中胚层干细胞自我更新分化的机制与功能研究.docx

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中胚层干细胞自我更新分化的机制与功能研究

项目名称：

中胚层干细胞自我更新分化的机制与功能研究

首席科学家：

冯新华浙江大学

起止年限：

2012.1至2016.8

依托部门：

教育部浙江省科技厅

一、关键科学问题及研究内容

本项目通过建立合适的组织特异性、基因特异性的技术体系及可视化的动物模型平台，对中胚层体内干细胞的自我更新和分化进行研究，深入了解中胚层组织生理调控的信号通路与疾病发生的机制，找到合适的干预靶点，获得有力的调控手段，最终开拓新的治疗方式。

1、建立体内中胚层干细胞示踪技术体系：

建立组织特异性荧光报告系统果蝇、斑马鱼及小鼠模型，用于体内动态监测中胚层干细胞的自我更新和分化；建立中胚层来源组织疾病模型，为以下研究内容的开展奠定基础。

2、揭示信号通路对中胚层干细胞体内自我更新和分化的生理调控机制：

以体内中胚层干细胞示踪技术体系、基因敲除手段和体外干细胞培养模型相结合，研究重要信号通路（TGF-β、PI3K-mTOR、Wnt等）和关键基因对中胚层干细胞自我更新和分化的调控机制。

3、阐明中胚层干细胞在病理条件下的作用和机制：

研究重要信号通路（TGF-β、PI3K-mTOR、Wnt等）、关键基因以及炎症因子所导致的中胚层干细胞自我更新和分化异常，及其相关的中胚层来源组织重大疾病（白血病、心肌/肾脏纤维化、不育症、骨关节炎）的发生发展。

4、探索中胚层组织干细胞自我更新和分化的诱导调控手段及疾病治疗方法：

利用果蝇和斑马鱼的中胚层干细胞的示踪模型和体外干细胞培养模型，筛选针对重要信号通路（TGF-β、PI3K-mTOR、Wnt等）的小分子化合物，尝试体内外诱导调控中胚层组织干细胞的自我更新和分化，并进一步优化中胚层干细胞的移植技术体系，为探索以治疗中胚层组织来源疾病治疗新方法奠定基础。

二、预期目标

以满足国家战略需求和改善人民生活质量为目标，着眼发育生物学和再生医学研究前沿，围绕中胚层组织干细胞体内自我更新和分化的机制和功能，建立体内中胚层干细胞示踪技术体系、揭示信号通路对中胚层干细胞体内自我更新和分化的生理调控机制，阐明中胚层干细胞在病理条件下的作用和机制，探索中胚层组织干细胞自我更新和分化的诱导调控手段及疾病治疗方法。

通过本课题的实施，在中胚层组织干细胞领域取得理论创新和突破，获得一批拥有自主知识产权的成果。

同时，以本项目的实施为契机，进一步加快我国干细胞研究与再生医学、免疫和遗传等领域的衔接和交叉，形成高水平的学术研究人才梯队。

1、建立中胚层干细胞体内示踪模型以及中胚层来源组织疾病模型，动态观察生理和病理情况下体内中胚层干细胞自我更新和分化的过程。

2、明确重要信号通路（TGF-β、PI3K-mTOR、Wnt等）和关键基因调控中胚层干细胞自我更新和分化的作用；绘制以几大通路为中心的中胚层组织干细胞自我更新和分化的调控网络，进而为建立活体中组织干细胞自我更新和分化的干预体系提供理论基础。

3、在中胚层来源组织重大疾病（白血病、心肌/肾脏纤维化、不育症、骨关节炎）模型中，阐明重要信号通路（TGF-β、PI3K-mTOR、Wnt等）、关键基因以及炎症因子在中胚层干细胞自我更新和分化异常中的作用。

