miRNA 参与槐耳颗粒抗癌作用的分子机制研究.docx

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miRNA参与槐耳颗粒抗癌作用的分子机制研究

题目：

miRNA参与槐耳颗粒抗癌作用的分子机制研究

MolecularmechanismofmiRNAsonanticancerinducedbyHuaiergranule.

摘要：

恶性肿瘤是一类严重危害人类健康的疾病，已成为我国首要的死亡原因，占到死亡原因的20%以上。

恶性肿瘤的发生发展是一个多基因参与、多因素、多步骤的复杂的生物学过程。

金克槐耳颗粒（Huaiergranule）是国家级广谱抗癌中药，其主要抗癌活性成分为蛋白多糖（PS-T）。

微小RNA（microRNA，miRNA）是近年来发现的重要的负性调节分子，与肿瘤的发生、发展、预后密切相关。

本研究拟深入探讨抗肿瘤药物槐耳颗粒（Huaiergranule）抗癌作用的分子机制，分别从槐耳颗粒诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤侵袭转移、以及调节免疫功能等方面研究这些作用中miRNA及其相关基因表达的改变，应用生物信息学技术、分子生物学技术等证实miRNA参与槐耳颗粒诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞侵袭转移、免疫调节等作用的分子机制，为应用槐耳颗粒治疗恶性肿瘤提供理论和实验依据。

关键词：

槐耳颗粒；肿瘤；微小RNA；抗癌；基因表达

KEYWORDS：

Huaiergranule；Tumour；MicroRNA；Anticancer；Geneexpression

一、

报告正文：

参照以下提纲撰写，要求内容翔实、清晰，层次分明，标题突出。

（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）：

1.项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。

附主要参考文献目录）

恶性肿瘤是一类严重危害人类健康的疾病，随着分子生物学的进步，人们已经认识到肿瘤的发生发展是一个多基因参与、多因素、多步骤的复杂的生物学过程，癌基因的激活和抑癌基因的失活被认为是细胞生长失控、异常增值至癌变的重要原因[1]。

目前全球恶性肿瘤死亡人数高于艾滋病、结核病和疟疾死亡人数的总和，并呈逐年增加的趋势。

卫生部日前公布的统计显示，在中国恶性肿瘤已成为首要死因。

缺乏有效的早期诊断和治疗手段是两大主要原因。

早期癌瘤一般有80-90%的治愈率，而晚期癌的5年存率一般均极低，因此寻找特异性早期诊断的分子标志以及靶向基因治疗的新的策略成为当前肿瘤基础与临床研究的热点。

MiRNA是近年来发现的一类长度约22个核苷酸内源性非编码小分子RNA，具有高度的保守性、时序性和组织特异性，通过促使靶mRNA降解或抑制其翻译来调节靶基因的表达，在细胞的分化、增殖和调亡，个体发育、机体代谢，以及肿瘤、病毒感染等多种疾病中都具有重要的作用，是当前生命科学领域的研究热点和前沿之一[2]。

目前已发现900多种人类miRNA，大约92%的人类基因被miRNA所调节，被认为是最重要的调节分子之一。

MiRNA与肿瘤密切相关，约52%的miRNA编码基因位于肿瘤相关基因位点和脆性染色体区域[3]；在肿瘤中miRNA异常表达且具有组织特异性，不同肿瘤组织miRNA表达谱不同[4]；进一步研究表明miRNA作为癌基因或抑癌基因，以抑癌基因表达降低或者癌基因表达增强的方式促使肿瘤的发生[5]。

miRNA可能成为肿瘤诊断的新的分子标志物和治疗及预后判断的分子靶点，由于miRNA在转录后水平调节基因的表达，因此更有利于肿瘤的早发现、早诊断和早治疗，必将具有广泛的临床应用前景[6]。

金克槐耳颗粒的主要成分槐耳，是一种生长在中国古槐树上的一种药用真菌——槐栓菌，其入药史已有1500余年，含有多钟有机成分和十余种矿物质元素，其主要抗癌活性成分为蛋白多糖（PS-T）[7]。

