肺炎链球菌转化模型的成立.docx

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肺炎链球菌转化模型的成立

肺炎链球菌转化模型的成立

赵清，李南，张雪梅，胥文春，朱兴华，张群，尹一兵

【摘要】目的：

成立一种加倍稳固、高效的肺炎链球菌实验室转化模型，以便于对该菌的各类目的基因进行重组改造.方式：

别离用改良方式和既往方式制备肺炎链球菌感受态细胞，转化外源DNA，获取发生了转化的菌株，通过抗生素培育基培育和PCR鉴定是不是发生转化；并计数抗生素挑选平板上的转化菌落，比较二者的转化率，以确信更佳的转化模型.结果：

肺炎链球菌334菌株、31203菌株用改良方式的转化率别离为（±）％，（±）％，高于既往方式的转化率［别离为±×10-3％，±×10-3％］，构建了肺炎链球菌感受态缺点菌株，成立了改良的肺炎链球菌实验室转化模型.结论：

改良的转化模型实现了稳固的肺炎链球菌实验室转化，能方便研究者对该菌进行各类遗传操作，为深切研究其致病的分子机制提供了一个技术平台.

【关键词】肺炎链球菌；转化，细菌；感受态

　　【Abstract】AIM:

ToestablishatransformationmodelofStreptococcuspneumoniaeinlaboratorytopromotethetransformationefficiencyandreconstructitschromosomegenebyimprovingtheprevioustransformationmethod.METHODS:

Thecompetencecellsofwerepreparedusingboththepreviousandimprovedmethods.AftertheexoticDNAwastransformedundercertaincelldensity,thetransformedcoloniesonantibioticplate,whichwasidentifiedbygrowinginantibioticscultureandPCR,werecountedtocomparetheirtransformationrate.RESULTS:

Theimprovedtransformationmodelofinlaboratorywasestablished.Thetransformationrateof334was（±）％and31203was（±）％undertheimprovedtransformationmodel,whichwasrelativelyhigher.Usingthismodel,weconstructed4competencedefectivestrains.CONCLUSION:

Inlaboratory,theimprovedtransformationmodelcanraisethetransformationrateof,whichinducesdifferentintocompetence,andprovidesaresearchtechnologyforfurtherinvestigationonpneumococcalpathogenesis.

　　【Keywords】occuspneumoniae;transformation,bacterial;competence

　　0引言

　　转化是指细菌在自然生长状态下可自发形成感受态（特指细菌能够摄取外来游离DNA的一种状态），摄取外源性DNA，通过同源重组致使基因发生改变的进程.通过转化能够改造细菌基因，进行功能基因组研究，它是研究肺炎链球菌（）生物学功能的重要手腕.本课题组既往的实验室转化模型［1］有两大短处：

一是转化效率不稳固；二是感受态开放时刻较短，不能知足大规模转化的需要.有研究［2］以为冷刺激可能会延长感受态开放时刻，咱们据此对既往转化模型进行改良，即冷冻处置细胞后再做转化，以期克服其短处.

　　1材料和方式

　　材料血清4型标准菌株TIGR4（ATCCBAA334），干粉（美国ATCC微生物菌种保留中心）；血清3型标准菌株CMCC（B）31203，干粉（中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保留中心）；SⅡ型（1和2号菌株）由中国医科院提供；要紧遗传特点经鉴定合格.C+Y培育基：

含5g/LYeast提取物（LacksandHotchkiss,1960）；TSA血平板：

含50mL/L兔脱纤维全血.感受态刺激因子（CSP2）由挪威生命科学大学HavarsteinLS教授惠赠；CP1250的染色体DNA（含有链霉素抗性基因str）由美国Morrison教授惠赠；1d菌株的基因组DNA（含红霉素抗性基因erm的comE断裂基因）由本课题组构建［3］；DNA提取试剂盒（上海华舜公司）；牛血清白蛋白（BSA，Sigma公司）；胰蛋白胨、大豆蛋白胨（Gibco公司）.722分光光度仪（上海仪器分析三厂）；-80℃低温冰箱（日本SANYOMedicalfreezerMDF330型）.