4、获得针对重要信号通路（TGF-β、PI3K-mTOR、Wnt等）的小分子化合物，建立体内外诱导调控中胚层组织干细胞的自我更新和分化的手段，完善中胚层干细胞的移植技术体系，尝试性干预中胚层来源组织疾病。

5、取得具有国际影响的成果，发表SCI论文30-50篇（影响因子大于10的5-10篇）；申请发明专利5-10项。

6、人才培养：

培养博士后10-20人，博士40-60人，硕士20-40人；争取1-2人获得全国百篇优秀博士论文；培养一批从事干细胞研究的高水平人才。

三、研究方案

人体中有许多重要器官均由中胚层形成，包括心脏、血液、肾脏、肌肉骨骼和生殖系统。

随着我国人口老龄化和社会生活节奏的加快，各种中胚层疾病，如心血管疾病、白血病、骨关节疾病、不孕不育，越加频繁发生，严重影响了人们的生活质量。

并且中胚层系统疾病发病率高，后遗症多，难以治愈，损失了大量劳动力，给国家增加了极大负担。

因此，中胚层疾病的治疗迫切需要从新的角度探索，从而为寻找新的治疗策略提供基础。

而干细胞研究的兴起为中胚层系统疾病的治疗带来了新的希望。

大量研究表明干细胞治疗可促使身体自主再生已损伤组织，利用干细胞与组织工程技术相结合所得到的生物工程组织或器官能够直接移植到损伤部位，实现再生，从而有可能提供新的疾病治疗方案和手段。

因此，建立体内干细胞自我更新和分化的研究体系，阐明中胚层特定组织干细胞在生理病理中的作用及其机制，建立有效干预手段，对于应用干细胞防治中胚层疾病（如心血管疾病、白血病、骨关节炎等）具有十分重要的意义。

已有的项目总体思路为：

建立体内干细胞自我更新和分化的研究体系，阐明中胚层特定组织干细胞在生理病理中的作用及其机制，获得有效干预手段，改善中胚层组织疾病的治疗效果。

根据总体思路，本项目设立了紧密联系又各有侧重的四个课题组：

课题1、体内中胚层干细胞示踪技术体系的建立：

以果蝇、斑马鱼及小鼠为模型，建立组织特异性荧光报告系统。

研究关键基因在组织干细胞分化，早期发育中的生物学功能；对基因敲除小鼠的干细胞数量和增殖分化能力进行动态评估。

课题2、信号通路对中胚层干细胞体内自我更新和分化的生理调控机制：

利用干细胞与基因敲除动物模型，研究关键基因和重要信号通路（TGF-β、PI3K-mTOR、Wnt等）对中胚层干细胞自我更新和分化的分子机制，进而为建立活体组织干细胞分化行为的人为干预体系提供理论基础。

课题3、中胚层干细胞在病理条件下的作用和机制：

主要研究关键基因和重要信号通路（TGF-β、PI3K-mTOR、Wnt等）调控中胚层干细胞自我更新、分化与疾病发生发展的分子机制，研究炎症因子对中胚层干细胞维持和分化的影响及分子机理，发现关键的免疫调控因子及其作用机制。

课题4、中胚层组织干细胞自我更新和分化的诱导调控手段及疾病治疗方法：

基于课题一的平台与二、三发现的信号通路与免疫靶点诱导调控干细胞自我更新和分化，利用组织特异性和基因特异性的动物模型和体外干细胞培养模型筛选小分子化合物；完善中胚层干细胞的分离、培养和分化的技术平台；建立干细胞移植技术体系；探索运用干细胞诱导调控手段治疗中胚层组织来源疾病。

研究方案从关注组织干细胞在体内自我更新和分化的前沿科学问题出发，建立可视化的组织特异性及基因特异性的研究平台（课题一），研究组织干细胞在体内自我更新和分化的生理机制（课题二）及病理机制（课题三），找到其调控靶点，向调控组织干细胞促进疾病治疗的应用研究（课题四）过渡。

