生物技术药物重点.docx

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生物技术药物重点

第一章生物技术药物学概述

１．药物（medicine，remedy）是指用于预防、治疗和诊断或用以调节机体生理功促进机体康复、保健的物质。

２．药品（drug），按《中华人民共和国药品管理法》的法定含义是指用于预防、治疗、诊断人的疾病，有目的地调节人的生理机能并规定有适应证、用法和用量的物质

3生物药物：

利用生物体、生物组织或器官等成分，综合运用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学的原理与方法制得的一大类药物。

4生化药物是指运用生物化学研究成果,由生物体中起重要生理生化作用的各种基本物质经过提取,分离,纯化等手段制造出的生物活性物质

5生物技术药物就是利用生物工程技术制造的药物，它和传统的化学药物以及从动、植物中提取药物的最大区别在于生产过程。

6生物制品（biologics）：

“生物制品是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、酶工程、发酵工程等生物技术获得的微生物细胞及各种动物和人源的组织和液体生物材料制备，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品”,将通过生物技术加工制造的产品均归为生物制品。

7药物效应动力学（pharmacodynamics）是研究药物对人体和病原体的作用及其作用机制和作用量的规律的科学。

同时也研究机体与环境因素对药物作用的影响

8特异性药物作用的机制：

通过化学结构与机体生物大分子的特定活性部位结合，产生一系列生理效应。

9受体（receptor）：

受体是一类介导细胞信号转导的功能物质，是一些能与生物活性分子如神经递质,激素,药物等相互作用的分子.

细胞膜受体;多肽蛋白质和儿茶酚胺受体

细胞质受体：

肾上腺皮质激素

细胞核受体：

性激素

10激动剂：

有很高的亲和力和内在活性，与受体结合时能产生最大药理效应。

11跨膜信号转导有四种机制：

A．脂溶性药物可以通过细胞膜，作用于胞内受体。

B．配体与跨膜受体结合，使胞内酶产生变构活性调节。

C．通过配体-门控跨膜离子通道进行信号转导。

D．通过G-蛋白偶联的受体进行信号转导

12耐受性：

一些药物在指定剂量时，其反应强度在治疗过程中可能会发生改变，随着连续给药，反应性通常降低，产生对药物作用的耐受性，当一种药物给药后反应迅速降低时，此种反应称为快速耐受性。

13病原微生物对抗微生物药物产生的耐受性称抗药性（resistance）

14麻醉药品或精神药品连续使用时还可产生药物依赖性（drugdependence）

15生物技术药物的主要品种类型

1）.细胞因子干扰素类

2）细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子

3）.造血系统生长因子类

4.）生长因子类

5）重组蛋白质与多肽类激素

6）.心血管病治疗剂与酶制剂

7.）重组疫苗与单抗制品

8.）基因药物

16未来10年的生物技术药物

（１）肿瘤

　（２）神经退化性疾病

　（３）自身免疫性疾病

　（４）心脑血管疾病

　（５）病毒感染性疾病

　（６）基因治疗和转基因技术

17生物技术药物研究技术进展

1．生物技术药物表达系统研究进展

1）大肠杆菌表达系统

2）昆虫细胞表达系统

3）酵母表达系统

4）植物表达系统

5）哺乳类细胞表达系统

6）转基因动物与动物克隆技术

2三股螺旋DNA,技术

脱氧寡核苷酸能与双股螺旋双链DNA特异性序列结合,形成三股螺旋DNA,这种三螺旋结构可阻止转录RNA和DNA的复制,。

第二章

1新药（NewDrugs）新药系指未曾在中国境内上市销售的药品。

对已上市药品改变剂型、改变给药途径、增加新适应症的药品注册按照新药申请的程序申报，但改变剂型但不改变给药途径，以及增加新适应症的注册申请获得批准后不发给新药证书（靶向制剂、缓释、控释制剂等特殊剂型除外）

2先导化合物：

从众多天然来源或化学合成的候选化合物中发现具有进一步研究开发意义的物质，具有特定生理活性的化合物,可作为进行结构修饰和改造的模型,从而获得预期药理作用的药物称为先导化合物，是新药研究的起始和基础。