PS-T的化学结构为由6种单糖（L-岩藻糖，L-阿拉伯糖，D-木糖，D-甘露糖，D-半乳糖，D-葡萄糖）组成的杂多糖结合18种氨基酸构成的蛋白质[7,8]。

金克槐耳颗粒为国家中药一类新药，由南京中医药大学对槐耳子实体进行提取分离制成，抗癌谱广、抑瘤率高、药效稳定性高，无明显毒副作用，既能单独使用又可作为联合用药，能明显提高生活质量及延长病人的生存期。

据报道，在临床上对中晚期肝癌具有独特疗效，无明显毒副作用；槐耳颗粒联合其他化疗药物用于治疗肝癌、非小细胞性肺癌、大肠癌、晚期胃癌、复发性非霍奇金淋巴瘤等[9-12]及其他恶性肿瘤等均有独特疗效。

已有实验表明槐耳清膏的抗癌作用包括诱导癌细胞凋亡、抑制癌细胞增值、抑制癌细胞侵袭转移和对免疫系统的调节，但是这些抗癌作用的分子机制尚不清楚。

有文献报导miRNA参与到肿瘤细胞凋亡过程之中,相关研究发现在神经胶质瘤细胞和病理样本中凋亡诱导因子PDCD4蛋白水平的低表达和miR-21高表达相关；在神经胶质瘤细胞系T98G中，miR-21在转录后水平抑制了PDCD4的表达，而外源过表达的miR-21能直接阻止PDCD4翻译对抗凋亡，还可能通过调控其它靶基因干扰PDCD4相关的细胞凋亡。

在乳腺癌MCF7细胞中，抑制miR-21表达可抑制细胞增殖和裸鼠移植瘤的生长，同时凋亡也增加。

在白介素（IL）6缺乏的骨髓瘤细胞中，增加miR-21表达，可明显减少细胞凋亡。

在Hela细胞中使用miRNA抑制剂，可减缓细胞生长速度。

抗癌中药——槐耳颗粒诱导肿瘤细胞凋亡也很可能是通过miRNA发生作用。

所以基于上述科学进展，我们提出假设：

miRNA通过靶向作用于相关基因而参与到槐耳颗粒诱导肿瘤细胞凋亡过程之中。

MiRNA也参与到肿瘤细胞侵袭转移过程中，肿瘤的转移过程包括肿瘤细胞粘附（adhension），细胞外基质（extricelluarmatrix，ECM）降解，细胞移行（migration）三种基本现象[13,14]。

要控制肿瘤细胞侵袭和转移，就必须抑制肿瘤细胞与基质或基底膜或宿主细胞的粘附及肿瘤细胞对基质或基底膜的降解以及肿瘤细胞自身的运动[15]，然而肿瘤细胞侵袭转移过程中每一个步骤背后的分子机制还有待研究。

最近，越来越多的研究报道[16]表明，miRNA与肿瘤细胞的侵袭和转移有关，其调控肿瘤细胞侵袭和转移的作用机制成为miRNA研究领域的热点之一。

Weinberg研究团队的Ma等[17]人是最早研究miRNA分子在肿瘤转移过程中扮演何种角色的科研人员,他们以小鼠为模型，研究miR-9通过调节E-cadherin（黏附蛋白质）和癌症转移的活性，发现：

致癌基因Myc直接控制miR-9活性，miR-9直接针对CDH1激活细胞的移动性和侵袭性，而且miR-9介导的黏附蛋白质下调表达会激活β-catenin信号，激活表达血管内皮生长因子（VEGF）的基因，最终导致肿瘤组织血管发生；在非侵袭性的癌症小鼠模型中，过量表达miR-9（黏附蛋白质编码的RNA）会诱发癌细胞转移到小鼠肺部。

在miRNA与Rho/Rock-1传导通路的关系中，Kong等[18]在鼠正常乳腺上皮细胞中发现，miR-155在TGF-β诱导的上皮间质转化以及RhoA引起的细胞迁移侵袭过程中具有重要作用。

