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环境工程技术

研究生专业课程论文

题目：

环境工程技术

姓名：

学院：

资源与环境科学学院

专业：

环境工程

班级：

学号：

指导教师：

职称：

教授

2015年1月4日

南京农业大学教务处制

基因芯片在环境保护中的应用

作者王汉宇指导老师蔡天明

摘要：

基因芯片技术是21世纪生物技术的重要发展，是生命科学与物理学、化学、微电子学以及计算机学等学科相互交叉的一门高新技术。

该技术的突出特点在于其高度的并行性、多样化、微型化、自动化，基因芯片技术应用于功能基因研究、杂交测序、药物筛选诊断、基因表达、基因多态性和突变检测等，除了在生物学、医学、制药学、司法和农林业等领域上都有极为广阔的应用外，在环境保护上，一方面可以快速检测污染微生物或有机化合物对环境、人体、动植物的污染和危害，同时也能够通过大规模的筛选寻找保护基因，制备防治危害的基因工程药品、或能够治理污染源的基因产品。

关键词：

基因芯片；环境保护；环境污染；微生物检测

GeneChipTechnologyanditsApplicationinEnvironmentProtection

Author

Instructor

Abstract：

Genechiptechnologyisoneoftheimportantdevelopmentofbiotechnologyinthe21stcentury,anditisahightechnologywhichthelifescientificandphysics,chemistry,microelectronicsandcomputerscienceandotherdisciplinesintersectat.Thesalientfeaturesofthistechnologyisitshighdegreeofparallelism,diversification,miniaturization,automation,Genechiptechnologyhasbeenusedinfunctionalgenomicsresearch,hybridizationsequencing,drugscreening,diagnosis,geneexpression,genepolymorphismandmutationdetection,etc.Apartfromtheexternalapplicationonthefieldofbiology,medicine,pharmaceutics,judicialandagroforestry,Inenvironmentalprotection,Ontheonehanditcanquicklydetectthepollutionandharmcomesfrommicroorganismsororganiccompoundsofenvironment,human,animalandplant.Butalsotoseekprotectionthroughlarge-scalegeneticscreening,andpreparegeneticengineeringdrugstohazardPreventionorgeneproductwhichcancontrolpollution.

Keywords:

GeneChip；environmentprotection；environmentpollution；microbialdetection

前言

基因芯片,又称DNA微探针阵列（microarray）,是一种最重要的生物芯片的一条分支，是伴随人类基因组计划而产生的，该技术的突出特点在于其高度的并行性、多样化、微型化、自动化，被认为是生命科学研究中继基因克隆技术、基因自动测序技术、PCR技术后的又一次革命性的技术突破。

是近年来不仅在分子生物学及医学诊断技术的重要进展。

它的工作原理与经典的核酸分子杂交方法是一致的,都是应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交,通过随后的信号检测进行定性与定量分析。

基因芯片在一微小的基片（硅片、玻片、塑料片等）表面集成了大量的分子识别探针,能够一次分析大量的基因,进行大信息量的筛选与检测。

基因芯片可以快速有效地检测污染源，检测由微生物、有机物等引起的污染，对环境污染物进行检测与评价。

同时能够帮助研究人员通过大规模的筛选制备能够治理污染源的基因产品或寻找到保护基因并制备防止危害的基因工程产品。

1基因芯片的原理和种类

1.1基因芯片的产生

1985年,美国科学家率先提出人类基因组计划，由此揭开人类生命科学史上的伟大工程，随着人类基因组计划实施，大量的动植物、微生物基因组序列得以测定，基因序列数据以前所未有的速度增加，怎样去面对如此众多的基因并探讨其在生命活动中担负的功能就成了生命科学者们共同的任务。

有人就曾设想利用计算机半导体技术生产基因芯片，以对人类基因大量的遗传信息进行分析和检查,直到1994年,由于光电化学的进展、光刻技术的诞生,Pease等人创造的光导原位合成（Light--direetedsymothesis）高密、微化的寡核昔酸阵列（ODTA）技术得以问世，这才使设想逐步成为现实。