3新化学实体（NewChemicalEntities,NCEs）指以前没有用于人体治疗并注定可用作处方药的产品，可以治疗、缓解或预防疾病或用作体内疾病的诊断。

4新药研究开发过程

化合物发现基本特性研究床前研究申报临床试验临床试验（123期）申报试生产申报生产证书产品投放市场后市场跟踪分析

5高通量药物筛选（highthroughputscreening,HTS）主要由自动化操作系统、高灵敏度检测系统、分子细胞水平的高特异性体外筛选模型及被筛样品管理库（即样品库）的建立、数据采集传输处理系统等5个主要部分组成,使实验过程程序化,有合理、科学的管理系统。

6高内涵筛选是指在保持细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节的影响，在单一实验中获取大量相关信息，确定其生物活性和潜在毒性。

7合理药物设计：

是以某一疾病发生的分子机制为基础，进一步确定药物作用的靶物质，并尽可能阐明靶分子的结构与功能，再以靶分子为对象设计药物分子，使其能专一结合于靶分子的活性部位（如酶的活性中心），从而能改变靶分子的活性以发挥药物分子的治疗作用。

8组合化学：

采用化学、生物学或生物合成方法，把诸如核苷酸、氨基酸、单糖以及各种小分子，系统地装配成不同的组合，高效自动化合成结构多样性，具有多种特征的大量分子，建立可供筛选的化学物质库。

建立分子多样的化学库有两种方法：

一是生物途径，利用生物系统产生多样性库；二是化学合成法，将一些小分子通过合成程序装配成不同的组合。

通过组合化学技术可以合成各种小肽和多肽，建立多肽组合库，在得到各类组合库以后，就可以通过自动筛选方法进行筛选。

9模仿创新也称快速跟踪创新或“metoo”创新，是在不侵犯他人专利权的基础上，对已知药物的药理、毒理、代谢及临床效果、作用机理、构效关系等进行充分研究，然后以该药为先导化合物进行结构修饰或改造，得到的改进的化学实体。

