异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌mc2 155细胞蛋白双向电泳图谱的差异分析.docx

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异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞蛋白双向电泳图谱的差异分析

异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞蛋白双向电泳图谱的差异分析

【摘要】目的利用蛋白质组学方法，识别异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞后差异表达的蛋白质，为进一步深入探讨异烟肼抑制分枝杆菌生长的作用机制及寻找新的抗结核药物作用靶标奠定基础。

方法观察不同浓度的异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌生长曲线，确定药物处理SM细胞的最佳时间和浓度，并提取在最佳处理时间和浓度条件下的SM细胞总蛋白，采用载体两性电解质pH梯度双向凝胶电泳技术分离异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞的总蛋白质，用PDuest图像分析软件比较分析，以识别差异表达的蛋白质。

结果在空白对照组检出159个蛋白斑点，在异烟肼处理组检出221个蛋白斑点，在相对分子质量30000~90000和pH值~范围内，异烟肼处理组蛋白斑点数均多于空白对照组。

结论异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞的蛋白质组具有差异，提示异烟肼处理后促进了某些特定基因的表达。

【关键词】异烟肼；耻垢分枝杆菌mc2155；双向电泳；蛋白质组比较

　　结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，）是引起结核病的病原体。

结核病是除AIDS外引起死亡最高的感染性疾病，是严重的全球性健康问题[1]。

抗结核药物是结核病化学治疗的基础，因此，结核病的化学治疗目前是人类控制结核病的主要手段。

结核病治疗的两大难题在于结核分枝杆菌的持留性和耐药性，这些问题使得结核病不能得到快速而有效的治疗。

在2000年，全世界约有273000例新增的结核耐药病例，占所有结核病%。

因此，随着人们对结核分枝杆菌认识的逐步深入，发现新的药物作用靶点，研究和开发靶向结核分枝杆菌的新型抗结核化疗药物，对控制和治疗结核病具有重大意义。

异烟肼作为全效杀菌剂，一般认为，其作用机制是在结核分枝杆菌细胞内被过氧化氢过氧化物酶氧化成异烟酸，成为烟酸的类似物，参与辅酶Ⅰ的合成并使其不能起同功酶的作用而抑制细胞壁分枝菌酸的合成，使结核杆菌损失细胞壁的完整性及其抗酸性，细胞壁保护及抵抗氧化、侵袭的屏障功能受损。

随着碳水化合物、氨基酸和磷酸盐的丢失，最终导致结核分枝杆菌死亡，但是否存在其他作用靶点，尚不清楚。

本研究利用与结核分枝杆菌有相同细胞壁结构，但生长快速且无致病性的耻垢分枝杆菌（Mycobacteriumsmegmatis）mc2155菌株作为实验模型，应用比较蛋白质组学技术，观察异烟肼处理后耻垢分枝杆菌mc2155细胞蛋白表达谱的变化，从蛋白质的水平探讨异烟肼抑制分枝杆菌生长的作用机制，并寻找新药作用靶标，为新型抗结核病药物的研究开发奠定基础。

　　1材料与方法

　　菌种及试剂M.smegmatismc2155菌株由美国科罗拉多州立大学微生物系分枝杆菌研究室惠赠。

异烟肼购自上海信宜制药厂；LB培养基购自美国Invitrogen/GIBCO公司；载体两性电解质（ampholyte），尿素（urea），硝酸银，丙烯酰胺（acrylamide），甲叉双丙烯酰胺（Bis）均为美国Sigma公司产品；Tris，SDS，甘氨酸（glycine）购自北京华美公司；低相对分子质量标准蛋白质购自北京天为时代公司；其他试剂为国产分析纯试剂。

　　仪器圆盘电泳槽，大连竞迈生物科技有限公司；高压电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司；MVII型垂直板电泳槽，大连竞迈生物科技有限公司；高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；微量进样器，法国Gilson公司；GL20A全自动高速冷冻离心机，湖南仪器仪表厂离心机厂；pH计，意大利HANNA公司；THZ92B台式恒温振荡器，上海跃进医疗器械厂；AEG120电子分析天平，日本岛津公司。

　　细菌生长曲线将冻存管中耻垢分枝杆菌20μl接种到2mlLB液体培养基中，37℃振荡培养，每3h于600nm处测定细菌培养液的OD值，待OD值达到时，分别在各组培养基中加入终浓度为mg/L，mg/L，mg/L，mg/L和mg/L的INH；每3h于600nm处测定空白组，INH处理组细菌培养液的OD值，绘制生长曲线，确定INH的最佳处理时间及浓度。

　　细菌总蛋白的制备将耻垢分枝杆菌20μl悬液接种到2mlLB液体培养基中，37℃振荡培养，取对数生长期细胞进行实验。

分别在培养基中加入终浓度为mg/L的INH，空白对照组加与INH等体积的无菌水，继续培养3h后收获细菌。

50mmol/L的TrisHCl（pH）缓冲液洗涤沉淀细菌（5000×g，4℃离心15min×3），1ml50mmol/L的TrisHCl（pH）缓冲液重新悬浮沉淀于Ep管中，超声破碎裂解细菌，工作30s，间歇10s，重复20次，8000×g，4℃离心15min，上清液即为细菌总蛋白。

