1设备和材料
恒温培养箱：
36℃±1℃
冰箱：
2℃-5℃
恒温水浴箱：
46℃±1℃
天平：
感量0.1g
均质器
振荡器
无菌吸管：
1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸头
无菌锥形瓶：
容量250ml、500ml
无菌培养皿：
直径90mm
PH计或PH比色管或精密PH试纸
放大镜或菌落计数器
2.2培养基和试剂
1）平板计数琼脂培养基：
营养琼脂培养基
2）无菌生理盐水：
称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
3）1mol/L氢氧化钠：
称取40g氢氧化钠溶于1000ml蒸馏水中。
4）1mol/L盐酸：
移取浓盐酸90ml，用蒸馏水稀释至1000ml。
5）乳酸菌用液体培养基：
营养肉汤
三、实验方法
3.1平板计数的预检测
①样品的稀释：
以无菌吸管吸取25ml样品（样品取完置于冰箱中保存）置盛有225ml生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1：
10的样品匀液。
用1ml无菌吸管或微量移液管吸取1：
10样品匀液1ml，沿管壁缓慢注于盛有9ml稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用一支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：
100的样品匀液。
按上述操作，制备10倍系列稀释样品匀液。
每递增稀释一次，换用一次1ml无菌吸管或吸头。
②选择最后3个稀释度的样品匀液，每个稀释度分别吸取1ml样品加入三个无菌平皿内。
同时分别取1ml稀释液加入三个无菌平皿作空白对照。
③及时将15-20ml冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
④培养琼脂凝固后，将平板翻转，36℃培养48h。
⑤菌落计数
可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。
菌落计数以CFU表示。
选取菌落数在30CFU-300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。
低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300的可记录为多不可计。
每个稀释度的菌落数应采用三个平板的平均数。
其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布有很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
当平板上出现菌落间无明显界限的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
⑥菌落总数的计算
若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算三个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应的稀释倍数，作为每毫升中菌落总数结果。
若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式
（1）计算：
N=ΣC/（n1+0.1n2）d
（1）
式中：
N——样品中的菌落数；
ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；
n1——第一个适宜稀释度的平板数
n2——第二个适宜稀释度平板上的平板数
d——稀释因子（第一稀释度）。
⑦结果记录
记录稀释倍数和相应的菌落数量，单位以CFU表示。
3.2样品菌液的检测
方法同上。
其中选择倾注平板的系列稀释样品匀液，则根据预实验的检测选取适宜的稀释倍数的样品匀液，标号，做6个连续的平板，计数。
记录稀释倍数菌液和相应的菌落数量，单位以CFU表示。
四、实验结果
稀释度
10-4
10-5
10-6
cfu数/平板
1
2
3
平均
1
2
3
平均
1
2
3
平均
每克或每毫升样
品中的cfu数
839
846
904
863
102
89
81
91
9
9
10
9
实验四压电传感法检测金黄色葡萄球菌的菌落数
一、实验目的
通过压电传感法检测实验三中系列样品匀液的菌落数，得出不同浓度的菌落的检出时间（DT值），为标准曲线的制作做准备。
二、实验材料
2.1菌液
实验三，2实验中所取的系列稀释样品匀液。
2.2培养基
营养肉汤：
蛋白胨10g;牛肉膏粉8g；酵母膏粉4g；葡萄糖20g;蒸馏水1000ml最终PH7.4，分装后121℃高压灭菌15min-20min。
2.3实验仪器
2.3.1基于串联式压电传感器的自动化微生物检测仪
实验装置如图1所示，振荡器为9MHz的AT切石英晶片（JA-5型，北京707厂），两边为银电极。
在自制的IC-TTL型振荡电路中振荡，振荡器工作电压由DF1731SDZA型直流稳压电源（宁波中策电子有限公司）提供，其振荡频率由SS7201通用智能计数器（石家庄无线电四厂）采集，电极为不锈钢材料。
整台仪器由8组独立的串联式压电传感器并联构成。
Fig1.Schematicdiagramoftheautomatedinstrument:
（1）plug,
（2）testingcell,（3）waterbath,（4）culturemedia,（5）bacteria,（6）electrode,（7）frequencyshiftcurve.