基因芯片采用微加工和微电子技术，可在大小1cm的固相表面组装固定若干、几十、成千甚至上万个不同DNA探针，以形成生物分子高密、二维阵列的微型生物化学分析系统，能够实现对基因分子信息个别及大规模的分析和检测。

1.2原理

基因芯片的原理是基于核酸分子碱基之间（A一T/G一C）互补配对的原理，利用分子生物学、基因组学、信息技术、微电子、精密机械和光电子等技术将一系表面构成微点阵，然后将标一记的样品分子与微点阵上的DNA杂交,以实现对多到数万个分子之间的杂交反应,并根据杂交模式构建目标DNA的序列，从而达到高通量大规模地分析检测样品中多个基因的表达状况或者特定基因（DNA）分子是否存在的目的。

例如将由A、T、C、G4种核普酸任意组合形成的八聚体寡核昔酸探针（65536个）和1个长度为12个寡核昔酸碱基组成为AGCCTAGCTGAA的DNA单链进行杂交反应,结果有5种探针可以和目标DNA互补结合，它们分别是TCGGATCG、CGGATCGA、GGATCGAC、GATCGACT和ATCGACTT。

将这些具有重叠序列的探针进行重排就可以构建目标DNA的互补序列。

1.3种类

基因芯片的类型较为繁多，其分类方法较多：

根据载体基质不同分为:

无机片基基因芯片，指其基质基片是无机物，如:

玻璃、硅片等，有机片基基因芯片，指其基质基片是有机物，如:

凝胶、尼龙膜等；依据探针合成的顺序分为:

原位合成基因芯片和预先合成后上样的基因芯片，前者通过聚乙二醇或硅烷类化学试剂在不同位点合成不同的探针，后者比较简单，先制备好cDNA或寡核营酸，然后在经特殊处理的玻片、硅片或膜上点样；按照基因芯片的用途可分为:

基因表达芯片和DNA测序芯片，前者可以将克隆到的成千上万个基因特异的探针或cDNA片段固定在一块DNA芯片上，对来源不同的个体（正常人或患者）、组织、细胞周期、发育阶段、分化阶段、不同的病变、不同刺激（包括不同诱导和不同治疗手段）下的细胞内mRNA或反转录后产生的cDNA进行检测，对这些基因表达的个体特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合分析和判断，将某个或某几个基因与疾病联系起来，极快地确定这些基因的功能，且可进一步研究基因与基因间相互作用关系，后者则是对大量的基因进行序列分析。

按基因芯片组装的探针可分为:

寡核昔酸和cDNA芯片，前者可用于基因组学及表达谱研究，后者仅用于表达谱研究。

2基因芯片技术

2.1DNA阵列的构建和印制

根据芯片种类的应用目的的不同，芯片核酸阵列的构建方式也不相同，首先是根据研究目的选用合适的寡核苷酸、cDNA片段或特定的功能基因等，按统计方式事先构建成点阵列，然后，将所需用的核酸片段就位合成于芯片上，或以大致相当的浓度，变性后采用手工或机械的方法，按一定的排列方式点样在特定的固相支持物上，前者称为原位合成，后者可有压电打印和直接点样两种方法。

2.2靶样品的准备

靶样品就是DNA样品，主要来源是从生物细胞中提取mRNA后经转录成cDNA通常采用常规的基因分离、反转录、扩增的标记等，为了获得杂交信号，在扩增过中加同位素或化学荧光进行标记。

同位素常用P33/S35，使用荧光标记，没有同位素的放射危险性，通过激光共聚焦扫描仪器寻址测读，具有很高的分辨能力、极高的灵敏度和定位功能，是目前广泛用于芯片杂交结果判读的标记方法，荧光标记染料已开发出了数10种。