从而实现多层次、多角度、递进性、综合性地研究中胚层组织疾病的治疗的技术路线。

各课题之间联系及其与本项目的研究目标之间的关系图如下：

课题的研究目标、内容、承担单位、课题负责人及课题在整个项目经费中所占比例：

课题1.体内中胚层干细胞示踪技术体系的建立

研究目标：

建立中胚层干细胞体内示踪模型以及中胚层来源组织疾病模型，动态观察生理和病理情况下体内中胚层干细胞自我更新和分化的过程。

研究内容：

（1）果蝇模型：

采用转基因技术，构建荧光标记的已知干细胞标记分子的转基因果蝇株，对中胚层干细胞进行示踪。

进而利用前期工作积累的一个果蝇致死突变株库（约有2000个突变株）对调节中胚层干细胞（如生殖干细胞）自我更新和分化的新基因进行正向遗传筛选。

在此基础上，对这些筛出的突变所影响的基因进行定位克隆并对其作用机制及与重要信号通路（TGF-β、PI3K-mTOR、Wnt等）的作用关系进行深入研究。

（2）建立斑马鱼中胚层干细胞示踪的转基因品系：

一方面利用已知的中胚层干细胞标记基因以及全身透明的casper突变体，建立示踪斑马鱼中胚层干细胞的转基因品系（如血液干细胞、肌肉干细胞及肾脏干细胞）；另一方面，通过移植的方法，鉴定特定中胚层组织干细胞（如生殖干细胞及软骨干细胞等），并找到新的中胚层干细胞标记基因。

结合小分子化合物筛选和定向突变技术，研究重要信号通路（TGF-β、PI3K-mTOR、Wnt）对中胚层干细胞自我更新和分化的作用关系。

（3）构建标记中胚层干细胞的转基因荧光小鼠：

利用已知的以及通过上述果蝇和斑马鱼系统鉴定出的新的中胚层干细胞标记基因，建立示踪小鼠中胚层干细胞的转基因及相应的Cre品系，研究重要信号通路（TGF-β、PI3K-mTOR、Wnt）对中胚层干细胞自我更新和分化的调控关系。

同时，利用上述斑马鱼筛选到的小分子化合物，在建立的小鼠模型中进行验证。

（4）利用上述建立的示踪系统，建立中胚层来源组织疾病（白血病、心肌/肾脏纤维化、不育症、骨关节炎）模型，动态观察病理情况下体内中胚层干细胞自我更新和分化的过程。

经费比例：

23%

承担单位：

同济大学

课题负责人：

曹莹

学术骨干：

佟超，谢晓云，许静

课题2.信号通路对中胚层干细胞体内自我更新和分化的生理调控机制

研究目标：

阐明重要信号通路（TGF-β、PI3K-mTOR、Wnt等）和关键基因调控中胚层干细胞自我更新和分化的作用；绘制以上述重要信号通路为中心的中胚层组织干细胞自我更新和分化的调控网络，进而为建立活体中组织干细胞自我更新和分化的干预体系提供理论基础。

研究内容：

利用干细胞培养模型及突变体动物模型，结合上述示踪系统，研究重要信号通路（TGF-β、PI3K-mTOR、Wnt等）和关键基因对中胚层干细胞自我更新和分化的调控机制，进而为体内干预中胚层组织干细胞自我更新和分化提供理论基础。

（1）阐述TGF-β信号通路在中胚层干细胞自我更新和分化过程中的作用与机理。

利用干细胞培养模型及突变体动物模型，结合上述示踪系统，研究调控TGF-β信号通路的重要磷酸酶PPM1A及SCP4等在中胚层干细胞自我更新和分化以及中胚层组织发育过程中的作用机制。

（2）阐述PI3K-mTOR信号信号通路在中胚层干细胞自我更新和分化过程中的作用与机理。

利用干细胞培养模型及突变体动物模型，结合上述示踪系统，研究PI3K-mTOR信号通路的重要成员PTEN、AKT、mTOR等在中胚层干细胞自我更新和分化以及中胚层组织发育过程中的作用机制。