最新研究表明miRNA对基因组中至少30%以上的蛋白编码成份有直接的抑制作用，而在免疫系统中，蛋白调控网络非常重要，所以,miRNA在免疫系统中所起的调控作用不容忽视，miRNA可通过靶向免疫系统中关键信号转导分子的表达,从而在多个环节上参与调控机体固有免疫反应和适应性免疫反应[19]，已知参与免疫调节的miR-146a在系统性红斑狼疮患者中表达不足[20]。

中科院上海巴斯德研究所戈宝学课题组也成功揭示了microRNA在固有免疫中的作用以及调控机制，研究发现miR-101不光可以调节MAPK的反应,进而影响下游炎症因子的分泌；而且PI3K/AKT通路也可以调控miR-101的表达,从而影响MKP-1以及MAPK的表达和活化情况,这表示P3IK/AKT通路可以通过miR-101与MAPK通路进行串扰[19]。

王长谦等[21]利用微阵列和Real-timePCR技术分析氧化性低密度脂蛋白（oxidizedLowDensityLipoprotein，oxLDL）刺激的人原代外周血单核细胞的miRNA表达谱，发现miRNA-125a-5p的表达水平上调超过11倍,并且利用生物信息学预测到它的靶基因为ORP9基因，最后结果表明miRNA-125a-5p可能是oxLDL刺激的单核/巨噬细胞中炎症反应的重要负调控子，而且可能起着保护作用，避免发生过度的炎症以致形成动脉粥样硬化。

本项目拟在我们前期研究的基础上，分别以肺癌、胰腺癌、乳腺癌和肝癌为研究模型，以miRNA为研究核心，应用生物信息学、分子生物学技术手段，探索槐耳颗粒抗癌作用的分子机制，为应用槐耳颗粒治疗恶性肿瘤提供理论和实验依据。

1.槐耳颗粒治疗肺癌的分子机制研究

肺癌是当前世界对人类健康和生命威胁最严重的肿瘤之一，已经成为我国恶性肿瘤死亡原因的首位。

miRNA与肺癌的发生、发展、预后密切相关。

Takamizawa等首先发现肺癌中let-7基因表达下调[22]；随后的研究发现与正常肺组织相比，肺癌中let-7的表达降低50％以上，但是在乳腺癌和结肠癌患者中却只发现零星的let-7表达降低；在肺癌细胞和肝癌细胞中过表达let-7能够抑制细胞周期行进；表明let-7家族可能作为抑癌基因参与肺癌的发生发展中，let-7可能成为肺癌基因治疗的潜在的分子靶标[23]。

与let-7相反，miR-17-92家族作为癌基因在肺癌特别是非小细胞型肺癌中高表达并促进细胞增殖[24]。

Yanaihara等[25]采用微点阵分析法对104例原发性非小细胞肺癌（其中包括腺癌65例，鳞癌39例）进行研究发现：

肺癌组织与正常肺组织比较，有43种miRNA的表达发生了变化，其中15种表达上升，28种表达下降，这些变化的miRNA大部分处于基因易发生缺失、扩增、转位的高发区；对不同组别的检测又发现：

肺腺癌组织与正常肺组织比较，有17种miRNA的表达发生了变化；肺腺癌与肺鳞癌组织比较，有6种miRNA表达发生了变化，这6种miRNA是has-miR-205、has-miR-99b、has-miR-203、has-miR-202、has-miR-102、has-miR-204-prec。