等同性是指与所记载的技术特征以基本相同的手段，实现基本相同的功能，到达基本相同的效果，并且本领域的普通技术人员无需创造性的劳动就能联想到的特征。

11技术药物的临床前毒性评估有些试验项目较难判定主要原因有：

（1）生物技术药物的种族特异性

（2）生物技术药物与化学药物比较，各个批量产品之间有较大不同。

（3）在长期毒性研究中，可能引起免疫应答。

（4）在某些情况下，尚缺少合适的有效分析方法。

12临床试验规范（goodclinicalpractice,GCP），是新药进行临床试验的标准化管理措施。

要求在试验全过程中试验资料必须完整，准确，和可靠，从伦理性方面要求受试者的权益、安全、隐私等受到保护。

13GCP的基本内容

1确认临床试验单位及研究人员的资格和职责

2对试验的医疗机构的技术、设备条件和参加试验的研究人员具体要求。

3对受试者的安全性保护执行

4试验用药品管理

5研究单位与临床单位之间协议书的内容与要求

6对试验方案的具体要求

5研究单位与临床单位之间协议书的内容与要求

6对试验方案的具体要求

7有关临床试验设计的内容与要求

8有关试验程序的详细规定

9数据处理与统计分析的要求

10临床试验记录与保存的要求

11确保GCP实施的有关监督与管理规定

14实施GCP要求

合格的研究人员

标准化的实验室

科学的临床设计

完善的组织领导体系

15药品注册

是指国家食品药品监督管理局根据药品注册申请人的申请，依照法定程序，对拟上市销售的药品的安全性、有效性、质量可控性等进行系统评价，并决定是否同意其申请的审批过程。

16药物的临床研究

临床试验（clinicaltrial）：

指任何在人体（病人或健康志愿者）进行药物的系统性研究，以证实或揭示试验药物的作用，不良反应或药代动力学资料，目的是确定实验药物的疗效与安全性。

是在新药临床前研究结果的基础上，通过临床试验确定其疗效，适应症，治疗方案、给药途径、给药方法、给药剂量、不良反应和禁忌症等。

　I期临床试验：

初步的临床药理学及人体安全性评价试验。

II期临床试验：

治疗作用初步评价阶段。

　III期临床试验：

治疗作用确证阶段。

　IV期临床试验：

新药上市后应用研究阶段。

第三章

1生物技术药物生产一般过程

获得目的的基因构建重组体构建基因工程菌（或工程细胞）

大规模培养工程菌产物分离纯化除菌过滤半成品检定

制剂成品检定包装

2质量保证体系：

药品的质量保证起始于新药的研究与开发，并贯穿于生产销售和使用的各个环节。

1.研究与开发者，临床前研究，GLP（goodlaboratorypractice药品非临床研究质量规范）

2.临床研究单位，GCP（Goodclinicalpractice药品临床试验管理规范）

3.药品生产企业，GMP（GoodManyfacturingpractice药品生产质量管理规范）

4.药品经销商，GSP（Goodsupplyingpractice医药商品质量管理规范）

5.医院，消费者，GUP（Goodusepractice医药商品使用管理规范）

6.中药栽培企业，GAP（GoodAgriculrurePractice中草药栽培规范）

7.医院药房和药剂科，GPP（GoodPharmacyPractice医院药房质量管理规范）

3GMP的具体工求：

1.制订完整的生产工艺，并能作系统回顾检查。

2.关键生产工艺及其重大变更都经过验证。

3.GMP必要的资源均已落实。

4.相关设施有适当的书面操作指南和规程。

5.操作人员经培训能按规程正确操作。

6.生产过程均有记录，所有重大偏差记录完整并进行了全面调查。

7.药品的生产记录妥善保存，方便查阅，可追溯每一批产品的全部历史。

8.产品发运将影响质量的风险降至最低限度。

9.已建立完整的体系，可撤回任何一批已发放上市的产品

10.对上市药品的所有投诉进行查处，调查造成质量缺陷的原因，并采取整改及预防措施。

4洁净区：

是安装有制药设备并受严格环境洁净控制的区域，注射剂或无菌生物药物必须在洁净区生产，洁净区需特殊设计以防止产品受到污染，常见的污染物有微生物与颗粒物质。

5工艺规程masterformulae阐述生产一定量的某一药品所需原料、辅料、包装材料、半成品和成品的质量标准及批生产处方，生产规程，作业方法，中间控制方法和注意事项的一套文件。

是药品生产和质量控制中最重要的文件。

6生产重组药物的表达系统及比较

表达体系

产物

产生部位

培养方式

提纯

产物活性

潜在危险性

大肠杆菌

多肽、蛋白质

或融合蛋白质

菌体内

容易

部分可获高产

一般

对原核者好

真核者稍差

不大

酵母

多肽、蛋白质

或糖基化蛋白

菌体内或分泌出细胞

容易

可高产

菌体内稍

复杂

真核的接近

天然

不大

哺乳动物细胞

完整

糖基化蛋白

分泌出细胞

较难、成本高

可高产

简单

几乎可为天然产物

需注意有致癌因素

7融合蛋白表达：

有目的地把两段或多段编码功能蛋白的基因连接在一起,进而表达所需蛋白，这种通过在人工条件下将两个或多个基因的编码区首尾连接,由同一调控序列控制构成的基因表达后所得的蛋白质产物称为融合蛋白（fusionprotein,FP）.

把目的蛋白通过一个短肽（可被肠激酶识别的序列）与硫氧还原蛋白连接构成的表达质粒具有很高的表达水平，且表达产物聚集于粘附区，有利于通过渗透振扰提取使产物进入介质。

8转基因动物：

是指通过基因工程的手段对动物基因组的结构或组成进行人为的修饰，并通过相应的动物育种技术使这些经修饰改造后的基因组在世代间得以稳定的传递和表达。

9纯化过程的质量控制

常用分级沉淀、超滤、电泳、色谱等技术，以去除微量DNA、糖类、残余宿主蛋白、纯化过程带入的有害化学物质、致热原，或将其减少至允许量。

亲和层析技术应注意Ab从载体脱落而污染产物

如真核细胞表达的制品反复多次使用，要求纯度达98%以上；

原核细胞表达的多次使用制品纯度达95%以上即可；

应考虑纯度、纯化倍数、收率，应尽量不加入对人体有害的物质，若不得不加入，应设法除净，并在最终产物品中检测残留量，还要考虑到多次使用后的蓄积作用。

10终产品基因工程药物的质量控制主要包括以下几项要求:

产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。

它需要利用生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学等多学科的理论与技术所建立的鉴定方法。

11肽图分析：

应用合适的酶或化学试剂使所选的产品片段产生不连续多肽,对生成的肽段进行分离分析。

它是检测蛋白质一级结构最有效的方法，该技术灵敏高效,是对基因工程药物的分子结构和遗传稳定性进行评价和验证的首选方法。

12氨基酸成分分析:

采用微量氨基酸自动分析仪测定，包括甲硫氨酸，半胱氨酸及色氨酸的准确值。

结果应为三次分别水解样品测定后的平均值。

在试生产的头三批或改变工艺时必须检测。

13部分氨基酸序列分析:

N端15个氨基酸可作为重组蛋白质和多肽的重要鉴定指标。

中试前三批产品至少测N-端15个氨基酸；C-端1-3个AA序列

14重组蛋白质浓度测定和相对分子量的测定

蛋白质浓度测定方法有:

福林-酚法、双缩脲法

蛋白相对分子量的测定:

凝胶过滤法、SD-SPAGE法，分子筛层析法，还原型SDS-PAGE（±10%），质谱法。

15蛋白质二硫键分析测定方法有:

对氯汞苯甲酸法等

5，5’-二硫基双-2-硝基苯甲酸法

质谱法

16生物学活性测定

需通过动物体内试验和通过细胞培养进行体外效价测定。

生物学效价测定：

应尽量采用国际通用办法，用国家标准品进行校正，以动物体内试验或体外细胞培养法测定制品的生物学活性，并标明其活性单位。

变异性较大，必须采用标准品或对照品进行校正。

15消旋作用:

是在一个以上的不对称中心发生的构型改变。

消旋作用的发生取决于碱催化α-碳质子离子化成为负碳离子中间体，进而使氨基酸由L型转为D型。

16提高生物药物稳定性的途径

定点突变化学修饰PEG修饰添加剂冻干

第四章

1细胞因子（Cytokine,CK）主要是由免疫细胞分泌的、在体内含量极低、具有多种生物学活性的小分子多肽、蛋白质或糖蛋白的统称。

2干扰素的JAK-STAT通路

•　　JAK的底物为STAT，即信号转导子和转录激活子（signaltransducerandactivatoroftranscription，STAT），目前已有6种STAT得到确认。

STAT被JAK磷酸化后发生二聚化，然后穿过核膜进入核内调节相关基因的表达，这条信号通路称为JAK-STAT途径。

配体与受体的结合促进受体的二聚化，使与受体连接的JAKs相互靠近，并发生磷酸化，活化的JAKs进一步使受体的特定酪氨酸发生磷酸化而促进一种或多种胞浆蛋白STATs家族成员与受体连接并发生磷酸化激活。

活化的STATs转运到细胞核，直接对干扰素和其它细胞因子的基因表达进行调控。

3临床应用

1.干扰素IFN-α：

干扰素α-2a和干扰素α2b已批准用于毛细胞白血病的治疗

扰素-α2b和αn3已经被批准用于治疗由人乳头瘤病毒感染引起的性传播生殖疣

2.干扰素-β;治疗间歇复发性的多发性硬化症减缓身体残障的加速发

3干扰素-r慢性肉芽瘤，风湿性关节炎

4干扰素应用中的不良反应

　　流感样症状等全身不良反应

实验室检查指标异常

52ˊ-5ˊAS（2ˊ-5ˊ寡腺苷酸合成酶）

在ＩＦＮ和敏感细胞膜上的受体作用下,细胞合成大量无活性的2-5ＡＳ,当有双链核糖核酸（ｄｓＲＮＡ,为各种病毒复制过程中的一种中间产物）存在时,新合成的2-5ＡＳ被激活,它以ＡＴＰ为底物,催化合成一系列热稳定的、以2′,5′磷酸二酯键相连接的寡聚腺苷酸片段即2-5Ａ,其片段长度不等,ｎ在2～14之间;所生成的2-5Ａ又可作为一种激活剂激活细胞内存在的通常处于非活性状态的ＲＮａｓｅF，L。