（3）阐述Wnt信号通路在中胚层干细胞自我更新和分化过程中的作用与机理。

利用干细胞培养模型及突变体动物模型，结合上述示踪系统，研究Wnt信号通路的重要成员β-catenin及wntless等在中胚层干细胞自我更新和分化以及中胚层组织发育过程中的作用机制。

经费比例：

31%

承担单位：

浙江大学

课题负责人：

冯新华

学术骨干：

杨中州，陶涛，刘婷，肖睦

课题3.中胚层干细胞在病理条件下的作用和机制

研究目标：

阐明中胚层干细胞在病理条件下的作用和机制：

研究重要信号通路（TGF-β、PI3K-mTOR、Wnt等）、关键基因以及炎症因子所导致的中胚层干细胞自我更新和分化异常，及其相关的中胚层来源组织重大疾病（白血病、心肌/肾脏纤维化、不育症、骨关节炎）的发生发展。

研究内容：

（1）利用斑马鱼及小鼠疾病模型，结合上述示踪系统，阐明TGF-β信号通路和关键蛋白在中胚层干细胞自我更新和分化异常中的作用，从而揭示TGF-β信号通路在中胚层来源组织疾病（骨髓衰竭疾病、不育症、骨关节炎）发生发展中的作用与机理。

（2）利用小鼠疾病模型，结合上述示踪系统，阐明PI3K-mTOR信号通路和关键蛋白在中胚层干细胞自我更新和分化异常中的作用，从而揭示PI3K-mTOR信号通路在中胚层来源组织疾病（白血病、不育症）发生发展中的作用与机理。

（3）利用斑马鱼及小鼠疾病模型，结合上述示踪系统，阐明Wnt信号通路和关键蛋白在中胚层干细胞自我更新和分化异常中的作用，从而揭示Wnt信号通路在中胚层来源组织疾病（心脏纤维化、不育症、骨关节炎）发生发展中的作用与机理。

（4）利用斑马鱼及小鼠疾病模型，结合上述示踪系统，阐明炎症因子在中胚层干细胞自我更新和分化异常中的作用，从而揭示炎症因子在中胚层来源组织疾病（白血病、肾脏纤维化、骨关节炎）发生发展中的作用与机理。

经费比例：

23%

承担单位：

浙江大学

课题负责人：

汪洌

学术骨干：

冯立新，胡虎，竺晓凡，李昂

课题4.中胚层组织干细胞自我更新和分化的诱导调控手段及疾病治疗方法

研究目标：

探索中胚层组织干细胞自我更新和分化的诱导调控手段及疾病治疗方法：

利用果蝇和斑马鱼的中胚层干细胞的示踪模型和体外干细胞培养模型，研究发现针对重要信号通路（TGF-β、PI3K-mTOR、Wnt等）来诱导调控中胚层组织干细胞的自我更新和分化的安全而有效的小分子化合物，并进一步优化中胚层干细胞的移植技术体系，为建立治疗中胚层组织来源疾病治疗的新方法奠定基础。

研究内容：

（1）基于组织干细胞自我更新和分化的机制,利用上述小分子筛选平台和功能检测系统，以课题2、3发现的新靶点为对象，并针对其分子调控机制设计合理的分子筛选模型，筛选出能够安全有效地促进中胚层干细胞扩增的活性小分子化合物，而后进行药物效应验证和进一步的分子机制研究，从而发现可安全有效地的诱导调控中胚层组织干细胞的自我更新和分化的小分子化合物，为相关新药研发和干细胞治疗中胚层组织来源疾病打基础。

a）利用上述果蝇和斑马鱼中胚层干细胞示踪系统和疾病模型，以重要信号通路（TGF-β、PI3K-mTOR、Wnt等）为作用对象，筛选对中胚层干细胞自我更新和分化具有关键调控作用的小分子化合物。

b）利用小鼠中胚层来源组织疾病模型验证我们已有的重要信号通路（TGF-β、PI3K-mTOR、Wnt等）特异性激活/抑制分子，以及新筛选出的对中胚层干细胞自我更新和分化有关键调控作用的小分子化合物。