通过检测复发的和没有复发的非小细胞型肺癌中miRNA表达谱发现49%的miRNA存在差异表达，特殊的miRNA表达谱可能成为肺癌预后判断新的指标[26]。

我们前期研究发现预测靶向p53的miR-30d在6种p53野生型肺癌细胞中高表达（图1）。

肺癌中miRNA的表达模式不但与肺癌的诊断、分期、进展、预后相关，也为肺癌的基因治疗以及其他常规化疗药物的开发提供了新的研究方向和思路[27]。

图1.miR-30d在p53野生型肺癌细胞中的表达

1.1.槐耳颗粒诱导肺癌细胞凋亡、抑制肺癌细胞增值的分子研究机制

据报道，槐耳能阻止人肺腺癌细胞A549由S期进入G2/M期，表现为G1峰前出现一个sub-G1峰，诱导细胞凋亡[11]。

而且槐耳清膏除了自身有诱导凋亡作用外，还可以逆转人肺腺癌细胞对顺铂的耐药作用，提高A549对顺铂的敏感性[12]。

不仅如此，槐耳清膏在体外对人高转移大细胞肺癌细胞L9981具有不同程度的生长抑制作用，该作用呈剂量依赖性；同时槐耳清膏可能参与调控血管生成相关基因mRNA的转录，减弱肿瘤细胞的侵袭力，从而抑制肿瘤转移的作用[28]。

也有研究将槐耳清膏作用于p53缺失的肺腺癌细胞系H1299（p53-null），观察槐耳清膏作用下H1299对化疗药物顺铂和阿霉素的敏感性变化，发现联合使用槐耳清膏使DDP和ADM作用于H1299细胞的凋亡率分别提高2.6和2.3倍；此外槐耳清膏还可以通过激活不依赖于p53基因的细胞凋亡途径而诱导凋亡，从而提高肿瘤细胞对化疗的敏感性[29]。

总之大量研究表明槐耳颗粒在治疗肺癌方面具有明显优势，但是其关于诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制是否通过miRNA而发挥作用还不得而知，需要进一步研究。

本项目以miRNA为核心，以人肺腺癌细胞A549为研究对象，应用槐耳颗粒诱导A549细胞凋亡之后，通过基因芯片技术分析miRNA表达改变，进一步用FQ-PCR验证部分miRNA的表达变化，并利用生物信息学软件分析miRNA相关的靶基因，WesternBlot验证相关靶基因蛋白表达情况。

旨在从分子水平深入探讨抗肿瘤药物槐耳颗粒诱导人肺腺癌细胞A549凋亡的分子机制，为应用槐耳颗粒治疗肺癌提供理论和实验依据。

1.2.槐耳颗粒抑制肺癌细胞侵袭转移的分子机制研究

肺癌是全世界对人类健康和生命危害最大的恶性肿瘤之一，近年来发病率呈明显上升趋势。

张芷旋等[30]研究槐耳清膏作用于人高转移大细胞肺癌细胞L9981血管生成相关基因的表达，应用Boyden小室法检测细胞株用药前后体外侵袭力改变，发现槐耳清膏组细胞的体外侵袭力明显低于对照组，说明槐耳清膏能减弱肿瘤细胞的侵袭力。

然而槐耳颗粒抑制肺腺癌细胞侵袭转移的分子机制尚不清楚，miRNA是否参与槐耳颗粒抑制肺腺癌细胞侵袭转移还有待我们研究。

本项目以miRNA为核心，以人肺腺癌细胞A549为研究对象，应用槐耳颗粒处理A549细胞之后，应用Transwell小室实验分析细胞的侵袭转移能力，基因芯片技术分析miRNA表达变化，进一步用FQ-PCR验证部分miRNA的表达变化，利用生物信息学软件预测miRNA相关的靶基因，WesternBlot验证相关靶基因蛋白表达情况。

旨在从分子水平深入探讨抗肿瘤药物槐耳颗粒抑制肿瘤细胞侵袭转移的分子机制，为应用槐耳颗粒治疗肺癌提供理论和实验依据。

1.3.槐耳颗粒对肺癌患者免疫功能调节的分子机制

姚亚民[31]等将金克冲剂与化疗合用治疗非小细胞肺癌41例与单用化疗治疗非小细胞肺癌39例进行对比发现，治疗组NK细胞活性、T4/T8比之水平明显高于对照组金，治疗之后两组NK细胞活性、T4/T8出现显著差异（P＜0.05），克槐耳颗粒确能保护病人免疫功能免受化疗攻击，且明显改善化疗所致的免疫功能低下，增强机体的抗癌能力，疗效可靠。