活化的ＲＮａｓｅF，L则可以降解病毒的ｍＲＮＡ和细胞的ＲＮＡ,从而抑制蛋白质的合成。

第五章

1白介素（interleukin,IL）:

主要由白细胞产生，介导白细胞间相互作用，具有免疫调节活性，调节细胞的生长分化，介导炎症反应的细胞因子。

2白介素的生物学功能

1、参与免疫应答和免疫调节。

2、刺激造血细胞发育、分化和参与损伤组织的修复。

3、参与神经-内分泌系统和其它细胞因子共同构成细胞间信号传递的分子系统。

4、参与细胞凋亡和抗肿瘤作用

5、参与炎症反应和免疫病理性的组织损害。

3人IL-2的基因结构及表达产物的分子结构

●基因定位于4号染色体上,长5kbp,4个exon,3个intron组成.人和小鼠IL-2基因DNA序列有63%同源性。

●IL-2前体多肽153AA残基，去除N端20个AA信号肽，成熟的IL-2由133AA构成

●人IL-2有4组α螺旋和一个连接环组成。

4IL-2结构与功能关系

（1）螺旋A与结合IL-2受体β链有关。

其中Asp20和Leu17高度保守，用Lys取代后可使IL-2完全失去活性和结合能力。

（2）螺旋A和螺旋B-B’中的Lys35、Arg38、Phe42或Lys43与IL-2结合IL-2受体α链的有关。

用Ala代替Arg38后，IL-2则不能与IL-2受体α链结合。

（3）螺旋D中的Gln126与IL-2结合γ链有关。

（4）Leu17、Phe44和Trp121是IL-2的活性位点。

（5）除去IL-2N端1-10AA，活性下降30-50%。

除去IL-2N端1-20AA，活性消失。

（6）Cys58,Cys105,Cys125，Cys58-Cys105形成二硫键，在保持IL-生物学活性上起关键作用。

Cys125易使IL-2形成链间二硫键，形成二聚体，使IL-2活性下降。

在IL-2基因产物的提纯和复性过程中，如二硫键配错或分子间形成二硫键都会降低IL-2的活性。

改变IL-2的氨基酸序列或分子结构，均会影响其活性效应。

5IL-2R具有多种形式，故结合IL-2的亲和力也不同。

α链和β链亲和力低，不能传导信号,单独γ链也不能结合IL-2；

α/β异二聚体是IL-2R主要存在形式，具有高亲和力，但易解离；

β/γ异二聚体具有中度亲和力，

α/β/γ链三聚体具有高亲和力，且不易解离，故能有效地传导信号。

6IL-2临床应用;抗肿瘤治疗，抗感染治疗

7白介素-11（IL-11）由骨髓基质细胞产生的一种细胞因子。

这种因子与脂肪形成抑制因子（adipogenesisinhibitoryfactor,AGIF）是同一物质，所以又名脂肪细胞生长抑制因子。

主要作用于髓系干细胞、B细胞、巨核细胞、浆细胞瘤细胞和脂肪细胞。

8IL-11是一个多功能性的细胞因子，在骨髓造血调控中发挥重要作用。

其重要生物学活性是可以单独或协同其它细胞因子刺激骨髓造血干细胞的增殖与成熟，协同IL-3可促进巨核细胞集落形成及骨髓多系祖细胞的扩增和分化，促进B细胞发育和增强机体对抗原物质的初次及再次免疫应答。

能抑制脂肪细胞分化及脂蛋白酶的活性。

9肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor,TNF）是一类能直接造成肿瘤细胞死亡的细胞因子。

根据其来源和结构的不同分为TNF-α和TNF-β两种类型。

10hTNFα:

前体蛋白含有233个氨基酸，其中内含76个氨基酸残基的特长先导信号肽，该信号肽在翻译过程中不被切除，而是成为跨膜TNF，酶解去除信号肽后，成为分泌型TNF，成熟的TNFα157AA。

