植物蛋白提取.docx
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植物蛋白提取
植物全蛋白提取方法：
TCA丙酮沉淀法、Tris-HC1法、Trizol沉淀法提取法。
1TCA丙酮沉淀法
基于蛋白在酸或疏水条件下变性使蛋白浓缩并去除污染物原理的TCA丙酮沉淀法，最早用于小麦蛋白的提取，是目前提取植物蛋白的常用方法之一。
具有降低次生代谢物质的干扰、减少蛋白降解等优点。
TCA能有效地抑制蛋白酶对蛋白质的水解作用，保证在制样过程中蛋白质不被降解；丙酮溶液能除去样品中的酚类及色素等干扰物质，同时实验过程中采用的高速离心办法能较好地去除多糖的影响。
然而该方法的一个最大缺点是蛋白质很难重新溶解，而且样品中的非蛋白成分很难除去，可能会丢失膜蛋白和疏水性蛋白，导致2-DE图谱上有明显的横纵条纹。
在研磨样品时加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或交联聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP）用来吸附样品中富含的酚、醌类物质。
它们能通过疏水键与酚类形成复合物，离心可以去除该复合物。
然而，TCA丙酮沉淀法中与蛋白共沉淀的污染物在随后的有机溶剂清洗步骤中通常难以去除，可以通过振荡和延长蛋白沉淀在裂解缓冲液中温育时间的方法来增加蛋白的溶解能力。
在提取的过程中同时加入了TCA、β-巯基乙醇及DTT3种药剂可以更好的抑制蛋白质的水解及去除干扰物质。
TCA丙酮提取法耗时少且容易操作，一般作为植物蛋白提取的初始方案，该方法常用于幼嫩组织中蛋白的提取，对更为复杂的植物组织该方法并非最佳选择。
但该方法还是在植物蛋白的提取中占有重要位置，很多木本植物的样品应用该方法效果很好，如鹅掌楸叶片、巴东木莲的雌蕊柱头、槟榔叶片、银杏叶片及枝条、茶树叶片及芽、红豆杉的愈伤组织、石斛叶片等。
草本植物中的大豆叶片、生菜叶片、黄瓜叶片、番茄子叶、龙胆花芽、灰木相思叶片等应用该方法都获得了较清晰的2-DE图谱。
TCAproteinprecipitationprotocol
StockSolutions:
100%（w/v）Trichloroaceticacid（TCA）
recipe:
dissolve500gTCA（asshipped）into350mldH2O,storeatRT.
PrecipitationProtocol:
1.Add1volumeofTCAstockto4volumesofproteinsample.
i.e.in1.5mltubewithmaximumvol.,add250µlTCAto1.0mlsample.
2.Incubate10minat4°C.
3.Spintubeinmicrocentrifugeat14Krpm,5min.
4.Removesupernatant,leavingproteinpelletintact.Pelletshouldbeformedfromwhitish,fluffyppt.
5.Washpelletwith200µlcoldacetone.
6.Spintuneinmicrofugeat14Krpm,5min.
7.Repeatsteps4-6foratotalof2acetonewashes.
8.Drypelletbyplacingtubein95°Cheatblockfor5-10mintodriveoffacetone.
9.ForSDS-PAGE,add2Xor4Xsamplebuffer（withorwithoutbME）andboilsmaplefor
10minin95°Cheratblockbeforeloadingsmapleontopolyacrylamidegel.
