高分子通讯功能性含糖聚合物的研究.docx

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高分子通讯功能性含糖聚合物的研究

功能性含糖聚合物的研究

含糖聚合物是指高分子链上含有糖基组分的高分子，具有良好的亲水性，生物相容性，糖单元的特异识别性又赋予了聚合物先进的生物功能性，因此近年来受到越来越多的关注，含糖聚合物在生物技术，生物医学，生物分离等方面具有广泛的应用前景。

可控/活性聚合技术的发展为合成各种结构及分子量可控的功能性高分子提供方便有效的途径，尤其是可逆加成裂解链转移（RAFT）自由基聚合，适用功能性单体范围广，反应不需要金属催化剂，所以成为合成具有生物用途的功能性聚合物的最佳方法之一。

一、RAFT聚合技术合成含糖聚合物

由于RAFT法对单体的功能基团不敏感，因而含自由羟基的糖单体可直接用于聚合。

Lowe等[29]首次报道了糖单体甲基丙烯酸氧乙基葡糖苷的RAFT聚合，以（4–氰基戊酸）–4–二硫代苯甲酸（CPADB）为链转移剂，70℃下进行聚合，发现在低转化率下，分子量和转化率成线性关系。

Davis等人直接聚合糖单体合成了一系列水溶性的含糖聚合物[30-32]，例如甲基丙烯酸6–O–甲基丙烯酰–α–D–葡萄糖苷和2–甲基丙烯酸羟乙基-葡萄糖苷在乙醇/水溶液中依次进行RAFT聚合，合成了含有两种糖单元结构的含糖嵌段聚合物。

Bernard等[58]采用丙烯酰胺类含糖单体（AGA）直接聚合，得到PAGA为大分子链转移剂，再聚合N–异丙基丙烯酰胺（（NIPAM），得到窄分子量分布的温敏性嵌段聚合物PAGA-b-PNIPAAm。

研究发现，当温度高于LCST时，由于聚异丙基丙烯酰胺PNIPAM链段的塌陷，两嵌段聚合物在水中自组装形成胶束。

Narain等人[10]对葡萄糖基进行修饰，然后分别以糖，带氨基的单体和生物素为单体，进行RAFT聚合（如图1.5），得到，具有良好的水溶性聚合物胶束稳定性很强，并对其生物功能化进行了研究。

另外，他们[11]还通过合成阳离子含糖纳米粒子，与DNA进行配位作用（如图1.6），从而实现对细胞的识别作用。

最近，他们[12]还以生物素化双硫酯为链转移剂，利用RAFT聚合法分别制备了端基生物素化的NMA与修饰化的甘露糖和乙酰基葡萄糖的含糖共聚物，并在含糖共聚物中加入PEG原位制得金的含糖纳米粒子。

并对其特异识别作用及生物功能性进行了研究。

将环境响应性聚合物链段引入含糖聚合物中得到的刺激响应性含糖聚合物，将糖基的特异性识别和聚合物对外界环境的响应性有机地结合在一起，可以使含糖聚合物在生物医学领域得到更广泛的应用。

目前，得到普遍研究的是pH、温度响应性含糖聚合物。

虽然直接以糖单体进行聚合无需进行后续的脱保护，但是限制了聚合时溶剂的选择以及合成嵌段聚合物时单体的选择，因此出现了由保护性糖单体合成含糖共聚物的大量研究[33-38]。

Lowe[39]等人以CPADB为链转移剂，在DMF溶剂中进行保护性糖单体3-O-甲基丙烯酰氯-1,2:

3,4-二-O-异亚丙基-D-吡喃半乳糖的RAFT聚合，合成保护性含糖聚合物，再以此为大分子链转移剂，聚合甲基丙烯酸二甲基氨基甲酯（DMAEMA）单体，得到窄分子量分布（PDI<1.2）的嵌段聚合物，三氟乙酸水溶液中脱除保护基团，得到亲水性含糖嵌段聚合物。

Voit等人[40]分别进行了保护性甲基丙烯酰胺类糖单体的RAFT聚合及与NIPAM单体的RAFT共聚合，脱除保护基后得到了含糖均聚物和温敏性的含糖共聚物。

研究发现，此温敏性含糖共聚物的水溶液性能受共聚单体类型、糖单体中烷基链长以及共聚物结构的影响。

（[40]ÖzyürekZ.,KomberH.,GrammS.,SchmaljohannD.,MüllerA.H.E.,VoitB.MacromolChemPhys.2007,208（10）,1035–1049.）

