聚合酶链反应实验报告doc.docx

聚合酶链反应实验报告doc.docx

《聚合酶链反应实验报告doc.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《聚合酶链反应实验报告doc.docx（7页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

聚合酶链反应实验报告doc

聚合酶链反应实验报告

篇一：

PCR实验报告

　　普通生物学实验报告

　　实验名称：

用PCR扩增的方法鉴别不同物种来源的肌肉

　　一、特异性目的片段DNA的扩增

（一）实验原理

　　聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction,PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，其基本原理为DNA的半保留复制。

PCR技术由①高温变性模板；②引物与模板退火；③引物沿模板延伸这3步反应组成一个循环，通过多次循环反应，目的DNA得以迅速扩增。

其主要步骤是：

将模板DNA置于高温下（通常为93℃-94℃），使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因的两条单链互补结合；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板按5’→3’的方向延伸，合成互补链。

　　本实验采用物种特异性引物扩增的方法来鉴定3种不同物种来源的肌肉。

以不同物种来源的动物DNA为模板，用物种特异性的引物进行PCR扩增，只有在模板和引物的物种相对应的情况下才会有特异性条带的出现。

应用此方法，可以特异性地检测样品中痕量的特定DNA成分。

（二）实验步骤

　　1.不同反应体系的配制

　　按下表将各成分分别加入一做好标记的无菌PCR管中，配制50μl的PCR反应体系，注意酶要最后加，加完后将PCR管放置在冰上。

　　2.将上述混合液稍加离心，约10s左右。

取下后立即置于PCR仪中，盖紧热盖，定好PCR仪的反应程序，执行扩增程序。

　　反应程序为：

　　预变性94℃5min

　　变性94℃5s

　　退火50℃5s

　　延伸72℃20s

　　后延伸72℃5min

　　3.反应结束后，终止程序，将PCR管取出，放置于4℃，待电泳检测。

循环30次

　　二、水平式琼脂糖凝胶电泳法鉴定PCR产物

（一）实验原理

　　核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液（pH8.0-8.3）中，其碱基不解离，而磷酸集团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。

琼脂糖主要是从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分子。

使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。

（二）实验步骤

　　1.制胶

　　称取2.4g琼脂糖，放入250ml的锥形瓶中，加入120ml1×TAE缓冲液，微波炉高火加热约40s直至沸腾，摇动，使琼脂糖分散，在重复煮沸2次，直至溶液澄清透明。

待琼脂糖温度降到60℃左右时，按1:

XX0的浓度加入GoldenView,混匀后倒入已插上合适齿孔梳子的模具中，静置，约30-45min后凝胶完全凝固。

轻轻的垂直拔出梳子，将凝胶取出，放入电泳槽中，添加1×TAE缓冲液至刚好没过凝胶（有样品孔的一端靠近负极）。

　　2.加样

　　取15μlPCR产物与3μl的6×上样缓冲液混匀，加入到凝胶样品孔中。

每加完一个样品应更换一个吸头。

加样前，要记下加样的顺序。

在每排样品孔中留出一个位置加入5μl的marker。

　　3.电泳

　　加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压100V，样品由负极向正极移动。

当溴酚蓝移动到距离凝胶下缘约1/3时，停止电泳。

　　4.拍照

　　电泳完毕后，取出凝胶，采用凝胶成像系统拍照保存。

　　三、实验小结

（一）实验结果

　　PCR产物电泳结果

　　由上图可以看出，样品1和样品6出现了目的条带（大小约200bp），所以DNA模板1为猪肉DNA，DNA模板3为牛肉DNA,DNA模板2为兔肉DNA。

（二）实验讨论

　　1.在加入Taq酶时，应始终保持酶在冰浴中，不可握在手中。

　　2.每加完一次酶，都应更换吸头。

因为在加酶时，吸头会插入液面以下，为防止污染，应更换吸头。

　　3.拔出梳子时，应两端一起用力，垂直，缓慢地拔出，以免破坏胶孔。

　　4.将样品与上样缓冲液混合时，要反复吸进，挤出溶液。

为防止出现较多气泡，在每次挤出溶液时，可在吸头中残留少量溶液。

　　5.在加样时，吸头要垂直于凝胶板且不要插入太深，以免破坏样品孔。

　　6.我们组的电泳图中，条带不是很明显，应该是加样时样品的量不够充足，以后应注意。

篇二：

实验三聚合酶链式反应

　　聚合酶链式反应

　　实验原理

　　PCR是在试管中进行DNA复制反应，基本原理与体内相似，不同之处是耐热的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加热（变性）、冷却（退火、保温（延伸）等改变温度的办法使DNA得以复制，反复进行变性、退火、延伸循环，就可使DNA无限扩增。