2Trizol沉淀法
与TCA丙酮沉淀法相比，Trizol沉淀蛋白质的方法可有效地除去色素、酚类等干扰电泳的化学物质，特别是对植物样品中高丰度蛋白——Rubisco1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase，通常简写为RuBisCO）。
采用此方法能够减少高丰度蛋白对2-DE结果的干扰。
植物样品中高丰度蛋白（如Rubisco）的存在对其他蛋白质，尤其是低丰度蛋白的检测的影响也很大，因此，选择合适的蛋白质制备方法尤其重要。
另外，使用聚乙二醇也可以去除该蛋白，效果较好。
Trizol法相对于酚法蛋白质获得产率高，方法操作亦不复杂，但对试剂要求严格，大量制备样品时成本较高。
目前使用此方法的植物比较少，对野牛草的种子、幼苗叶片及黄花苜蓿幼苗提取蛋白的效果很好。
1.取冻存组织加入1ml Trizol（invitrogen）匀浆，样品量不可超过总体积的10%，室温孵育5min，超声粉碎至组织完全溶于液体中；
2.加入0.2ml氯仿，剧烈晃动15s，室温孵育2-3min，4℃12000×g离心15min；此时溶液分为水相和有机相。
3.小心吸取并丢弃上层水相（该水相中富含细胞总RNA，用于提取RNA，进行PCR实验）；
4.在剩下的中间层及有机相中加入0.3ml无水乙醇，颠倒充分混匀后室温放置2-3min，4℃下2000×g离心5min；
5.小心吸取并收集上层有机相（沉淀为DNA），转移到新的离心管中，加入1.5ml异丙醇，轻轻混匀后室温放置10min，4℃下12000×g离心10min；此时沉淀为蛋白。
6.弃上清液，加2ml 0.3M盐酸胍（95%乙醇溶解）清洗沉淀3次，每次清洗过程中，先将沉淀保存于清洗液中20min，然后在4℃下7500×g离心5min。
最后一次清洗后，丢弃上层液相，将沉淀悬浮于2ml乙醇中，涡旋震荡15s后在室温下放置20min，然后在4℃下7500×g离心5min。
7.丢弃上层液相，将沉淀真空干燥5-10min。
然后将沉淀溶解于1% SDS（十二烷基硫酸钠）中。
在50℃水浴中反复吹打以助溶。
不溶物在4℃下10000×g离心10 min去除。
收集上清，转移到新的收集管中。
该上清中的蛋白样品可直接用于WesternBlotting实验或保存于-20℃。
常见问题：
1. 得率低：
样品裂解或匀浆处理不彻底；最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解
2. 蛋白质降解：
组织取出后未马上冷冻 3. 电泳时条带变形：
蛋白质沉淀洗涤不充分
3Tris-HC1法
Tris-HCl法在膜蛋白和疏水性蛋白的提取方面有所改善。
用含SDS的Tris-HCl与TCA丙酮联合使用提取蛋白质；用80%的丙酮洗涤以除去水溶性杂质（包括高浓度的盐离子），比TCA丙酮法利用高速离心与丙酮洗涤的方法能更有效地排除杂质，也比传统的脱盐和透析方法要省时省力。
Tris-HC1法提取的蛋白图谱效果明显比用TCA丙酮法提取的效果好，主要表现在不同分子量范围内蛋白点的数目及分离效果方面。
TCA丙酮法所提取蛋白在小分子量区域分布不均匀，蛋白点不清晰，水平条纹与竖直条纹较为严重，而Tris-HC1法克服了上述缺点，并分离出TCA丙酮法所不易分离出的酸性蛋白，TCA丙酮法能够得到较多中等分子量蛋白而Tris-HC1法除了分离到较多的中等分子量的蛋白质外，还得到了很多的高分子量和低分子量蛋白质。
另外，Tris-HC1法操作简便，时间较短，成本适中，提取步骤简单，减少了因处理步骤繁多而造成的蛋白质的损失，大大提高了实验结果的重复性。
Tris-HC1法对箭毒木种子、白桦花芽及苹果叶片的提取效果非常好。
在清洗步骤中，用10倍体积的-20℃预冷10%TCA丙酮沉降蛋白质，实验表明Tris-HCl提取法所得图谱背景清晰，没有横纵条纹及弥散状的蛋白质点，蛋白质点数最多。
（1）准确称取0.5g叶片，剪碎后加入0.25mLTris-HCL溶液冰浴研磨。
（2）加入0.75mL提取液。
（7moL/L尿素，2moL/L硫脲，0.4%CHAPS，10mmoL/LDTr）
（3）研磨至匀浆后，转移至1.5mL离心管中，10000r/min。
（4）取上清，即为含蛋白样品。
植物提取蛋白定量：
总蛋白定量分析
1.常用的总蛋白定量分析方法。
2.针对特定蛋白的定量检测
常用的方法是酶联免疫吸附试验，免疫印迹分析和质谱。
酶联免疫吸附试验（ELISA）
酶联免疫吸附试验（ELISA）是溶液中特定蛋白定量的一种常用方法。
通常是在96孔板上进行的。
关键步骤是特定抗原/蛋白的固定。
具体来说，ELISA有不同变种。
直接或间接ELISA，是特定抗原/蛋白直接吸附到检测板。
封闭未被抗原包被的孔板表面，然后在孔板中加入酶标（直接ELISA）或未酶标（间接ELISA）的第一抗体，在测试孔板中，一抗与抗原/蛋白相结合。
对于未酶标的第一抗体，加入酶标的第二抗体与第一抗体结合。
最后，加入酶底物（通常，四甲基联苯胺-TMB或碱性磷酸酶-AP），溶液发生颜色变化，使用分光光度计检测。
颜色变化与蛋白质浓度是直接相关的。
ELISA常用的一个变种是夹心ELISA，也就是说，特定抗原/蛋白结合在孔板表面包被的第一抗体（捕获抗体）和酶标的第二抗体（检测抗体）之间。
直接ELISA的优点是速度快，并且没有第二抗体的交叉反应问题，但局限是，第一抗体的标记可能是费时和昂贵的。