本课题组在研究甲基丙烯酸-2-（N,N-二甲基氨基）乙酯（DMAEMA）单体的RAFT聚合过程基础上[41],基于保护性糖单体3-O-甲基丙烯酸-α，β–D葡萄糖（MIpGlc），以PDEAEMA为大分子RAFT试剂合成了结构、分子量可控及窄分子量分布的嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMAIpGlc，脱除保护基后，得到了具有pH响应性的含糖嵌段共聚物PDEAEMA-b-PMAGlc[40]。

在pH>7条件下，PDEAEMA-b-PMAGlc形成亲水性壳层分布有大量的葡萄糖基的球型胶束，并且对刀豆蛋白ConA具有特异识别作用。

由于PDEAEMA的pH响应范围与癌细胞附近的pH接近，因而此含糖嵌段共聚物可应用与抗癌药物的靶向释放系统。

借助于RAFT聚合与开环聚合，将聚己内酯（PCL）引入到三嵌段共聚物的侧链，本课题组合成了可以生物降解的温敏性线－梳－线型的含糖三嵌段共聚物。

此三嵌段共聚物在水溶液中自组装形成以PCL为内核，PMAGlc与PNIPAM为混合型壳层的Compound胶束。

胶束的尺寸与温度有关，其对温度的敏感性依赖于PNIPAM的链段长度。

RAFT由RAFT聚合机理可知，

二、可控自由基聚合技术结合点击化学合成功能性含糖聚合物

“点击化学”的概念是2001年由美国化学家Sharpless[60]提出来的。

“点击化学”最大的优点在于反应原料易得，反应非常可靠，对氧气和水不敏感，反应条件温和，产物立体选择性好、产率高，反应后处理及产物分离简单方便，反应副产物对环境友好，而且有很好的生物兼容性。

利用点击化学对聚合物进行生物功能化修饰具有简便高效的特点。

目前，点击化学应用最为成熟的是叠氮化物与末端炔在Cu（Ⅰ）催化下生成1，2，3-三唑化合物，即Cu（Ⅰ）催化的Huisgen1，3-偶极环加成反应（CuAAC）[61-63]。

其反应原理如图1.6所示。

用于合成含糖聚合物的一大优点是可以将不同的糖单元键接到同一个大分子链上。

图1.6Cu（I）催化的1,3-双偶极Huisgen环加成反应原理。

Hetzer等人[64]利用点击化学得到2'-（4-乙烯基-[1,2,3]-三氮唑-1-基）乙基-O-α-D-吡喃甘露糖单体，进行RAFT聚合，得到含糖均聚物。

再以此为大分子链转移剂，NIPAAm为单体，进行RAFT聚合，得到温敏性双嵌段聚合物（如图1.7）。

研究发现，当温度高于LCST时，聚合物就会自组装形成聚合物胶束。

此胶束以水溶性甘露糖为壳，可以与刀豆蛋白ConA特异性识别。

Schubert等人[65]利用点击化学制备得到含有糖单元的单体，再与单体2-乙基-2-恶唑啉和单体2-（十二-9-烯基）-2-恶唑反应，得到侧基含有烯基的共聚物，此共聚物可以进一步与含有巯基的功能分子结合，形成功能性聚合物，与刀豆蛋白ConA具有特异性识别作用。

图1.7嵌段聚合物合成过程

Haddleton等人[66]利用ATRP聚合方法合成了窄分子量分布的侧链上含有炔基的聚合物，通过点击化学将保护的和未保护的糖单元接到侧链上，提供了一种简单有效的合成含糖聚合物的方法（图1.8）。

Huang[67]等人利用NCA聚合方法合成了侧链含有炔基的窄分子量分布的多肽聚合物，然后将叠氮功能化的葡萄糖基通过点击化学接到多肽链上，高效的合成了含糖多肽类聚合物。

此含糖多肽类聚合物具有良好的水溶性，对ConA具有特异性识别作用。

图1.8利用点击化学制备含糖聚合物

巯基-烯烃及巯基-炔烃是“Clickchemistry”中重要的一种类型。

不同于叠氮-炔烃的点击反应，它是一种键能较弱的S-H键，在相对温和的条件下，与碳碳双键及碳碳三键进行加成。

巯基-烯烃反应凭借快速、简单，不受氧影响以及无重金属Cu残留等优点，在固化（硫化）反应和聚合物改性中成为一种高效的工具[68-69]。

该技术已经渗透到生命、药物、高分子、功能材料、表面改性等诸多领域[70-74]。

图1.9巯基-烯烃偶联示意图：

a）自由基偶联；b）在催化剂作用下的迈克尔加成反应。

图1.9巯基-烯烃偶联示意图

Perrier等人[75]利用RAFT方法分别合成了侧链含有炔基和烯基的聚合物，利用巯基-炔烃及巯基-烯烃点击化学将葡萄糖基接到聚合物上，形成超支化含糖聚合物，利用此种方法可以得到结构单一的含糖聚合物，有望应用于生物医药领域。