据研究，槐耳调节免疫功能的机制还有激活巨噬细胞活性、提高体液免疫、通过产生某些细胞激活因子如NK细胞激活因子等进一步激活有关的免疫细胞等。

但是miRNA是否参与到这些免疫调节过程中还有待研究。

本项目以miRNA为核心，建立肺腺癌裸鼠移植瘤动物模型，槐耳颗粒喂养裸鼠之后，抽取腹水提取巨噬细胞和NK细胞，检测巨噬细胞的吞噬能力以及NK细胞的活性，然后分析巨噬细胞和NK细胞miRNA表达变化，进一步用FQ-PCR验证部分miRNA的表达变化，并利用生物信息学软件分析miRNA相关的靶基因，WesternBlot验证相关靶基因蛋白表达情况。

旨在从分子水平深入探讨抗肿瘤药物槐耳颗粒增强免疫调节功能的分子机制，为应用槐耳颗粒治疗肺癌提供理论和实验依据。

2.槐耳颗粒治疗胰腺癌的分子机制研究

胰腺癌在世界范围内呈逐年增多趋势，已成为癌症致死第4位病因，大多数胰腺癌诊断明确时已属中晚期，5年生存率不到5％。

在胰腺癌早期进行确诊能明显地改善胰腺癌预后，故如何对其进行有效的早期诊断已成为近年来国内外研究的热点。

最近对胰腺癌中miRNA表达谱的研究表明超过100种miRNA异常表达。

我们前期研究已证实miR-301在胰腺癌中高表达并与胰腺癌的发生发展以及侵袭转移密切相关，表明miR-301可能成为胰腺癌特异性的分子标志[32]。

2.1.槐耳颗粒诱导胰腺癌细胞凋亡、抑制肺癌细胞增值的分子研究机制

周进[33]等人用不同浓度的金克槐耳颗粒以及5-FU分别与人胰腺癌细胞Panc-1共同培养，利用MTT、FCM、TUNEL、免疫组化等手段分别检测肿瘤细胞的生长抑制率、细胞凋亡周期和形态学、以及凋亡基因Caspase-3的表达，发现金克槐耳颗粒对胰腺癌细胞Panc-1有确切杀伤抑制疗效。

已有研究表明槐耳颗粒在治疗胰腺癌方面具有明显优势，但是其诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制是否通过miRNA而发挥作用还有待我们研究。

本项目以miRNA为核心，以人胰腺癌细胞PANC-1为研究对象，应用槐耳颗粒诱导PANC-1细胞凋亡之后，通过基因芯片技术分析miRNA表达改变，进一步用FQ-PCR验证部分miRNA的表达变化，并利用生物信息学软件分析miRNA相关的靶基因，WesternBlot验证相关靶基因蛋白表达情况。

旨在从分子水平深入探讨抗肿瘤药物槐耳颗粒诱导人胰腺癌细胞PANC-1凋亡的分子机制，为应用槐耳颗粒治疗肺癌提供理论和实验依据。

2.2.槐耳颗粒抑制胰腺癌细胞侵袭转移的分子机制研究

胰腺癌的死亡率占恶性肿瘤死亡率的第四位，并有逐年上升的趋势[34]。

同时胰腺癌死亡率高的一个重要原因是其极易发生转移。

周进[33]等用含槐耳颗粒的DMEM培养液培养胰腺癌细胞Panc-1，ELISA法检测细胞培养上清的VEGF分泌变化发现：

槐耳颗粒作用下的肿瘤细胞VEGF分泌量随时间呈递减趋势，说明槐耳颗粒明显抑制肿瘤细胞VEGF分泌，VEGF与肿瘤的侵袭转移密切相关。

但是槐耳颗粒抑制胰腺癌细胞侵袭转移的分子作用机制是否通过miRNA而发挥作用还有待我们研究。

本项目以miRNA为核心，以人胰腺癌细胞PANC-1为研究对象，应用槐耳颗粒处理PANC-1细胞之后，应用Transwell小室实验分析细胞的侵袭转移能力，基因芯片技术分析miRNA表达变化，进一步用FQ-PCR验证部分miRNA的表达变化，利用生物信息学软件预测miRNA相关的靶基因，WesternBlot验证相关靶基因蛋白表达情况。