　　方式

　　的生长曲线绘制挑取单个菌落接种于C+Y培育基，37℃培育12h，转接于20mLC+Y培育基中，于37℃水浴孵育，从1h后开始在分光光度仪上测菌液A620nm值，以后每隔1h取样1次.以时刻为横坐标，吸光度为纵坐标绘制细菌的生长曲线.

　　改良的实验室转化模型的成立

　　改良的实验室转化模型取冻存于-80℃冰箱的菌株，培育于CTM培育基（含C+Y培育基，1mmol/LCaCl2，g/LBSA）中，37℃水浴至A550nm＝左右时，将甘油加入上述菌液中，至其终浓度为100mL/L，分装后冻于-80℃，此即为感受态细胞；24h后掏出冻存菌液，在冰上融化，9000g离心1min，弃去上清液，加入100μLC+Y培育基（），使沉淀完全悬浮，加入CSP20μg/L，同时加入CP1250的染色体DNA100μg/L，于37℃孵育90min，铺于含200mg/L链霉素的TSA血平板上，于37℃孵箱培育24～48h，即取得转化菌落.

　　方式学比较取冻存于-80℃冰箱的菌株，别离用上述改良方式和既往方式［1］制备感受态细胞，然后加入CSP220μg/L，并加入CP1250的染色体DNA100μg/L，于37℃孵育90min，铺于含200mg/L链霉素的TSA血平板上，于37℃孵箱培育24～48h，计数抗生素血平板上的转化菌落.转化率=平板菌落数/细菌总数×100%.其中，细菌总数按A620nm=时，细菌数为5×1011cfu／L计算.

　　感受态缺点菌株的制备及鉴定

　　感受态缺点菌株的制备用上述改良的转化方式制备感受态细胞，然后加入CSP220μg/L，及含comE断裂基因的染色体DNA（即1d菌株DNA）100μg/L，于37℃孵育90min，铺于含mg/L红霉素的TSA血平板上，于37℃孵箱培育24～48h，挑取平板上的转化菌落，接种于含mg/L红霉素的C+Y培育基中，37℃培育增菌，当菌密度为A620nm=左右时，冻于－80℃冰箱保留，即取得缺点菌.

　　感受态缺点菌株的鉴定鉴定1：

将野生菌和缺点菌同时做转化，选用CP1250的DNA为外源基因.鉴定2：

提取野生菌和缺点菌的染色体DNA，用comE（5′TGCTCAGTCAATTGTCTATGCTCG3′，5′ACCAACGGACCTTCTATCTGTAGC3′）和erm（5′CCGGGCCCAAAATTTGTTTGAT3′，5′AGTCGGCAGCGACTCATAGAAT3′）的引物［4］做PCR.加入comE或erm的上、下游引物5μmol/L，加入MgCl2μmol/L，TaqplusDNA聚合酶1U.循环参数为95℃5min预变性；94℃1min,55℃1min,72℃min,30个循环；72℃10min.15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定.

　　统计学处置：

依照资料类型采纳t查验，以P<为不同有统计学意义（双侧）.　　2结果

　　的生长曲线菌株334和31203的生长曲线无明显不同，生长情形大体一致（图1）.

　　图1肺炎链球菌334和31203菌株的生长曲线（略）

　　改良的实验室转化模型取得334和31203菌株的转化菌株，转化率别离为％和％.方式学比较实验结果显示，菌株334和31203用改良转化模型后，两株细菌的转化率皆比用既往转化模型的转化率高两个数量级，不同有统计学意义（P<，表1），改良转化模型的转化效率明显优于既往转化模型.

　　表1肺炎链球菌（）334和31203菌株用不同转化模型的转化率比较（略）

　　aP<vs既往方式.