Chen等人[76]利用RAFT方法聚合单体聚（乙二醇）甲基丙烯酸甲酯和HEMA，得到侧链含有烯基的嵌段聚合物，利用巯基-烯烃点击反应在2小时之内将糖基接到聚合物链上，所形成的胶束对刀豆蛋白ConA具有特异性识别作用。

Haddleton等人[44]将ATRP法和点击化学联用，合成了具有精确结构的含糖嵌段共聚物，然后利用聚合物的马来酰亚胺端基与BSA的相互作用，将蛋白质引入（如图1.25），得到含糖嵌段共聚物-蛋白质缀合物。

并对其与凝集素的识别作用及其免疫感应功能进行了研究。

1.2.3含糖聚合物的识别功能及生物应用

糖与蛋白质能够相互作用，形成比较稳定的糖-蛋白质复合体，并且一种蛋白质只能与一种糖相互作用，这种作用称为糖的特异性识别。

我们将这一类能和糖类进行特异性结合的，促使细胞凝集的蛋白质称为凝集素（lectin）。

但是单个糖单元与凝集素的这种特异性结合作用特别弱，因此含糖聚合物引起人们越来越多的关注，因为含糖聚合物将单个糖单元聚集在一起，增强了这种特异性识别作用。

Kiessling等人[77]合成一系列含有不同比例的甘露糖残基和半乳糖残基的共聚物。

其中刀豆蛋白ConA能和甘露糖进行特异性识别而不能与半乳糖识别。

共聚物除了含甘露糖比例不同，在聚合度、极性及空间属性方面都是一样的。

研究结果表明，含糖聚合物与刀豆蛋白ConA有特异性相互作用，并且含甘露糖比例越，聚合物对ConA的结合能力越强（图1.10）。

图1.10含不同比例甘露糖的含糖聚合物对刀豆蛋白ConA的识别作用

Stenzel等人[78]利用单体二（乙二醇）甲基醚甲基丙烯酸甲酯（DEGMA）和甲基丙烯酸羟乙酯合成了温敏性两嵌段聚合物，通过后修饰将糖基接到此嵌段聚合物上，形成温敏性含糖嵌段聚合物。

当溶液处于聚合物LCST之上时，嵌段聚合物由于PDEGMA链段的塌陷而形成胶束，胶束的形成使得糖基聚集而增强了与刀豆蛋白ConA的结合能力（图1.11）。

图1.11温敏性含糖聚合物的合成及在温度高于LCST时胶束的形成过程

Xu等人将含糖聚合物聚α-D-烯丙基葡萄糖苷接枝到聚丙烯微孔膜上，形成糖基化多孔表面，得到含高浓度糖基的微孔膜[79]。

研究表明，此微孔膜可以特异性识别刀豆蛋白ConA，并能选择性吸附ConA（图1.13）,有望应用于蛋白质分离技术。

图1.12含糖微孔膜选择性吸附刀豆蛋白ConA

通过化学反应将糖组分引入到聚合物链中而形成功能性聚合物材料，利用糖基与蛋白质的特异性相互作用，可以作为细胞和其它生物分子的识别位点，从而实现靶向输送和药物载体的功能，在生物医学及生物技术方面有着广泛的应用前景[80-82]。

第三节蛋白质/多肽-聚合物生物缀合物的合成方法

近年来，蛋白质/多肽-聚合物生物缀合物引起人们广泛的研究兴趣。

将聚合物接到蛋白质上不仅可以增加蛋白质的溶解性，稳定性，而且可以赋予生物分子一些新的功能，因此可以增加蛋白质在体内或者体外的应用性。

蛋白质与聚合物可以通过共价键或者非共价键结合，而以共价键的形式合成生物缀合物的主要有“Graftingto”和“Graftingfrom”两种方法。

1.3.1“Graftingfrom”方法合成聚合物-蛋白质缀合物

“Graftingfrom”方法是指高分子链从蛋白质表面进行增长从而得到聚合物-蛋白质生物缀合物。

目前较常用的方法是用生物大分子修饰ATRP引发剂或者RAFT链转移剂引发单体聚合，从而得到聚合物-蛋白质/多肽生物缀合物。

Maynard等人[83]利用BSA或者溶菌酶的半胱氨酸残基上巯基通过二硫键修饰ATRP引发剂，形成蛋白质大分子引发剂，引发单体NIPAAm进行原位聚合，得到温敏性生物缀合物（图1.13）。