探索中胚层组织来源疾病的新干预手段。

（2）依据炎症因子对中胚层组织干细胞自我更新分化的影响和作用靶点，筛选特异性的小分子抑制物，并在小鼠中胚层来源组织疾病模型中验证，探索免疫干预手段。

（3）利用斑马鱼干细胞示踪系统筛选出的新的中胚层干细胞标志基因，完善干细胞的分离技术。

结合干细胞示踪模型筛选出的对中胚层干细胞自我更新和分化有关键影响的小分子化合物，优化干细胞自我更新和诱导技术体系，探索建立有效的中胚层干细胞移植治疗手段。

经费比例：

23%

承担单位：

中国医学科学院血液学研究所

课题负责人：

袁卫平

学术骨干：

欧阳宏伟，高瀛岱，王琳琳，连晓媛

四、年度计划

研究内容

预期目标

第

一

年

1）用esg-Gal4驱动UAS-GFP表达或STAT92E-GFP标记肾脏干细胞，并摸索在马氏管中诱导产生克隆的条件。

2）利用已有的斑马鱼肾脏干细胞转基因品系Tg（lhx1a：

GFP），通过流式细胞仪、芯片技术以及表达谱筛选，找到新的特异性更好的肾脏干细胞标记基因。

3）克隆和鉴定小鼠Eomes、Mesp1基因的启动子和增强子，制备其相应荧光及Cre转基因小鼠，并与Mespe-Cre及Rosa26-EGFP/LacZ小鼠交配构建已知血液干细胞基因启动子驱动表达的Cre小鼠。

4）利用Smasd4及PPM1A的条件性剔除小鼠，在卵母细胞中将它们进行剔除，获得小鼠。

5）利用BMP受体Bmpr1a的条件性剔除小鼠，在心脏干细胞中进行剔除，获得小鼠。

6）利用PI3K-PDK1-Akt-mTOR信号通路重要成员PTEN,PDK1,Akt及mTOR的条件性剔除小鼠，在造血干细胞和心脏干细胞中将这些基因进行剔除，获得小鼠。

7）利用Wnt信号通路的重要成员β-catenin及wntless的条件性剔除小鼠,在心脏干细胞中进行剔除，获得小鼠。

8）利用TGF-β磷酸酶SCP4的条件性剔除小鼠，分别在间充质干细胞及心脏干细胞中将SCP4剔除，产生中胚层干细胞特异剔除小鼠。

9）检测不同的Smads蛋白亚型调控CUX1蛋白的功能，除了TGF-β激活的Smad2、Smad3外，同时可以检测骨形态发生蛋白（BMP）激活的Smad1、Smad5等蛋白是否也调节CUX1蛋白的表达。

10）建立不同类型的白血病模型小鼠，并检测小鼠模型中白血病细胞PI3K-AKT信号通路相关蛋白的表达水平、磷酸化情况。

11）建立小鼠骨髓中分离单核细胞（或前体细胞）技术平台，筛选对单核/巨噬细胞系统分化起关键作用存在于骨关节炎发生发展中的炎症因子。

12）在小鼠膝关节处注射胶原酶，构建小鼠骨关节炎模型；在小鼠膝关节切除前交叉韧带，构建小鼠骨关节炎模型。

13）体外研究影响调控精原干细胞再生和分化的信号，包括调控精原干细胞再生的PLZF阳性克隆形成分析和c-kit阳性的分化中的精原干细胞增长分析。

14）基于体外培养中信号传导研究，验证相应重要分子在体内精原干细胞发育中的表达情况，确定基因敲除的靶分子。

15）建立造血干细胞单细胞分离和体外培养体系，用特异的造血干细胞表明标记如CD34，Sca1，cKit，SLAMmarker等分离造血干细胞单细胞并建立合适的体外培养体系；观察单个造血干细胞在体外培养过程中的动态变化。