2.3杂交和检测

杂交：

芯片杂交过程与传统的Southern印迹杂交等类似，属于固－液相正相杂交：

探针分子固定于芯片表面，与液相的靶分子进行反应。

但这种方式不仅使得检测过程平行化，可以同时检测成百上千的基因序列，而且由于集成的显微化，使得杂交所需的探针及待测样品均大为减少，杂交时间明显缩短。

检测：

对于荧光标记芯片应用荧光显微镜或激光共聚焦扫描仪等采集各杂交点荧光信号如位置和强度；同位素标记多采用放射自显影检测杂交信号；最近发展的纳米金标记，通过银放大后可直接在裸眼或普通光学显微镜下观察。

最终再用相关软件进行信号的分析处理，得出待测样品的核酸信息。

2.4数据收集和分析

将经荧光或激光共聚焦扫描得到的图像输入计算机，按不同的研究目的，用专门软件对杂交产生的印迹进行数据的自动化处理和定量分析。

其基本步骤为样品斑点的确定、图像背景的识别和扣除，所得的数据经正态化后，进行统计分析，得到基因的表达图谱。

3基因芯片在环境保护中的应用

3.1微生物群落研究中的应用

3．1.1探究群落中微生物的意义

微生物在生态系统的功能和持续中起着极其重要的作用，了解微生物群落的结构和组成以及它们对环境干扰的反应和适应性，对于维持和恢复生态系统理想的生态功能是很重要的环境微生物群落研究包括环境样品的微生物分布、种类、功能、动力学变化及气候、环境污染等环境因素改变对其微生物生态的影响等。

3.1.2基因芯片技术用于环境微生物研究具有更多优势

与传统的核酸检测技术相比，基因芯片技术用于环境微生物研究具有更多优势：

首先，DNA或寡核苷酸为基础的基因芯片技术是研究功能基因组学的有力工具，它允许研究者全面地研究不同条件下活细胞的生理学。

第二，基因芯片技术不需要知道保守序列，不同种群的同一功能组的所有多态性基因序列可以构建在芯片上，并且以此作为探针来检测它们在环境样品中的的相应分布。

第三，不需要枯燥费时的配对杂交。

第四，基因芯片需要的样品量少，适宜于环境微生物检测。

第五，基因芯片具有定量特性。

基因芯片在环境微生物研究中的应用处于起步阶段，但是，芯片技术在环境微生物研究中的应用将加速复杂环境微生物系统的生态、生理、结构和功能的了解。

3.1.3常用基因芯片的种类

（1）系统寡核苷酸芯片

系统寡核苷酸芯片建立在系统标记基因如rRNA基础之上。

rRNA是研究细菌进化和亲源关系的重要指标，是细菌系统分类学最有用和常用的分子钟。

16SrRNA是最常用的作为细菌群落结构分析的系统进化标记分子。

它由多个高度保守的区段和可变区段组成，保守性序列基本保守，反映生物物种的亲缘关系，因此可以利用恒定区序列设计引物将16SrRNA片段扩增出来；高变性则揭示生物物种的特征核酸序列，其序列因不同细菌而异，因此可利用可变区序列的差异来设计不同菌属、菌种的探针。

系统寡核苷酸芯片是目前应用最广的一种基因芯片，利用该技术已经成功对堆肥、土壤、活性污泥、铀污染含水土层等环境样品进行了微生物检测、菌群动力学、多样性和结构分析。

（2）功能基因芯片

功能基因芯片通常建立在催化生化反应的关键功能基因之上，这些基因包括了那些与研究对象有确定关系的基因，或至少是与研究对象的关系有待考证的基因。

作为FGA候选基因应该具有的特点：

（1）该基因是参与生化过程的关键酶或蛋白质编码基因；

（2）进化保守但在不同微生物之间具有足够的变异，从而可以对不同菌株设计探针；（3）不同的基因在数据库的序列信息量是不同的，应该选择在公共数据库中具有翔实序列信息的有关基因。