成熟的TNF-α不需糖基化，Cys69-Cys101二硫键，TNF-α单体的分子量为17kDa，其活性单位为三聚体（51kDa），三个单体组成三角棱锥体。

11TNFR：

I型与TNF-α和TNF-β结合，Ⅰ型受体转导的信号与细胞毒性和内毒素休克有关。

II型与TNF-α和TNF-β结合,Ⅱ型受体与TNF的亲和力是Ⅰ型受体的10倍。

Ⅱ型受体转导的信号可促进T细胞的增殖。

与I型结构相似，但对TNF亲和力显著高于I型。

TNF副作用

寒战，发热，流感样症状，生化指标异常，毛细血管渗漏综合症及中枢神经系统症状。

第六章

1TPO两个结构域：

EPO样N端结构域：

是由153AA，有完整的TPO活性，与EPO同源，且高度保守。

在该区中有4个Cys，形成两对二硫键。

这两对二硫键是维持TPO活性所必需。

富糖基化的C端结构域：

179AA，有6个N位的糖基化位点,与目前已知的任何细胞因子无同源性。

起稳定分子，延长半衰期的作用。

两个结构域之间有两个串联的精氨酸连接。

2.生物学功能

（1）体外作用TPO对巨核细胞的发育、成熟，最后分化成血小板的整个过程都起作用。

（2）体内作用TPO可以促进早期红系祖细胞，粒细胞-巨嗜细胞系集落形成单位（CFU-GM）和定向巨核系祖细胞（CFU-MK）的增殖。

对外周红细胞无影响，仅对巨核细胞系有特异作用。

与EPO、G-CSF、干细胞因子（SCF）,及ＩＬ-3等细胞因子协同作用,共同促进红系和粒系祖细胞增殖,促使造血细胞干细胞进入增殖周期。

3G-CSF和GM-CSF生物学作用的异同点

（1）G-CSF特异性刺激中性白细胞，而GM-CSF则是所有粒细胞的总刺激因子。

（2）GM-CSF是单核细胞和巨噬细胞的强激活剂，而G-CSF则不是，如需要提高单核细胞和巨噬细胞活性，可选用GM-CSF，而不是G-CSF。

（3）GM-CSF是中性白细胞移动的强抑制剂，而G-CSF则会增强中性白细胞的移动。

当局部损伤时，GM-CSF可在局部产生，起弱的化学诱导剂作用，抑制炎症细胞离开炎症部位，而G-CSF则能增强炎症细胞向炎症部位移动。

4人第五号染色体上细胞因子：

IL-3、IL-4、IL-5、IL-13、M-CSF、GM-CSF、ECGF（内皮细胞生长因子）

5GM-CSF生物学活性

（1）促进造血祖细胞增殖/分化，尤其是那些生产中性粒细胞（粒细胞的变种）和巨嗜细胞的造血祖细胞。

对于嗜酸性细胞、红细胞和巨核细胞，GM-CSF也有促进其增殖和分化的作用。

体内研究也证明，这种细胞激素能提高造血能力。

（2）刺激骨髓细胞形成，CFU-G，CFU-M，CFU-GM

（3）增加中性粒细胞、单核细胞、T淋巴细胞数量。

（4）促进吞噬细胞、淋巴细胞对肿瘤细胞的裂解作用。

（5）增强成熟造血细胞的活性，提高吞噬能力，对微生物的杀伤力，提高白细胞的趋化作用

6GM-CSF临床应用肿瘤化疗所致的造血障碍艾滋病治疗骨髓异常增生综合症骨髓移植

7促红细胞生成素（EPO）

产生部位：

肾小管基底膜外侧的肾小管周围间质细胞，其分泌受组织内氧分压调节

生物学功能1促进红系细胞的生长，分化和增值2促进红细胞成熟3抗氧化作用

临床应用1肾功能衰竭所致的贫血2癌性贫血3结缔组织贫血骨髓增生异常综合症贫血

不良反应血压升高和惊厥

第七章

1胰岛素样生长因子（IGFs）生长素诱导靶细胞产生的一种具有促生长作用的肽类物质。

2IGFs生物学活性：

与刺激细胞生长和分化的生长因子功能有关

1）IGFs-1，2启动胚胎生长和发育起重要作用

2）IGFs-1介导生长激素的大多数生长启动效应

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