16）利用造血干细胞分离和培养体系，分别用不同的PI3K-AKT信号通路小分子化合物处理已分离的造血干细胞，并观察加入小分子化合物之后的变化，比较与对照之间的不同，确定不同小分子化合物对造血干细胞体外扩增和分化的作用。

17）分离小鼠的骨髓细胞分别进行CFU和CAFC试验，在实验过程中分别加入PI3K-AKT信号通路的小分子抑制剂，检验不同小分子抑制剂对造血干细胞和造血祖细胞的影响。

18）分离培养人成体关节透明软骨细胞和胚胎透明软骨细胞，通过流式细胞术检测比较CD146+的软骨细胞的数目；对软骨组织切片进行CD146免疫组化染色，对表达CD146+的软骨细胞进行定位；通过磁珠分选获得CD146+软骨细胞，通过免疫组化方法鉴定ColII阳性（CD146+/ColII+），检测其在经过体内外长期扩增后的克隆形成能力，自我更新能力和多向分化潜能；

19）通过组学比较研究透明软骨干细胞与其他类型软骨细胞，获得透明软骨干细胞的生物学标志和关键转录因子。

1）建成果蝇肾脏、小鼠心脏干细胞体内示踪模型，找到斑马鱼中肾脏干细胞标记基因。

2）获得中胚层干细胞特异剔除TGF-β、PI3K-mTOR、Wnt信号通路分子的小鼠。

3）建立白血病和骨关节炎小鼠模型。

4）完成和建立体外细胞分离培养体系。

包括单核细胞、精原干细胞、软骨干细胞和造血干细胞。

5）建立造血干细胞小分子评价体系。

第

二

年

1）用已经建立的示踪模型与已有果蝇突变致死株交配，筛选肾脏干细胞发生及增殖异常的突变株。

2）构建斑马鱼肾脏干细胞示踪体系，观察正常生理条件下，体内肾脏干细胞的形态、行为特征；探索肾脏纤维化模型。

3）将Eomes/Mesp1-EGFP/Cre小鼠或Mesp1-Cre;Rosa26-EGFP/LacZ小鼠与信号通路（TGF-β、PI3K-mTOR、Wnt）重要组成成员的基因剔除小鼠交配，获得心肌纤维化模型。

4）交配血液干细胞基因的Cre小鼠和由Cre控制的荧光标记小鼠Rosa26-EGFP，建立血液干细胞转基因荧光小鼠。

并诱导其患白血病。

5）分析以上中胚层干细胞特异剔除小鼠对卵母细胞，间充质干细胞，造血干细胞，心脏干细胞自我更新，增值及分化的调控作用。

6）分析上述中胚层干细胞在疾病发生过程中的作用（卵巢早衰，血液病，心脏发育缺陷，心肌纤维化及病理性心肌重塑等）。

7）分析Smads蛋白亚型调控CUX1蛋白表达的机理。

8）利用基因Knock-down手段研究PI3K-AKT信号通路在白血病发生发展中的作用。

9）通过联合敲除基因FANCD2和DNAH7，建立Fanconi贫血动物模型。

10）应用各信号通路中信号分子和蛋白激酶的小分子化合物抑制剂来筛选出最有可能参与这一诱导分化过程的信号通路，应用ChIP-qPCR鉴定对巨噬细胞分化起关键作用的转录因子。