根据FGA的目的及其杂交靶标的种类，FGA分为功能分类基因芯片和基因表达芯片。

前者的目的主要是研究菌群是否具有这些特定反应过程及其功能的分布、变化、多样性，其杂交靶标是菌群DNA的PCR产物。

而后者用于研究这些特定功能基因的生理活性及其基因表达情况，需提取环境样品的mRNA，其杂交靶标是菌群cDNA的PCR产物。

（3）群落基因组芯片（CGA）

群落基因组芯片（CGA）是一种将可培养微生物的全基因组DNA作为探针的技术，它的特异性高，可以鉴定到种甚至菌株水平；敏感性强，只需0.2ng的待分析基因组DNA就可检测。

CGA在微生物检测、鉴定、量化、不同环境样品的微生物菌群相关性或不同微生物基因组的相关性分析等方面将有着广泛的前景。

（4）宏基因组芯片（MGA）

未培养微生物组成了地球上生物多样性的主体，据估计，自然环境中超过99%的微生物不能用传统的方法进行纯培养，因此，人们开始通过免培养的技术即宏基因组或直接从环境样品中抽提克隆微生物的混合DNA来研究环境样品中微生物基因组的功能和序列分析。

目前，利用该技术已进行了酸矿外排液和SargassoSea的微生物群落、活性污泥和土壤细菌PHB代谢遗传学等的研究。

该技术可以分析环境样品微生物结构和功能；可以通过不同环境样品宏基因组芯片的比较分析获得某环境样品菌群的代表DNA探针。

3.1.4研究方法

（1）基因指纹图谱法：

指纹图谱法是指用各种技术来评估PCR产物在凝胶上的谱带类型，有下述的许多方法可以用于区分群落间的差异，但当它们用于像多样性指数等更精度的分析时，必须首先确定每一谱带类型只代表一个种。

酶解技术，如扩增rDNA限制性片段分析、限制性酶切片段长度多态性分析、单链构象多态性分析等方法，每一个种都有多个谱带类型，使它们难以单独用于群落多样性分析，而更适合于在基因测序之前对克隆文库及分离物进行筛选。

其缺点是，由于仅有末端片段长度被分析，获得的信息较少，不足以分析非常复杂的微生物群落，如土壤微生物群落，因为多种微生物的酶切末端片段长度可能相同，造成对物种丰度的估计过低。

（2）分子杂交法

直接将PCR产物或样品DNA/RNA与已有的探针杂交来检测微生物群落的多样性能够用于识别种间或种内差异性，其特点是不需要对目标基因进行PCR扩增，因此可以避免PCR过程中产生的误差；但是同样因为未对目标基因进行扩增，目标基因浓度较低，容易给检测带来困难；且有时目标类群的目标基因序列并非完全同一，而是有亚类群之间的差异，结果所设计的探针DNA序列与某些亚类群的目标基因互补性较差，从而导致对该类群的估计过低；此外，它只能用来检测事先估计到其存在、己知其目标基因序列、并为之设计好引物的类群。

（3）定量PCR分析法

通过定量PCR可以直接测定目标基因在微生物群落中的拷贝数或相对量，目前有稀释PCR（LimitingDilutionPeR）、动力学PCR（KineticPCR）!

竞争性PCR（CompetitivePCR）和适时荧光定量PCR。

稀释法定量PCR尽管简单，但它却不能提供准确的定量测定数据，因为在PCR的指数扩增阶段，微小的变异将显著改变PCR产物的产量。

是迄今为止定量最准确、重现性最好的定量方法，己广泛用于基因表达!

转基因研究，药物疗效检测、病原体检测等诸多领域。

（4）基因序列系统发育分析法

该方法是应用DNA测序技术直接将目标基因进行序列测定，并与基因文库中己有的序列进行比较分析来确定微生物群落多样性及其系统发育关系。

该方法能提供各个克隆分类地位的可靠信息，但需要很长的试验周期、大量的试验材料，实际工作中对所有的克隆进行测序难以实现，通常需要与RFLP法或T-RFLP法结合，或者只随机挑选部分克隆进行测序；而且根据克隆的拷贝数估计种群丰度将导入随机误差。