研究结果发现，缀合到聚合物链上后的蛋白质依然保持良好的活性。

图1.13由蛋白质修饰的引发剂引发ATRP聚合物从而制备聚合物-蛋白质缀合物的过程

随后Maynard[84]工作组又利用蛋白质或者多肽的某一种氨基酸修饰的ATRP引发剂引发苯乙烯和甲基丙烯酸甲酯聚合，从而将聚合物嵌入到蛋白质中的某一固定位置（图1.14）。

同时也用此方法合成含糖聚合物-蛋白质生物聚合物。

这种合成方法的优势是可以固定聚合物在蛋白质中生长的位置，从使得合成自然中存在的糖基化模型成为可能。

图1.14由氨基酸修饰的引发剂引发ATRP聚合物从而合成聚合物-蛋白质缀合物的过程

Bulmus[85]等人利用BSA修饰的水溶性RAFT链转移剂，聚合单体NIPAAm，成功的制备了BSA-聚合物生物缀合物。

电镜结果表明反应之后不存在单纯的聚合物，因此聚合物-蛋白质生物缀合物无需进一步纯化分离。

所得到的生物缀合物具有温度响应性，随着PNIPAAm的聚合度不同而呈现不同的LCST。

图1.15RAFT法原位聚合合成生物缀合物

Bulmus和Davis等人[86]利用蛋白质BSA上的巯基与带有巯基吡啶的链转移剂反应得到大分子链转移剂，室温下在水溶液中引发聚乙二醇丙烯酸酯聚合（图1.15）。

GPC测试结果表明，缀合物分子量随着单体转化率呈线性增长，说明大分子链转移剂引发的RAFT聚合过程是分子量可控的反应。

Sumerlin等人[87]通过巯基-烯烃点击反应合成含有蛋白质BSA的大分子链转移剂，在常温下聚合单体NIPAAm，从而在温和的条件下形成聚合物-蛋白质生物缀合物（图1.16）。

由于PNIPAAm具有温敏性，所以可以通过加热离心进行分离，得到比较纯净的缀合物，结果证明，在合成过程中蛋白质的二级结构和活性都保持很好。

图1.16温敏性聚合物-蛋白质生物缀合物的合成过程

与“Graftingto”方法相比，“Graftingfrom”方法的优点在于可以提高蛋白质的结合率，而且不需要进一步进行纯化分离。

但是由于蛋白质比较容易变性，经蛋白质修饰的ATRP引发剂或RAFT试剂只能应用于较低温度下水体系中的聚合，这样就限制了可适用的单体范围。

1.3.2“Graftingto”方法合成聚合物-蛋白质缀合物

“Graftingto”方法即通过对聚合物链进行端基修饰，引入不同的α-或ω-聚合物端基功能基团与蛋白质进行反应，得到聚合物-蛋白质生物缀合物。

由于一般的“Graftingto”方法蛋白质结合率比较低，人们将提高蛋白质与聚合物的结合率作为了研究的重点。

近年来，人们开始利用一些偶联反应例如炔基-叠氮环加成点击反应，巯基-烯烃点击化学和巯基-二硫吡啶交换反应来制备聚合物-蛋白质生物缀合物，由于这些反应所要求的反应条件比较温和，反应可靠，对氧气和水不敏感，产物产率高，越来越成为人们关注的热点。

1.3.2.1通过炔基-叠氮点击化学合成聚合物-蛋白质生物缀合物

点击化学同样在表面修饰及生物缀合物合成等高分子科学领域有着广泛的应用潜力。

利用点击化学合成聚合物-蛋白质生物缀合物需要合成端基分别带有N3和炔基的聚合物和生物大分子，然后在Cu（I）催化剂体系下催化进行。

Schultz等人[88]利用炔基修饰了PEG聚合物链，在温和的条件下与叠氮修饰的超氧化物歧化酶进行点击击反应，从而制备得到具有良好生物相容性的聚合物-蛋白质生物缀合物，此缀合物有望应用于生物医学方面。

Cornelissen等人[89]首先利用ATRP聚合方法合成了聚苯乙烯（PS），而后对其进行端基修饰得到端基带有叠氮基团的功能聚合物PS-N3，与炔基化的蛋白质BSA进行点击反应，得到聚合物-蛋白质生物缀合物（图1.17）。

