细菌生化反应鉴定及其它试验操作规程.docx
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细菌生化反应鉴定及其它试验操作规程
细菌生化反应鉴定及其它试验操作规程
1、氧化-发酵试验（O-F试验）
原理：
细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型。
可以进行无氧降解的，称为发酵型（发酵型细菌在有氧无氧的条件下均能分解葡萄糖）。
不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。
方法：
将待检细菌同时穿刺接种两支Hugh-Leifson培养基，其中一支培养基滴加无菌石蜡（或其它矿物油），高度不少于lcm。
35℃，24小时或更长。
结果：
培养基变黄表示细菌分解葡萄糖产酸，两支培养基均无变化为产碱型或不分解糖型；两支培养基均均产酸为发酵型。
若仅不加石蜡的培养基产酸为氧化型。
应用：
主要用于肠杆菌科细菌与非发酵细菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者均为氧化型或产碱型。
也可用于葡萄球菌与微球菌问的鉴别。
2、β-半乳糖苷酶（ONPG）试验
原理：
细菌产生半乳糖苷酶，分解邻-硝基酚β-D-半乳糖苷（无色）生成邻-硝基酚（黄色）。
结果：
菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20-30分钟内显色。
应用：
主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。
3、七叶苷水解试验
原理：
有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子反应，生成黑色的化合物。
结果：
培养基变黑为阳性，不变色为阴性。
应用：
主要用于D群链球菌与其它链球菌的鉴别。
前者为阳性，后者为阴性。
也可用于革兰阴性菌与厌氧菌的鉴别。
4．甲基红试验
原理：
某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基pH值降至4.5以下，加入甲基红呈现红色为阳性。
若细菌分解葡萄糖产生的酸少，或产生的酸进一步转化为其他产物，则培养基pH值仍在6.2以上，加入甲基红呈现黄色为阴性。
结果：
呈现红色为阳性，橘红色为弱阳性。
黄色为阴性。
应用：
主要用于鉴别大肠杆菌与产气杆菌，前者阳性，后者阴性。
此外肠杆菌科中变形杆菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属和志贺菌属等阳性，而肠杆菌属、哈夫尼亚菌属则为阴性。
5、VP试验
原理：
某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境中，氧化为二乙酰，与精氨酸中的胍基作用生成红色化合物。
结果：
在数分钟内出现红色为阳性，如无红色出现且于35℃4h后仍如故者即为阴性。
应用：
本试验与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。
6、吲哚（靛基质）试验
原理：
细菌分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚（靛基质），加入对位二甲基苯甲醛生成红色玫瑰吲哚。
结果：
于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。
应用：
主要用于肠杆菌科的鉴定。
6、尿素分解试验
原理：
具有尿素酶（尿酶）的细菌，分解尿素产生大量的氨，培养基变碱。
结果：
培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变色为阴性。
应用：
主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定，奇异变形杆菌、普通变形杆菌为阳性，克雷伯菌属、枸椽酸菌属、雷氏普罗威登菌和摩根摩根菌为阳性。
7、苯丙氨酸脱氨酶试验
原理：
某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶使苯丙氨酸脱氨生成苯丙酮酸，加入FeCl3生成绿色化合物。
结果：
出现绿色为阳性，应立即观察结果，延长会引起退色。
应用：
主要用于肠杆菌科的鉴定，变形杆菌属、普罗威登斯菌和摩根摩根菌均为阳性。
肠杆菌科其它菌均为阴性。
8、氨基酸脱羧酶试验
原理：
具有氨基酸脱羧酶的细菌，分解氨基酸脱羧生成胺和CO2使培养基变碱，指示剂改变颜色。
结果：
对照管应呈黄色，测定管呈紫色（指示剂为溴甲酚紫）为阳性。
应用：
主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。
9、氧化酶试验
原理：
氧化酶是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。
具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二氨氧化。
生成有色醌类化合物。
结果：
细菌在与试剂接触10秒内呈紫色为阳性。
为保证结果准确性，应作阴、阳性对照。
应用：
主要用于肠杆菌科与假单胞菌的鉴别，前者为阴性。
后者为阳性。
10、过氧化氢酶试验（触酶试验）
原理：
具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。