3.1.5基因芯片在环境微生物研究中的挑战

理论上，基因芯片技术提供了为复杂的微生物群落进行全面的和定量研究所必须的优点，然而，与纯培养的研究比较，基因芯片在对环境核酸样品的分析面临几个重要的技术挑战。

首先，基因芯片杂交的内在变化是一个关键问题，目前，很难用同一种方法在不同的实验室和甚至同一个实验室的不同实验间进行数据比较；第二，当有些环境样品提取的DNA或RNA量不够时，基因芯片杂交的灵敏度仍然不够，不清楚是否基因芯片杂交的灵敏度足够检测环境样品中所有类型的微生物；第三，基因芯片研究环境样品产生的数据数量可能很大，但是快速的处理和发掘分析杂交数据仍然处于初级阶段；第四，整个群落的基因数量可能远远超出目前基因芯片的容量；第五，尽管确定微生物群落性状的基因芯片一旦构建成功，该芯片可以提供一种快速方法，但是制备适合于基因芯片分析的高质量的样品成为了研究的瓶颈；最后，基因芯片仅仅是研究的工具，它们应该结合到解决生态或环境的问题和假说中去，只有这样，分析微生物群落基因芯片的力量才能够得到肯定。

3.2环境毒理学研究中的应用

3.2.1病毒检测基因芯片的应用

目前病毒感染的诊断以经典血清学方法、现代免疫学技术和分子生物学方法为主，但在对那些遗传变异频繁的病毒感染进行诊断时，这些方法的程序复杂、工作周期长，不利于快速诊断。

PCR技术应用以来，为病毒感染的诊断提供了高灵敏度的检测工具，但同时非特异产物的增多也容易导致临床诊断错误。

在PCR基础上，利用核酸杂交特异性高的特点，基因芯片能通过平行分析PCR扩增产物快速、准确地鉴别多种病原体，用于高通量、大规模的病毒检测和分型。

3.2.2细菌检测基因芯片的应用

应用基因芯片诊断病原菌的原理，在于细菌的16SrRNA基因的高度保守性。

rRNA基因包括313kb长的23S、116kb长的16S和仅0112kb长的5S三个基因。

其中16SrRNA基因的长度最合适，是目前最常被选用作为细菌鉴定和分类的基因。

目前，几乎所有已知细菌16SrRNA基因的碱基序列均被测定并存入基因库，由于RNA易于降解，多采用检测16SrRNA对应染色体上的16SrDNA序列。

细菌检测基因芯片中16SrDNA靶基因的选用国内外多有利用16SrRNA靶基因制备的细菌检测基因芯片的报道，如美国学者Warsen在2004年根据细菌16SrDNA设计寡核苷酸探针构建基因芯片，对18种细菌进行检测，其中包括嗜水气单胞菌、爱德华氏菌、葡萄球菌、链球菌等15种鱼类常见病原菌，结果能100%特异性地检测出这些病原菌。

细菌检测基因芯片技术作为一种高新技术，例如：

已经在水产中微生物的鉴定、水产动物疾病的快速诊断等方面有广阔的应用前景。

概括起来它的优越性主要有：

（1）以各类致病基因的特异片段为检测样品，可同时检测多种疾病，提高检测效率；

（2）整个过程无需机体免疫反应，少量检测样品就可做出早期诊断；（3）能够测定病原体的耐药性问题，有利于对症下药；（4）该技术由DNA杂交技术和PCR扩增技术相结合，有极高的灵敏度、特异性和可靠性；（5）自动化程度较高，有利于大规模推广应用。

3.2.3基因芯片技术在食品致病菌检测中的应用

基因芯片技术作为一种新的技术平台，已广泛地应用于食品研究领域。

随着该技术的不断完善，其将在食品研究和食品安全中发挥越来越重要的作用。

就基因芯片技术检测食品中常见致病菌的基本原理、检测过程、存在的问题、研究进展作一介绍。

基因芯片的基本原理是将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面，微生物样品DNA经PCR扩增后制备荧光标记探针，然后再与芯片上寡核苷酸点杂交，最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物。