此缀合物能在弱碱性缓冲溶液中形成30-70nm的胶束。

除此之外，Cornelissen等人[90]还利用荧光标记的Cu催化剂对利用点击化学制备聚合物-蛋白质的过程进行了研究。

他们首先合成了用3-叠氮基香豆素修饰的PEG聚合物链，将BSA做为模板蛋白，制备得到炔基修饰的蛋白质BSA炔，以荧光标记的Cu催化剂催化BSA炔与叠氮化的PEG聚合物链进行点击反应。

结果显示，点击反应的反应效率非常高，并且反应十分迅速。

图1.17利用ATRP和“click”方法合成生物缀合物

Sumerlin[91]等人含有N3基团的RAFT链转移剂，聚合单体NIPAAm，合成了端基含有N3基团的温敏性聚合物，与炔基化BSA进行点击反应来制备聚合物-蛋白质生物缀合物，这是第一次关于RAFT聚合与点击相结合制备聚合物-蛋白质生物缀合物的报道，在LCST之上，亲水性的蛋白质可以和疏水的聚合物形成胶束。

1.3.2.2通过巯基-烯烃点击化学合成聚合物-蛋白质生物缀合物

通过巯基-烯烃点击反应制备聚合物-蛋白质生物缀合物需要合成端基含有双键的能发生巯基-烯烃点击反应的聚合物，再和含有巯基的生物大分子进行加成反应。

Park[92]等人合成了端基为乙烯基砜（VS）的PEG-PLLA嵌段聚合物，这种聚合物可以发生巯基-烯点击反应，由此可以和任何含有巯基的生物大分子通过点击化学在温和的条件下形成聚合物-蛋白质生物缀合物（图1.18）。

这种嵌段聚合物在水溶液中形成胶束，在靶向药物释放上有很大的应用前景。

图1.18通过迈克尔加成将含有巯基的生物分子缀合到端基为VS基团的胶束上

Davis和Bulmus等人[93]利用二硫酯和三硫酯RAFT链转移剂分别聚合MMA,HPMA和NIPAAm单体，得到ω-端功能聚合物。

PNIPAAm和PHPMA分别与甲基丙烯酸修饰的甘露糖和马来酸修饰的生物素（biotin）通过巯基-烯烃点击反应在温和的条件下得到生物缀合物，结果表明缀合率达到85%。

同时，也可以利用同样的方法将聚合物转化为丙烯酸甲酯类的大分子单体，从而可以进一步与带巯基的生物分子进行缀合，得到生物缀合物。

1.3.2.3通过巯基-二硫交换反应合成聚合物-蛋白质生物缀合物

巯基-二硫交换反应也是近年来人们关注比较多的一种制备聚合物-蛋白质生物缀合物的方法。

它是合成二硫端基功能化或者侧链含有二硫的聚合物，然后与含有自由巯基的生物大分子通过二硫键的断裂和形成得到聚合物-蛋白质生物缀合物。

可以通过合成端基含有二硫吡啶的ATRP引发剂或者RAFT试剂来得到端基功能化的聚合物，也可以对聚合物进行端基修饰来得到端基功能化的聚合物，聚合物可以在温和的条件下与生物大分子高效率的形成聚合物-蛋白质生物缀合物。

Maynard[94]等人通过含有二硫吡啶的ATRP引发剂合成末端带有功能基团的聚合物，再与含巯基的BSA进行生物缀合（图1.19）。

这种方法可以用来制备各种聚合物的生物缀合物，其优点之处在于无需再对聚合物进行修饰。

图1.19利用含有二硫吡啶基团的ATRP引发剂合成聚合物-蛋白质生物缀合物的过程

Davis[95]等人利用含有α-二硫酯端基基团和ω-双二硫吡啶端基基团的RAFT链转移剂合成可降解的AB2型大分子单体，之后对其α端基进行氨解还原，得到α端基为巯基的聚合物，此聚合物的α端基和ω端基可以发生巯基-二硫交换反应从而通过自身反应得到端基含有二硫吡啶的超支化聚合物，这种超支化聚合物可以进一步与含有巯基的生物大分子反应，得到聚合物-蛋白质生物缀合物，在生物医疗领域有很大的潜在应用价值。

Bulmus[96]等人利用端基是二硫酯基团的RAFT链转移剂合成聚合物，将二硫酯端基氨解还原为巯基，再与二硫二吡啶（DTP）反应得到端基为二硫吡啶的功能化聚合物，此功能化聚合物可以与含有巯基的生物分子通过巯基-二硫吡啶交换反应合成生物大分子。

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