试剂：
3％过氧化氢溶液
方法：
取菌置于洁净的试管或玻片上，然后滴加3％过氧化氢数滴；或直接滴加3％过氧化氢于不含血液的细菌培养基中，立即观察结果。
结果：
有大量气泡产生为阳性。
不产生气泡为阴性。
应用：
革兰阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌均阳性。
而链球菌均阴性。
1l、硝酸盐还原试验
原理：
包括两个过程：
一是在合成过程中，硝酸盐还原为亚哨酸盐和氨。
再由氨转化为氨基酸和细菌内其它含氮化合物。
二是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的受氢体，能使硝酸盐还原的细菌从哨酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其它还原性产物。
结果：
出现红色为阳性。
若加入试剂后无颜色变化反应，可能是①硝酸盐没有被还原，试验阴性。
②硝酸盐被还原为氨和氮等其它产物而导致假阴性，这时应加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。
若仍不产生红色，表明为试验为假阴性。
应用：
本试验在细菌鉴定中应用广泛。
12、氧化酶（改良法）试验
试剂：
四甲基对苯二胺（TMPD）6.0g
二甲基亚砜（DMSO）100.oml
溶解TMPD于DMSO中，置于避光玻塞瓶中，可在室温中保留几个星期。
方法：
被检菌株移种于7％羊血琼脂上，30℃需氧条件下孵育15～18h，刮取菌落涂布于无色滤纸片上，加l滴上述试剂，阳性者在2min内呈深蓝色。
若被测菌株移种在蛋白胨酵母浸出液琼脂上，至少孵育3天以上，才可检测，阳性反应5～10min出现。
13、CAMP试验
原理：
B群链球菌能产生CAMP因子，可促进葡萄球菌的β-溶血素溶解红细胞活性，因此在两菌的交界处溶血力增加。
出现矢形（半月形）的溶血区。
结果：
在两划线交界处出现箭头样的溶血区为阳性
应用：
在链球菌中，只有B群链球菌CAMP试验阳性。
14、O/129抑菌试验
原理：
O/129（二氨基喋啶）对弧菌属、邻单胞菌属细菌有抑制作用，而对气单胞菌无抑制作用。
方法：
将待检菌均匀涂布于碱性琼脂平板上，镊取O/129纸片（含药40ug）贴于平板上，35℃，18~24h，观察结果。
结果：
出现抑菌环为敏感，无抑菌环为耐药
应用：
弧菌属、邻单胞菌属对O／129敏感，而气单胞菌属耐药
15、杆菌肽试验
原理：
A群链球菌对杆菌肽几乎全部敏感，而其它链球菌绝大多数对其耐药。
16、奥普托欣试验
原理：
几乎所有的肺炎链球菌对Optochin敏感，而Optochin对其它链球菌则无抑制作用
17、．H2S试验
原理：
有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（如胱胺酸、半胱胺酸）产生硫化氢，硫化氢遇到铅或亚铁离子，则生成黑色的硫化铅或硫化铁。
结果：
培养基变黑为阳性，不变为阴性。
应用：
主要用于肠杆菌科属或种的鉴定。
18、触酶试验（过氧化氢酶试验）
试剂：
3%H202溶液，置棕色瓶内于4℃阴暗处保存。
方法：
先挑取固体培养基上的菌落，置于洁净的玻片上，然后滴加3％过氧化氢溶液1～2滴。
静置之，lmin内产生大量气泡的为阳性，不产生气泡的为阴性。
19、葡萄球菌凝固酶和凝聚因子试验
葡萄球菌凝固酶试验被广泛地用于常规鉴定金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌。
试管法凝固酶试验称为葡萄球菌凝固酶，玻片法为检测凝聚因子。
19.1凝聚因子试验：
取1滴蒸馏水于洁净的玻片上，用接种环挑取待检菌一环置于蒸馏水中，制成浓的菌悬液，无自凝现象。
然后加一环家兔血浆混合，10s内观察结果，出现明显细菌凝块为阳性，否则为阴性。
如超过10s可出现假阳性，有10％～15％金黄色葡萄球菌呈假阴性，因此必须用试管法验证凝聚因子试验。
操作过程中的注意点：
（1）10s内观察结果。
（2）必须制备浓厚的均匀菌悬液。
（3）用EDTA抗凝的兔血浆为最好。
（4）加血浆后不要再混搅，以免细菌凝块分散变小。
（5）生长在高盐培养基上的菌落可出现自凝或假阳性。
19.2葡萄球菌凝固酶试验：
用生理盐水将血浆4倍稀释，取0.5ml。
然后挑取3～5个菌落于稀释血浆中，成浓菌悬液。
置37℃水浴，3～4h后读取结果，凝固者为阳性。
若阴性，继续观察到24h，不凝固者为阴性。
试验应同时作阳性、阴性对照。
试管法葡萄球菌凝固酶试验阳性者，应见到明显的纤维蛋白凝胶块，出现羊毛状或纤维状沉淀物并非真正凝固，应判为阴性。
中间型葡萄球菌、猪葡萄球菌需要较长时间孵育，才可出现阳性。
凝固酶试验应考虑下述情况：
①某些金黄色葡萄球菌产生溶纤维蛋白酶，溶解纤维蛋白凝块。
②所用血浆缺乏纤维蛋白原。
③试验菌株不纯。
结果：
玻片法以血浆中有明显的颗粒出现而盐水中无自凝现象判为阳性；试管法以血浆凝固为阳性。
应用：
作为鉴定葡萄球菌致病性的重要指标，也是葡萄球菌鉴别时常用的一个试验。
20、新生霉素耐药试验
方法：
挑取待检菌菌落数个，制成相当0.5号麦氏管（McFarland）浓度菌液，棉拭子浸透，挤去多余液，均匀涂在M-H平板上，贴上含5ug／片的新生霉素纸片，35℃孵育16～20h，抑菌环直径≤16为阳性（耐药）。
试验时应以金黄色葡萄球菌ATCC25923做阴性（敏感）对照，以确认纸片是否有效。
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