PCR的具体过程如下：

　　1.将PCR反应体系升温至95℃左右，双链的DNA模板就解开成两条单链，此过程为变性。

　　2.将温度降至引物的Tm值以下，3'端与5'端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域结合，此过程称为退火。

　　3.将反应体系的温度升至72℃时，耐热的TaqDNA聚合酶催化四种脱氧核糖核苷酸按照模板DNA的核苷酸序列的互补方式依次加至引物的3'端，形成新生的DNA链。

　　每一次循环使反应体系中的DNA分子数增加约一倍。

理论上循环几次，就增加为2^n倍。

当经30次循环后，DNA产量达2^30拷贝，约为10^9个拷贝。

　　实验目的

　　1.掌握PCR的原理和操作方法

　　2.利用PCR方法扩增大肠杆菌的16SrRNA基因

　　实验材料

　　1.TaqDNA聚合酶（MBI），10×Taq缓冲液

　　2.10mMdNTPs（上海生工公司合成）

　　3.DNA：

大肠杆菌Dh5a基因组DNA

　　4.引物：

27F（5'-AGAGTTTGATCC/ATGGCTCAG-3'）,

　　1541R（5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'）上海生工生物公司合成

　　5.0.8%琼脂糖凝胶

　　实验仪器

　　PCR仪（德国Biometra），核酸电泳仪，凝胶成像仪

　　实验步骤

　　1.设定PCR反应程序

　　1）95℃:

5min

　　2）95℃:

45sec

　　3）56℃:

45sec

　　4）72℃:

1.5min

　　2）-4）循环30次

　　5）72℃:

10min

　　6）4℃:

pause

　　3.PCR循环结束后琼脂糖凝胶电泳检测结果。

篇三：

临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用

　　WS/T230-XX临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用

　　Guidelinesforuseofpolymerasechainreaction

　　（PCR）techniqueinclinicaldiagnosis

　　1范围

　　本标准规定了临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用准则。

　　本标准适用于各级，各类的医疗、卫生、保健机构应用PCR技术进行临床诊断。

2定义

　　本标准采用下列定义。

　　2.1引物primer

　　与待扩增靶DNA片段两端互补的寡核昔酸，其本质是单链DNA（ssDNA），在DNA聚合酶的作用下能进行延伸，从而合成新的互补链。

　　2.2模板template

　　待扩增的靶DNA或RNA链，包括人类基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、eDNA和mRNA、扩增后的DNA产物等几乎所有形式的DNA或RNA。

　　2.3变性denaturation

　　DNA或RNA由双链转变为单链状态，加热、提高pH或加入甲酰胺、脲等试剂都可使双链DNA或RNA发生变性。

　　2.4退火annealing

　　引物与互补的核苷酸序列在合适的温度下通过氢键形式相互结合的过程。

　　2.5延伸extension

　　在合适的条件下，由DNA聚合酶（如：

Taq酶）催化引导引物DNA链延伸的合成过程。

　　2.6污染contamination

　　由来源子非待测样品的核酸所引起的一个样品、一系列样品或试剂的非特异性扩增或扩增后在产物分析过程中造成的样品之间的污染，污染通常引起假阳性结果。

　　2.7遗留污染carry-overcontamination

　　同一类靶序列上一

次PCR扩增产物对以后扩增反应的后续污染。

　　2.8内对照internalcontrol

　　在同一反应混合物体系中与待测靶核酸同时进行扩增反应的已知对照物。

　　2.9TaqDNA聚合酶TaqDNApolymerase

　　一种耐热的DNA聚合酶，最初是从美国黄石国家公园温泉中存在的水生栖热菌

　　（Thermu$aquati-cus）中分离获得，Taq酶最适活性温度在70℃～80℃，能耐受PCR变性过程中的高温，是目前PCR扩增反应中经常使用的DNA聚合酶。

　　2.10抑制物／干扰物inhibition/interference

　　临床样品中能导致假阳性或假阴性扩增的内源性物质（如血液中的某些成分，痰液中的酸性多糖、尿液、体液等）和外源性物质（如滑石粉、抗凝剂等）。

　　2.11dNTPdeoxynueleotidetriphosphate

　　三磷酸脱氧核苷，包括dATP、dUTP、dCTP、dGTP、dTTP等。

在PCR扩增反应中，作为反应底物聚合形成新的DNA链。

　　2.12热循环仪thermocycler

　　在PCR或其他需要在反应过程中转换温度的体系中用来保证温度准确快速转换的设备。

3用途

　　对目前已有稳定、可靠的微生物学和免疫学方法检测的疾病或病原体，不推荐应用PCR进行检测。

例如，大多数的细菌感染通过细菌培养3～4天即可报告并明确药敏结果；对甲型肝炎病毒等的感染。

通过对其抗原或／和抗体的检测也可明确诊断。

对于目前尚无其他实验室诊断技术或现有的诊断技术不成熟、敏感性太低、不能及时准确地反映感染情况的疾病，可推荐应用PCR技术进行检测。

如丙型肝炎病毒的感染，检测其抗体不能做到早期诊断、也不能表明血清中有无病毒的存在，又如结核杆菌的感染，培养需2～3个月，耗时太长，影响诊断，对此类病原体，PCR检测有其独到的优点。