此外，信号放大是最弱的。
因此，间接ELISA是更常用的，因为可以从公司买到各种各样的第二抗体，最重要的是灵敏度提高了。
然而，可能会发生第二抗体的交叉反应。
最后，任何ELISA测定蛋白质浓度的一个重要环节都是蛋白质标准曲线，通常是连续稀释已知浓度的蛋白质，从而绘制标准曲线。
免疫印迹分析
免疫印迹只能半定量。
通过凝胶电泳把原始或变性的蛋白质分开。
把蛋白质转膜（硝酸纤维素或polyvinylidene-PVDF），然后使用特定的酶标抗体检测。
最后，加入适当的底物（化学发光底物）产生可检测的信号。
虽然免疫印迹比ELISA更费时，但是免疫印迹不仅可以对特定的蛋白进行定量，而且可以在一次实验中同时检测蛋白质修饰。
蛋白质质谱
蛋白质质谱是蛋白质定量的新兴方法。
在蛋白质组学分析中，除了蛋白定性之外，一个重要的步骤就是对特定的蛋白的定量。
质谱蛋白定量的方法有很多。
常用的方法，较重的稳定同位素碳（13C）或氮（15N）加入到第一个样本（多肽或蛋白质），而相应的轻同位素（12C和14N）加入到第二个样本（内标），然后混合这两个样本进行分析。
由于两个样本的质量差，用质谱分析仪测定的两个样本峰强度的比值，就相当于其相对丰度比。
质谱蛋白定量的第二种方法，可以不用标记样本（即用基质辅助激光解吸/电离-MALDI分析）。
这里，我们要强调的是，使用质谱这种通用方法就可以在一次实验中同时定量和定性检测。
然而，这种方法需要的检测仪器可能不是任何实验室都能买得起，这可能就限制了这种方法的使用。
非变性胶与变性胶区别：
非变性凝胶里面没加变性剂，一般是SDS。
非变性胶跑出来的蛋白能保持其活性一般用做功能试验，如EMSA。
由于没有变性剂的原因非变性胶电泳时除了与蛋白分子量有关也会受都电荷的影响，因此对蛋白等电点的确定和缓冲液的酸碱性有注意，有时需要倒转电泳时的正负极。
从跑的胶来看，变性胶会比较好看，带比较窄，非变性胶跑出来则比较粗糙。
Westernblotprotocol
步骤：
1.分离胶和积层胶，制胶板；
注意：
灌分离胶时不要加太多。
2.蛋白变性：
准备蛋白样本，加入等体积的2×上样Buffer稀释，置于沸水中煮10min（预染marker煮5min）
3.加样：
每孔加入20～40μl样品
4.电泳：
置于电泳槽中电泳45min，恒定电流90mA（2块板），如为1块板则电流为50mA；
5.取出胶板，用切割刀修好胶；
6.将胶置于转膜液中浸泡；
7.按顺序放好下列物质：
黑面→海绵→滤纸→胶→NC膜→滤纸（用吸管赶去气泡）→海绵；
8.置于转膜槽中于，黑面对黑面，加上冰块，加入转膜液；
9.装好电极，于恒定电压100V下，90min；
10.丽春红染膜；
11.用TBST洗去丽春红；
12.封闭：
加入5％脱脂奶粉＋TBST，常温摇床摇1h；
13.回收封闭液，加入一抗【一抗用5％BSA＋TBS稀释】；
14.置于4℃摇床摇过夜；
15.回收一抗，TBST洗膜，10min，共3次；
16.加入二抗【二抗用5％脱脂奶粉＋TBS稀释】，常温摇床摇1h；
17.回收二抗，TBST洗膜，10min，共3次；
18.将膜置于发光液中浸泡约1min；
19.将膜铺于曝光盒中，于暗室中曝光，洗胶片。
常用溶液配制：
Ⅰ细胞裂解液（PLCLysisBuffer）
Finalconcentration
100ml
500ml
1MHepes（pH7.5）
50mM
5ml
25ml
5MNaCl
150mM
3ml
15ml
Glycerol
10%
10ml
50ml
50mMMgCl2
1.5mM
3ml
15ml
Triton×100
1%
1ml
5ml
0.5MEDTA（pH8.0）
1mM
200μl
1ml
0.1MNaPPi
10mM
10ml
50ml
0.5MNaF
10Mm
2ml
10ml
每次提取蛋白前加入1％蛋白酶抑制剂
Ⅱ.SDS-PAGE胶配方及其它常用溶液的配制
1．30%丙烯酰胺
丙烯酰胺29g
N-N’-亚甲双丙烯酰胺1g
溶于总体积为60ml的水中，加热至37℃使其溶解，补加水至终体积为100ml。
用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌或Whatman1号滤纸过滤，查证该溶液的pH值不大于7.0，置棕色瓶中保存于RT。
注：
（1）丙烯酰胺是强烈的神经毒素，可经皮肤吸收，丙烯酰胺的作用具累积性。
（2）称取时，必须戴手套、口罩；取溶液时也要戴手套。
（3）贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺缓慢转化为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨反应是光催化和碱催化的。
应检查丙烯酰胺溶液的pH值是否在7.0或更低，并应在RT下避光保存。
每隔数月应重新配制溶液。
2．3MTris-HCl,pH8.8（用于分离胶）
Tris碱分子量为121.1。
将72.66gTris碱溶于重蒸水（不超过200ml）中，加浓盐酸调节pH至8.8，让溶液泠却至RT，再最终调至所需pH值。
加重蒸水定容至200ml，1.034×105Pa，20min高压灭菌，RT贮存。
注：
（1）如溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris.