体外应用knockdown和外源性过表达技术确定关键信号分子和转录因子。

11）分离骨关节炎病变组织中及正常的软骨干细胞，比较两种软骨干细胞自我更新和分化的能力。

包括克隆形成能力，干细胞特征性marker的流式检测，骨、脂肪、软骨多向分化能力的评估。

12）建立Thy-1/Cre和Stra8/Cre条件敲除PTEN的小鼠，分析敲除小鼠的表型。

13）分离小鼠的骨髓细胞进行骨髓移植，移植后受体小鼠分别用PI3K-AKT信号通路的小分子抑制剂处理，检验不同小分子化合物对造血干细胞体内重建的影响。

14）构建白血病小鼠模型，在小鼠白血病发病过程中，分别用PI3K-AKT信号通路小分子抑制剂处理小鼠，观察小分子化合物对白血病细胞和白血病干细胞的影响。

15）构建软骨修复再生动物模型，检测软骨干细胞异位形成透明软骨组织的能力。

1）获得果蝇肾脏干细胞发生及增殖异常的突变株。

建成斑马鱼肾脏干细胞体内示踪模型和肾脏纤维化模型。

获得相关基因剔除小鼠心肌纤维化模型。

2）建立小鼠血液干细胞体内示踪模型，获得标记了血液干细胞的白血病模型。

建立Fanconi小鼠模型。

验证PI3K-AKT信号通路小分子对白血病细胞和白血病干细胞的影响。

3）阐述TGF-β信号途径下效应蛋白Smads调控CUX1蛋白表达的机理。

4）评估正常软骨干细胞与骨关节炎软骨干细胞自我更新和分化能力的差别。

进行软骨干细胞在体内异位形成透明软骨和原位软骨缺损修复的生物学性能研究。

5）获得精原干细胞PTEN敲除小鼠，研究PTEN敲除小鼠精原干细胞再生与分化的平衡调控的改变。

第

三

年

1）对筛出的突变株中的突变基因进行定位克隆，并研究其中感兴趣基因的功能及其在干细胞发生及增殖过程中的作用。

2）结合小分子化合物筛选和正向反向遗传突变技术，研究重要信号通路（TGF-β、PI3K-mTOR、Wnt）对斑马鱼肾脏干细胞的自我更新和分化的调节作用；检测肾脏纤维化模型中肾脏干细胞的行为变化。

3）分析重要信号通路（TGF-β、PI3K-mTOR、Wnt）对心脏干细胞血液干细胞自我更新及分化的调控作用。

4）分别分析心脏干细胞在心脏纤维化以及血液干细胞在白血病中的作用及其变化。

5）研究小分子化合物在心脏纤维化中调控及干预作用。

6）进一步分析以上中胚层干细胞特异剔除小鼠对卵母细胞，间充质干细胞，造血干细胞，心脏干细胞自我更新，增值及分化的调控作用。

7）进一步分析上述中胚层干细胞在疾病发生过程中的作用（卵巢早衰，血液病，心脏发育缺陷，心肌纤维化及病理性心肌重塑等）。

8）制作新的基因剔除小鼠，用于中胚层干细胞调控机制研究。

9）进一步分析Smads蛋白亚型调控CUX1蛋白表达的机理进一步拓展研究方向和内容。

10）利用基因过表达手段研究PI3K-AKT信号通路在白血病发生发展中的作用。

11）分离Fanconi纯合子小鼠的造血干细胞，以小鼠正常造血干细胞为对照，利用长周期培养，克隆形成实验，竞争性骨髓移植等方法研究Fanconi小鼠造血干细胞的自我更新及分化特征。

12）确认键炎症因子，信号分子和转录因子之间相互作用关系，以及相互作用位点。

进一步研究上述分子对单核/巨噬细胞分化过程中指标蛋白分子表达调控影响的分子机理。

13）通过对发生发展不同时间点骨关节炎组织的免疫组化染色，western，芯片等手段评估Wnt等信号通路重要蛋白和IL17,IL1,TNFα等炎症因子及受体在骨关节炎发生发展过程中的表达情况。

14）建立Thy-1/Cre和Stra8/Cre条件敲除Smad2和Smad3的小鼠，分析