　　PCR临床实验根据其应用的不同可分为三个互相交叉的类型t“过筛实验”，“诊断实验”、“验证实验”。

　　3.1过筛实验

　　过筛实验适用于数目较大的群体，可能大部分元症状（疾病的流行性可能很低）。

一个阳性结果并不能确定病原微生物的流行或反映某种疾病状态，它只能提示有必要作进一步的检测。

较高的诊断敏感性和阴性可信度是过筛实验最重要的特性。

　　3.2诊断实验

　　诊断实验用于当地某种疾病流行率很高、疑诊患有某种疾病（或特异性感染）的群体，特异性靶基因（或病原体）的有无对诊断和治疗有重要意义。

因此，要求在保证实验特异性的情况下-敏感性尽可能地高。

　　3.3验证实验

　　对于过筛实验或诊断实验为阳性的情况，验证实验可作为其补充实验，用于确诊。

特异性和阳性可信度是验证实验最重要的特性。

　　4方法

　　4.1引物序列的选择

　　引物的设计是在模板序列中挑选出两段寡核苷酸片段，使其能有效地扩增模板。

模板序列的选择随着检测的不同而不同，但也有一些共同之处，如：

1）模板序列应是特异的-即不存在和其他序列同源的序列（尤其是在引物部分），模板序列的选择应避免核苷酸重复片段区I2）模板序列在某些情况下需要的是种属内部的保守区、非保守区（尤其是引物部分）或属内特异区。

　　选择合适的引物是保证PCR扩增特异性和敏感性的关键。

首先，对应用于临床诊断的PCR。

在设计引物时，其靶核酸的序列一定是已知的，这些基因序列信息可从基因数据库（如GenBank）中获得。

虽然引物的设计在一定程度上依靠经验，尤其是目前已有多种计算机软件可应用于核苷酸的序列分析和PCR引物的设计，但引物的适用性尚需通过实验性研究加以确定。

PCR引物设计一般遵循以下基本原则：

　　a）引物的长度一般为15～30个碱基；

　　b）两引物相距的距离以100～300核背酸为最优，这样可获得较佳的扩增效果；

　　c）引物内碱基应尽可能随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶堆集现象，引物中G@C含量宜在40%～60%左右；

　　d）引物内部不应有二级结构，两个引物之间、尤其在3’端的序列不应互补；e）引物3’端与模板一定要互补，末端碱基不要出现多个A。

　　4.2常规PCR实验方案

　　4.2.1材料

　　模板DNA（102～105拷贝）

　　上游引物

　　下游引物

　　TaqDNA聚合酶和浓缩反应缓冲液

　　氯化镁（MgCl2）

　　无DNA酶（DNase）的水

　　无DNase矿物油

　　dNTP混合物（含dATP、dCTP、dGTP、dTTP）

　　4.2.2扩增反应（一般情况下，每50μL反应体积所含组分如下）：

　　成分终浓度

　　无DNase的水将反应体积补足至50μL

　　浓缩反应缓冲液1×工作浓度

　　dNTP混合物各0.2mmol/L

　　TaqDNA聚合酶0.5～1.0U/50μL

　　氯化镁（MgCI2）1.5mmol/L

　　上游引物1μmol/L

　　下游引物1μmol/L

　　模板102～105拷贝/50μL。

　　每个反应管加1～2滴（20μL～40μL）无DNase的矿物油，根据适合各个PCR反应的扩增参数，按变性、退火、延伸三步骤的热循环程序进行扩增反应。

　　4.3PCR扩增产物的分析

　　扩增产物的分析，根据研究对象和目的的不同可采用不同的分析方法，琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳等可帮助判断扩增产物的大小，有助于扩增产物的鉴定{点杂交还有助于对扩增产物进行基因分型（如HLA-DQ分型）；Southern杂交分析可从非特异扩增产物中鉴定出特异性产物的大小，因此，可增加检测的特异性和敏感性。

其他一些方法，如微孔板杂交、PCR-酶联免疫吸附实验（ELISA）等均有助于产物的精确分析。

　　4.3.1凝胶电泳

　　这种方法是根据带负电的DNA可以在pH中性的缓冲液巾向阳极迁移的原理而建立的，凝胶基质可以是琼脂糖或聚丙烯酰胺等，核酸的迁移率与琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶的浓度、电流、离子强度以及温度等因素有关。