　　感受态缺点菌株的取得利用含comE断裂基因的染色体DNA转化334，31203，1和2号菌，别离取得转化菌落，即为感受态缺点菌，转化率别离为％，％，％和％.鉴定1：

将野生菌和缺点菌同时转化抗链霉素（str）的DNA，野生菌取得转化菌株，而缺点菌无一个菌落生长.鉴定2：

以野生菌和缺点菌的染色体DNA为模板，以comE和erm的引物做PCR，缺点菌别离在1515bp和726bp处有产物，而野生菌那么无这两个片段的产物（图2）.

　　M：

2000bpladderDNAmaker；1～4：

取得的334，31203，1，2号菌株的感受态缺点菌DNA含有erm基因；5～8：

取得的334，31203，1，2号菌株的感受态缺点菌DNA含有comE断裂基因.

　　图2肺炎链球菌感受态缺点菌株（略）

　　3讨论

　　是自然界能够发生自然转化的一种条件致病菌，在目前发觉的能够发生自然转化的几种细菌中，的转化率最高［5］.转化后可发生基因同源重组，因此仍是基因敲出、基因突变的有利工具，关于细菌功能学的研究很有帮忙，因此咱们需要把握在实验室的稳固、高效的转化模型，以便于对其基因功能和致病机制进行深切研究.的转化受密度感应系统的操纵，当细菌生长到必然密度时，感受态会受到抑制，自然状态下，感受态开放时刻仅十几分钟，因此很难在实验室条件下捕捉到的自然转化.人工纯化合成的CSP能诱导转化，使在实验室转化成为现实.但是既往的转化模型不够稳固，且不适合大量持续的实验室转化，有待改良.的荚膜较厚，会妨碍外源DNA的转入，冷冻处置可能会减弱荚膜的形成，使其转化率增加［6］，且有研究以为冷刺激会延长细菌感受态开放时刻，因此咱们在细菌自然生长适合的菌密度时（许多研究以为现在处于自然转化期）冷冻感受态细胞，然后利用CSP进一步诱导转化.

　　本课题组的前期实验［1］已试探出适合的转化培育基、pH及培育时刻（菌密度）等，咱们通过绘制31203菌株和334菌株的生长曲线，发觉二者的生长情形大体一致，因此对334菌株采纳相同的转化体系和条件.咱们的结果显示，在实验室条件下，运用选定的转化体系和条件，能将外源DNA转入细菌，且改变了细菌的生物学性状，使其产生了抗生素抗性，成功地成立了改良的实验室转化模型.两种菌株采纳改良的转化模型后，其转化率均明显高于既往转化模型，说明冷冻处置感受态细胞能有效提高其转化率；且改良模型能够一次制备大量感受态细胞，操作简便，可持续利用感受态细胞.因此改良的实验室转化模型相当稳固、高效.

　　comE是调控感受态的关键基因，各类环境因素对转化发生的调剂都是通过直接或间接方式阻碍comE的表达来实现的［7-8］.咱们选用该基因为目的基因，将含comE断裂基因的DNA转入野生菌，取得感受态缺点菌株，实验证明这些缺点菌的确不能发生转化，可用于下一步相关研究.说明能够通过稳固的实验室转化模型，改造那些具有自然转化特性的细菌（如）的各类基因，进而观看细菌发生的转变.采纳这种模型方便了对细菌进行各类遗传操作，为深切研究其致病的分子机制提供了一个技术平台.

　　致谢美国加州大学Morrison教授惠赠CP1250的DNA，挪威生命科学大学HavarsteinLS教授惠赠CSP2，在此表示衷心感激.

【参考文献】

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　　［8］GuiralS,HenardV,GranadelC,etal.InhibitionofcompetencedevelopmentinStreptococcuspneumoniaebyincreasedbasallevelexpressionoftheComDEtwocomponentregulatorysystem［J］.Microbiology,2006,152:

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