2.3.2其它实验设备
超级恒温槽重庆实验设备厂
TH2816型数字电桥江苏腾飞电子厂
LRH-250A型生化培养箱广东省医疗器械厂
手提式电压力蒸汽消毒器宁波市镇海医疗器械厂
ZHN-4型蒸气恒温箱中国原子能科学研究院
超净工作台上海医疗器械厂
pHS-3C型pH计上海精密科学仪器厂
MGIT960型微生物检测仪美国BACTEC公司
三、实验方法
3.1传感器灵敏度的测定
恒温37℃，向检测池中加入NaCl溶液，开机检测待其读数稳定，记录此时频率，然后将池中NaCl溶液倒出，换成另外浓度的NaCl溶液，继续上述测定。
按照NaCl溶液的由低到高的循序进行加样检测，以消除不同浓度NaCl溶液的相互影响。
最后作出传感器的灵敏度曲线。
3.2样品菌液的检测
样品菌液为实验三，2实验中所取的系列稀释样品匀液，两个检测同时进行。
开始检测时，检测池经过121℃，15min高压灭菌，加入5mlBaird-Parker氏培养基。
检测池插入检测仪，待温度达到37℃恒温，用无菌注射器向检测池中注射不同浓度的细菌悬液0.5ml，开机检测。
同时与实验三平板计数实验作参比。
记录不同稀释倍数的菌液和相应浓度菌液的检出时间（DT值）。
四、实验结果
金黄色葡萄球菌的典型响应曲线
（■）106cfuml-1,（●）104cfuml-1,（▲）102cfuml-1,（▼）10cfuml-1.
5、回归曲线方程
DT=-142.69LogC+1467.64
C是牛奶样品中的金黄色葡萄球菌的初始浓度；DT是频率检出时间，其相关系数大于0.99，说明DT和被测样品中细菌浓度呈线性关系。
在10cfuml-1至106cfuml-1范围内，一旦获得DT值，样品中金黄色葡萄球菌的初始浓度可根据方程计算得到。
实验五压电传感法、国标法检测金黄色葡萄球菌菌落数及两种方法结果的比较
一、实验目的
通过对两种检测方法得出结果的比较，证明压电传感法的准确性和可靠性
二、实验材料
2.1若干份检测样品
2.2设备和材料
恒温培养箱：
36℃±1℃
冰箱：
2℃-5℃
恒温水浴箱：
46℃±1℃
天平：
感量0.1g
均质器
振荡器
无菌吸管：
1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸头
无菌锥形瓶：
容量250ml、500ml
无菌培养皿：
直径90mm
PH计或PH比色管或精密PH试纸
放大镜或菌落计数器
基于串联式压电传感器的自动化微生物检测仪
超级恒温槽重庆实验设备厂
TH2816型数字电桥江苏腾飞电子厂
LRH-250A型生化培养箱广东省医疗器械厂
手提式电压力蒸汽消毒器宁波市镇海医疗器械厂
ZHN-4型蒸气恒温箱中国原子能科学研究院
超净工作台上海医疗器械厂
pHS-3C型pH计上海精密科学仪器厂
MGIT960型微生物检测仪美国BACTEC公司
2.3培养基和试剂
1）平板计数琼脂培养基：
营养琼脂培养基
2）无菌生理盐水：
称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
3）1mol/L氢氧化钠：
称取40g氢氧化钠溶于1000ml蒸馏水中。
4）1mol/L盐酸：
移取浓盐酸90ml，用蒸馏水稀释至1000ml。
5）营养肉汤
三、实验方法
取N份样品，分别用压电传感法和国标法测定，观察二种方法得到的结果之间的差异。
四、实验结果
细菌
初始浓度（cfuml-1）
DT方法
平板计数法
金黄色葡萄球菌
5.1×102
8.8×103
6.2×105
45
3.7×102
6.5×103
5.4×105
23
五、结论
结果显示，两种方法得到的结果相关系数为0.99，说明用DT法测得的细菌浓度和平板计数法的结果同样准确，可靠。
但本文所提出的方法无须人工计数，能自动给出结果，检测时间相对于平板计数大大节约。
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