电泳后，通过溴化乙啶（EB）染色，在紫外下可以清晰地观察到PCR扩增产物条带，但扩增产物的特异性必须用探针杂交等方法加以鉴定。

　　4.3.2点杂交法

　　点杂交法的基本过程是t首先将扩增产物固定到尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再用核素或非核索标记的探针进行杂交，由于核素有较大的放射危害性，现在多用非核索进行探针标记，如生物寨、荧光素、酶及化学发光剂等州玉可在反应时直接掺入地高辛或生物素标记的单核替酸，然后将扩增产物固定，再用抗地高辛抗体或亲合索进行反应来检设4靶序列。

　　4.3.3微孔板夹心杂交法

　　该方法是通过固定子微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域进行特异性杂交，使扩增产物间接地固定于微孔板上，然后，再用生物泵等非核紊标记的检测探针与扩增产物的另一区域杂交，漂洗、显色后即可判断结果。

　　4.3.4PCR-ELISA

　　将引物的5端用生物素或异硫氰酸荧光素（FITC）等修饰后并不影响其扩增特异性靶核酸的特性，因此，可以通过修饰其中一个引物的5’端使其携带便于PCR产物被捕获、固定的功能基团（如生物紊）。

而通过另一引物5，端的修饰（如FITC）使产物便于检测，这样避免了电泳和杂交等步骤，适于常规检测。

　　4.3.5其他

　　如限制性内切酶长度多态性分析（Restriction-fragment-length-polymorphism，RFLP）、核苷酸序列分析等。

　　5样品的收集、运输、处理和存放

　　正确的样品收集、运送和保存是十分重要的。

虽然PCR检测对上述环节的要求与传统的微生物培养和血清学检测基本相同，但在许多情况下仍有其特殊性。

即无论在什么情况下都至少应保持靶核酸的完整性，样品中的干扰物应能被充分稀释，使其不致于干扰检测。

　　5.1样品的收集

　　实验室对每项特定的PCR检测都应制定并为临床提供详细的样品收集规则。

，

　　5.1.1样品收集的时间

　　在某一疾病的病程中，样品收集过早或过迟都会导致假阳性或假阴性结果，因此。

要注意样品收集的时限性或时效性。

　　5.1.2收集场所的准备

　　样品的收集场所应要求避免细菌污染并去除可能造成污染的物质，样品的收集需由经过专门培训的工作人员来完成。

　　5.1.3样品的类型和数量

　　样品的类型、数量应是一定的，它们可能与常规微生物学、血清学实验的要求相同或不同，这是由疾病病原体的不同特性决定的。

一般而亩，如果所收集的样品可以进行培养，那么提取核酸进行扩增分析也是可行的。

　　5.1.4样品的质量

　　样品的质量可根据以下一种或几种方法进行评估：

肉眼观察、显微镜检查或化学分析。

评估其细胞组成、细胞数目、核酸总量等。

　　5.1.5样品的收集／运输装置

　　样品的收集需采用一次性材料，样品的收集材料（如拭子、试纸）或试剂（如防腐荆、抗凝剂或其他常规添加剂）必须不会干扰扩增或检测过程，抗凝剂一般采用乙二胺四乙酸盐（EDTA）或枸橼酸盐，肝索对扩增反应有一定的抑制作用而且在以后的靶核酸提取中不易除去，应尽量避免使用l对游离的核酸，需灭活核酸酶使其稳定。

靶核酸（如DNA）应能从收集装置中释放出来，另外，收集、运输过程中某些介质可能会稀释样品，因此，必须考虑稀释对测定结果的影响。

　　5.1.6样品的核对

　　收到样品后，应对病人姓名、样品类型、收集时间等进行详细核对。

　　5.2样品的运输

　　样品收集后应尽快送至实验室进行检测，运输过程中，特别是在需要保持细胞的完整性时，应注意避免样品的过冷或过热，并尽量减少细菌等污染物的生长，而且必须保证样品巾的靶核酸免受内源性或外源性核酸酶的破坏与降解；游离核酸需经稳定化处理，靶核酸为RNA时要求更为严格（如对靶核酸为RNA的样品可加入异硫氰酸胍盐灭活其中的核酸酶），不同的实验对运输方法都有其特殊要求，应明确加以规定。

　　5.3样品的处理

　　样品中的许多杂质能抑制TaqDNA聚合酶的活性，从而干扰扩增反应，样品的处理可去除这些干扰杂质，增加PCR扩增的成功率和可重复性，有利于检测的标准化，纯化样品中的核酸（DNA或RNA），可使待测核酸暴露，有利于与引物的退火。

　　5.3.1靶核酸的释放

　　待扩增的靶核酸可能来源于不同的临床样品，如血液、体液、尿液、粪便、游离的细胞或组织块等。

靶核酸可有不同的存在形式和存在部位。

如病原微生物的靶核酸可存在于宿主细胞内与宿主DNA整合在一起、游离子宿主细胞核中或以各种形式存在于宿主细胞质中。

而