旨在从分子水平深入探讨抗肿瘤药物槐耳颗粒抑制肿瘤细胞侵袭转移的分子机制，为应用槐耳颗粒治疗胰腺癌提供理论和实验依据。

2.3.槐耳颗粒对胰腺癌患者免疫功能调节的分子机制

有研究对85例无法切除胰腺癌患者分组分别进行吉西他滨化疗和吉西他滨化疗结合槐耳治疗，比较临床疗效发现：

吉西他滨化疗结合槐耳治疗组在化疗结束后，体液免疫指标IgA、IgG、IgM值，细胞免疫指标NK细胞、CD3+T细胞亚群百分比及CD4+/CD8+比值均较单用吉西他滨化疗组有一定程度升高，差异有统计学意义，这些都说明吉西他滨化疗结合足疗程的槐耳治疗可增强患者的免疫功能[35]。

也有研究槐耳颗粒对胰腺癌切除术后化疗病人免疫功能的影响，结果发现化疗结合槐耳颗粒治疗的切除胰腺癌患者的体液及细胞免疫功能均有增强[36]。

但是miRNA是否参与到槐耳颗粒对胰腺癌患者免疫功能方面的影响还有待我们进一步研究。

本项目以miRNA为核心，建立胰腺癌裸鼠移植瘤动物模型，槐耳颗粒喂养裸鼠之后，抽取腹水提取巨噬细胞和NK细胞，检测巨噬细胞的吞噬能力以及NK细胞的活性，然后分析巨噬细胞和NK细胞miRNA表达变化，进一步用FQ-PCR验证部分miRNA的表达变化，并利用生物信息学软件分析miRNA相关的靶基因，WesternBlot验证相关靶基因蛋白表达情况。

旨在从分子水平深入探讨抗肿瘤药物槐耳颗粒增强免疫调节功能的分子机制，为应用槐耳颗粒治疗胰腺癌提供理论和实验依据。

3.槐耳颗粒治疗乳腺癌的分子机制研究

乳腺癌的发病率呈逐年上升的趋势，目前已是女性最常见的恶性肿瘤，是女性恶性肿瘤死亡原因的第二位。

据美国癌症协会估计，美国每年有12万乳腺癌新发病例，发病率为72．2／10万。

我国虽属女性乳腺癌的低发国，但近年来乳腺癌的发病率明显增高，居女性恶性肿瘤中的第二位，尤其沪、京、津及沿海地区是我国乳腺癌的高发地区，比如陈晓旭就是由于乳腺癌去世的。

与乳腺癌相关的miRNA中，let—7家族倍受关注。

let—7最早在线虫中发现，它能调控细胞的分化和增殖的时序。

let—7在乳腺癌组织中相对低表达，它能在转录后水平抑制RAS和HMGA2蛋白的表达，因此被认为是抑癌基因。

最近的文献显示let—7与肿瘤化疗耐药相关，let—7低表达的卵巢癌细胞和卵巢癌细胞系对铂类耐药。

来自纽约纪念斯隆－凯特琳癌症中心（MemorialSloan-KetteringCancerCenter）癌症生物学与遗传学项目，医学系以及病理学系的研究人员使用包括microRNA微阵列检测技术（LCSciences提供）在内的多种研究手段对人类癌症转移调节子进行了深入研究，发现了一系列microRNAs的异常表达与乳腺癌的转移密切相关，其中miR-335与miR-126对肿瘤转移的抑制发挥着关键性作用。