常规检测方法主要有传统生化培养检测法、探针杂交、PCR法。

传统方法是采用细菌培养、生化鉴定与血清分型，由于操作简单、经济而被广泛采用，但检测时限长（一般要1-2周），效率低、灵敏度不高。

常规检测方法检测食品中的致病菌已经不能满足快速检测的要求，难以适应飞速发展的现代食品生产和流通领域，因此为了确保食品的安全性，开发快速检测致病菌的方法，准确地检测食品中的致病菌具有十分重要的意义。

该技术具有传统的检测方法不可比拟的优越性：

1基因芯片可以对食品中的致病菌实行高通量和并行检测，一次实验即可得出全部检测结果；2操作简便快速，整个检测在几小时内即可得出检测结果；3特异性强，敏感性高。

随着基因芯片检测食品中致病菌技术的不断发展和完善，将广泛应用于出入境、食品安全指标、突发事件等致病菌的检测，食品安全必将得到进一步保障，并且将对整个食品领域产生深远的影响。

3.2.4水产动物病原检测基因芯片的应用

随着水产养殖的迅速发展，水生动物病害迅速蔓延。

水产上的细菌病害一直是现代水产养殖业飞速发展的障碍，而将基因芯片技术应用于水产病害中，构建细菌检测基因芯片，是发展的趋势也是应用的实际。

与此同时，不同靶基因的选用也使得细菌检测基因芯片技术不断完善。

目前，分子生物学的核酸探针、斑点杂交和PCR技术已普遍在海水养殖动物疾病检测中开发，并通过不同的组合应用，得到了更高的灵敏度或准确率，如Dot-ELISA、免疫酶标记检测核酸杂交、PCR-核酸探针杂交和实时定量PCR技术使人们能在极广范围内对病原核酸进行精确定量；此外，对水产动物病原的感染机理及病毒生态学研究都有极大的推动作用。

近年来，海水养殖动物的诊断技术已向着同时检测多种病原方向发展，例如同时检测WSSV和IHHNV的PCR技术、同时检测TSV、WSSV、IHHNV的（RT）PCR技术等，这些技术的发展使人们看到了提高检测通量所带来的诱人效率。

基因芯片技术以其无可比拟的高通量和快速准确的检测能力必将会在水生动物病害诊断中呈现迅速发展的趋势。

3.4.5环境毒理学研究中的应用前景

伴随着经济的高速发展，世界各地的快速工业化和城市化使得人类赖以生存的水环境体系面临着前所未有的挑战，特别是改革开放30多年来，我国工农业经济的快速发展，大量工业和城市生活污水排放进入江、河、湖、海，对水环境保护的呼声不断增高，客观上需要大量更具有科学性的、信息内容更加精确丰富的生态毒理学知识来指导和规范人类的活动.基因组学等革新生物技术的开展带来了巨大的基因组学信息量，不断有新物种的全基因组信息被揭示出来，这为基因组学研究方法和技术引入到生态毒理学方面风险因素的评估创造了最佳的时机.基于此开展以DNA芯片研究生态毒理学的方法，对比传统的毒理学评价方法，不仅可以减少大量的实验动物数量和实验时间，可以获得更多关于毒物作用机制的分子生物学信息，可以减少不确定的动物实验推导结论，由一些众所周知的生物扩展到整个生态中。

3.3环境生态学研究中的应用

3.3.1在生物多样性研究中的潜在应用

生物多样性及其保护是生态学的一个关节问题，也是一个有关国计民生的问题。

尽管，传统的分子生物学技术为确立生物多样性提供了有效的工具，然而，一般来说，这些方法都比较费时费工。

含有对不同微生物具有特异性的标识基因的基因芯片将为微生物的鉴定和生物多样性的研究提供有力、快速、及时的方法。

3.3.2生态环境中检测的应用

利用基因芯片众所周知的微型化、集成化、自动化特点，将这种基因芯片技术引入到对海洋青鳉鱼的生态毒理学专用型cDNA芯片的构建上来，从而