（2）Tris溶液的pH值因温度而异，温度每升高1℃，pH值大约降低0.03个单位。
3．2MTris-HCl,pH6.8（用于积层胶）
同上方法，将48.44gTris碱加重蒸水定容至200ml，加浓盐酸调节pH至6.8。
4．10%十二烷基硫酸钠（SDS）
在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分装备用。
注：
SDS的微细晶粒易于扩散，因此称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的SDS，10%SDS溶液无须灭菌。
5．TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）
TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。
由于TEMED只能以游离碱的形式发挥作用，因此pH值较低时聚合反应受到抑制。
6．10%过硫酸胺
过硫酸胺提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。
可用去离子水配制小量10%（W/V）的贮存液于保存于4℃。
由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔新鲜配制。
方法：
把1gAPS溶解于终量为10ml水溶液中，4℃保存数周。
7.电泳缓冲液SDSbuffer:
10X（runningbuffer）
Trisbase30.3g
Glycine144.0g
SDS10.0g
ddH2Oto1L
（1Xconc:
25mMTrisbase,192mMglycine,0.1%SDS,）
8.转膜缓冲液TransferBuffer（10×）pH8.3
Trisbase30.3g
Glycine144.0g
20%v/vmethanol（Fresh!
）
ddH2Oto1L
（1Xconc:
25mMTrisbase,192mMglycine,200mlmethanol）
9.TBST（10X）pH:
7.5
Trisbase24.2g
NaCl80.0g
Tween-2010ml
ddH2Oto1L
（1Xconc:
100mMTrisbase,150mMNaCl,0.1%Tween20）
10．Tris缓冲盐溶液（1XTBS，25mmol/LTris）
NaCl8.0g
KCl0.2g
Tris碱3.0g
溶解于800ml蒸馏水中，加入0.015酚红并用HCl调pH值至7.4，用蒸馏水定容至1L，分装后在15lbf/in2（1.034×105Pa），高压下灭菌20min，RT贮存。
11．发光剂
100mMTrisBase（pH8.5）10ml
250mMLuminol（inDMSO）50μl
90mMP-CoumaricAcid（inDMSO）22μl
30%H2O22.75μl
SDS-PAGEMini-GelRecipes
7%RunningGel
gels
2
4
Acrylamide:
bis-acrylamide（ml）
4
8
3MTris-HCL,pH8.8（ml）
1.5
3.0
ddH2O（ml）
6.28
12.56
10%SDS（ul）
120
240
10%APS（ul）
100
200
TEMED（ul）
6
12
10%RunningGel
gels
2
4
Acrylamide:
bis-acrylamide（ml）
2.8
5.6
3MTris-HCL,pH8.8（ml）
1.5
3.0
ddH2O（ml）
7.48
14.96
10%SDS（ul）
120
240
10%APS（ul）
100
200
TEMED（ul）
6
12
12%RunningGel
gels
2
4
Acrylamide:
bis-acrylamide（ml）
4.8
9.6
3MTris-HCL,pH8.8（ml）
1.5
3.0
ddH2O（ml）
5.48
10.96
10%SDS（ul）
120
240
10%APS（ul）
100
200
TEMED（ul）
6
12
15%RunningGel
gels
2
4
Acrylamide:
bis-acrylamide（ml）
6
12
3MTris-HCL,pH8.8（ml）
1.5
3.0
ddH2O（ml）
4.28
8.56
10%SDS（ul）
120
240
10%APS（ul）
100
200
TEMED（ul）
6
12
StackingGel
gels
2
4
Acrylamide:
bis-acrylamide（ml）
0.75
1.5
2MTris-HCL,pH6.8（ul）
375
750
ddH2O（ml）
4.8
9.6
10%SDS（ul）
60
120
10%APS（ul）
150
300
TEMED（ul）
3
6
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