分别取少量INH处理组和空白对照组上清液用Bradford法测定总蛋白质浓度，其余样品冻存于-20℃备用。

　　载体两性电解质pH梯度等电聚焦为第一向的双向电泳蛋白质样品处理及电泳主要按照文献进行。

取15μg细菌蛋白样品与等体积的2×样品缓冲液混合，室温放置1h。

将g尿素，540μl双蒸水，200μl30%丙烯酰胺溶液，pH4~6载体两性电解质24μl，pH3~10载体两性电解质溶液μl，轻缓混匀后依次加入5μl10%过硫酸铵和4μlTEMED，轻轻混匀，快速吸取90μl上述混合液，从玻璃管（直径1mm，长8cm）的一端缓慢均匀灌入，避免产生气泡，室温聚合。

组装好圆盘电泳槽，用微量进样器取准备好的样品液,缓慢从玻璃管的上端注入，使样品沉于胶面上，确定上槽与玻璃管之间无渗漏，倒入电泳缓冲液，接通电源，室温下1000V恒压电泳3h，进行等电聚焦。

再将胶条从玻璃管中均匀挤出，在平衡缓冲液[5%2巯基乙醇，mmol/LTrisHCl（pH），%SDS，10%甘油]中平衡30min，转移至15%分离凝胶上端，30mA恒流，进行SDS-PAGE电泳。

电泳所得到的凝胶按文献方法进行高灵敏度的银氨染色。

　　凝胶图像的分析凝胶通过数码相机获取图像，利用PDuest软件完成选择异烟肼处理组全蛋白凝胶图像与空白对照组全蛋白凝胶图像之间进行消减，斑点检测，匹配，量化，获取斑点位置坐标等分析，获得异烟肼处理所致的蛋白质差异变化表达，并将这些蛋白质点在双向电泳图谱上标出。

　　2结果

　　不同浓度INH处理前后mc2155细胞生长变化情况

　　图1不同浓度INH处理前后mc2155细胞生长曲线

　　如图1所示，不同浓度的INH对耻垢分枝杆菌的增殖均有不同程度的抑制作用。

药物处理3h，细菌的增殖开始受到明显的抑制，此时，INH的最佳处理浓度为mg/L，抑菌率为%。

　　INH处理前后mc2155细胞蛋白质表达图谱空白对照组mc2155细胞总蛋白2DE图谱和INH处理组mc2155细胞总蛋白2DE图谱显示，两者的蛋白斑点在~范围内均匀分布，且INH处理组的蛋白斑点一般较大，染色较深。

　　图2空白组mc2155细胞总蛋白2DE图谱

　　图3INH处理组mc2155细胞总蛋白2DE图谱

　　图4空白对照组和INH处理组总蛋白相对分子质量分布

　　INH处理前后mc2155细胞蛋白质2DE图像分析空白对照组有159个斑点，INH处理组有蛋白斑点221个。

空白对照组和INH处理组蛋白的蛋白斑点相对分子质量分布基本一致，二者蛋白斑点数最多的区域均在60000~90000之间，分别为%（空白对照组）和%。

在相对分子质量分布的主要区域，INH处理组蛋白斑点数均多于空白对照组。

空白对照组和INH处理组蛋白的蛋白斑点pH值分布显示，在pH值分布的主要区域，INH处理组蛋白斑点数均多于空白对照组。

空白对照组有38个蛋白斑点的pH值，有117个蛋白斑点的pH值介于~之间，INH处理组有34个蛋白斑点的pH值，有172个蛋白斑点的pH值介于~之间。

当pH值介于~之间时，二者的蛋白斑点数相差最大。

　　图5空白对照组和INH处理组总蛋白pH值分布

　　3讨论

　　目前，针对抗结核药物处理特定时期分枝杆菌的蛋白质组学研究，国内外尚未见报道。

本试验通过观察不同浓度的INH处理前后耻垢分枝杆菌生长的变化情况，发现不同浓度的INH对耻垢分枝杆菌生长均有不同程度的抑制作用，并确定INH处理的最佳时间为3h，处理浓度为mg/L。

选mg/LINH处理3h的耻垢分枝杆菌细胞总蛋白质组作为蛋白质组研究对象，一方面由于药物处理3h后，耻垢分枝杆菌的增殖第一次受到了明显的抑制作用，推测此时分枝杆菌增殖水平的降低是由药物作用而直接导致的；另一方面，在最佳药物处理时间点上选择抑制率最高的药物浓度，有利于比较这一时期的分枝杆菌的蛋白质组，便于发现并找出INH作用的直接靶标。

第4期异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞蛋白双向电泳图谱的差异分析湛垚垚，等载体两性电解质pH梯度等电聚焦为第一向的双向电泳的方法的建立，有效分离了INH处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞中不同pH值和相对分子质量范围的蛋白质，获得了比其他蛋白质分离技术更全面的信息，有助于在蛋白质水平解释INH的抑菌机制并发现新的抗结核药物作用靶点。

为了更全面地反映INH处理后mc2155细胞蛋白表达的变化情况，本实验在进行等电聚焦预实验时，曾选用pH~的胶条，其分离效果较差，并发现耻垢分枝杆菌细胞蛋白主要分布在pH~范围内，与文献结果相一致。

以戊二醛为增敏剂的银氨染色和脱色方法的建立，为日后蛋白质的微量鉴定提供了保障。

经PDQuest软件分析发现INH处理后mc2155细胞中有40个特异性表达的蛋白斑点，将这些蛋白斑点进一步进行质谱鉴定将有助于找到INH作用的其他靶标，为从蛋白质水平深入研究INH抑制分枝杆菌生长的作用机制提供新的线索，同时也为新型抗结核药物的开发奠定基础。

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