之后又将焦点转移到了在扩张转移的人类乳腺癌中收到抑制的miRNAs。

首先他们分析了培养的转移人类乳腺癌细胞，获得了癌细胞产生的miRNAs的遗传分析谱（geneticprofile），然后将这些miRNAprofile与非转移的癌细胞进行比较，结果发现了一种miRNAs小亚型，这些miRNAs只在转移细胞中大量减少。

通过进一步研究，他们发现当恢复人类乳腺癌培养细胞中，这三种miRNAs：

miR-335,miR-126和miR-206的正常表达水平的时候，能极大降低细胞扩散到肺部和骨部的能力，而且研究人员也从一个乳腺癌病患中提取了转移细胞的样品，发现这些细胞丧失了与培养细胞实验中发现相同的三种miRNAs。

除此之外，研究人员还发现miR-126会影响转移细胞的增殖速度，而miR-335和miR-206则影响的是细胞转移到肺部和骨部的能力[37]。

3.1.槐耳颗粒诱导乳腺癌细胞凋亡、抑制肺癌细胞增值的分子研究机制

有研究通过槐耳颗粒体外作用于MCF-7和MCF-7/Adr，发现槐耳颗粒具有抑制乳腺癌细胞系MCF-7细胞生长的作用，实验结果显示随着药物浓度的升高和作用时间的延长，其细胞霉性作用增强，但在0.1mg/ml以上其作用效果均在90%以上，再增加浓度其效果增加不明显；但对阿霉素有增敏作用研究中，槐耳浸膏组的对照也加槐耳因此消除槐耳自身对细胞的杀伤作用[38]。

也有实验证实槐耳颗粒在无细胞毒性剂量0.01mg/ml时能增强ADM对MCF-7/A细胞的毒性作用，其逆转倍数为4.5倍，与对照组相比，明显增加了细胞内ADM浓度，显著提高了耐药细胞MCF-7/A对ADM的化疗敏感度[39]。

还有研究将人乳腺癌细胞MCF-7以不同浓度槐耳清膏处理之后应用MTT比色法计算抑制率，采用免疫印染法检测蛋白水平变化，应用细胞免疫组化方法检测细胞p53、Fas表达的变化，发现槐耳清膏对MCF-7的最大抑制率为61.1%，槐耳清膏诱导MCF-7细胞发生凋亡的信号转导通路是p53依赖的，引起G2/M期阻滞；Fas/APO-1的调控在槐耳清膏诱导MCF-7细胞凋亡中可能发挥着中药作用。

总之研究表明槐耳颗粒在治疗乳腺癌方面具有明显优势，但是其诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制是否通过miRNA而发挥作用还有待我们研究。

本项目以miRNA为核心，以人乳腺癌细胞MCF-7为研究对象，应用槐耳颗粒诱导MCF-7细胞凋亡之后，通过基因芯片技术分析miRNA表达改变，进一步用FQ-PCR验证部分miRNA的表达变化，并利用生物信息学软件分析miRNA相关的靶基因，WesternBlot验证相关靶基因蛋白表达情况。

旨在从分子水平深入探讨抗肿瘤药物槐耳颗粒诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡的分子机制，为应用槐耳颗粒治疗肺癌提供理论和实验依据。

3.2.槐耳颗粒抑制乳腺癌细胞侵袭转移的分子机制研究

乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一，其发病率有逐渐增加的趋势，是引起妇女死亡的重要肿瘤之一。

临床资料显示乳腺癌远期生存率并未得到明显改善，复发和转移是其主要原因[40]。

乳腺癌术后复发转移率为30%-40%[41]或40%-50%[42]。

袁鹏等[43]通过复制人乳腺癌细胞株MCF-7，进行裸鼠成瘤实验，观察槐耳颗粒的抗癌作用，结果发现，对照组4只裸鼠有胸壁浸润，并有3只发生了肝转移，而槐耳颗粒组未发现有肿瘤转移现象，证实了槐耳颗粒对乳腺癌的浸润生长和转移发生具有明