遗传学实验 用GUS基因表达观察启动子功能.docx
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遗传学实验用GUS基因表达观察启动子功能
用GUS基因表达观察启动子功能
摘要通过GUS基因表达染色程度判定启动子关键序列。
1.引言
在真核生物中,主要通过顺式调控元件启动子和反式作用因子转录因子的相互作用,对基因表达进行调控。
启动子的功能可以利用报告基因进行检测。
报告基因GUS基因存在于E.coli等一些细菌基因组内,编码β-葡萄糖苷酸酶。
β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶,以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物,其反应产物可用多种方法检测出来。
由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性,因此这个基因被广泛应用于植物基因调控的研究中。
科研工作中发现,盐芥液泡焦磷酸酶基因启动子(TsVP1)在除了种子以外的所有组织中都有活性,它的活性在根和叶中能被盐诱导,尤其在根尖中。
为了研究启动子的关键序列,构建了盐芥液泡焦磷酸酶基因启动子(TsVP1)不同长度启动区控制的β-葡萄糖苷酸酶(GUS)载体pCAMBIA1391z(PTsVP:
:
GUS),转染拟南芥,获得转基因拟南芥PT1,PA1和P7。
发现PT1,PA1和P7具有不同的GUS活性及盐诱导活性。
表明启动区长度对启动子功能有影响,由此推测启动子的关键序列及诱导特点。
2.实验材料
2.1实验材料2.1.1材料
拟南芥种子PT1、PT2、PT7、PT8
2.1.1试剂
配制MS培养基所需的母液,琼脂,蔗糖,1mol/L的NaOH溶液,70%乙醇,无菌水,10%次氯酸钠,琼脂粉,NaCl,1mol/LGUS染色液。
2.1.1器具
量筒,移液枪,烧杯,天平,玻璃棒,滴管,pH计,500mL锥形瓶,高压蒸汽灭菌锅,培养皿,EP管,人工培养箱,吸管,吸水纸。
2.2实验方法2.2.1配制MS培养基
MS培养基:
Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的,其特点是无机盐和离子浓度较高,是较稳定的离子平衡溶液,它的硝酸盐含量高,其养分的数量和比例合适,能满足植物细胞的营养和生理需要,因而适用范围比较广,多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。
MS培养基组成:
配制母液的优点是:
1、避免每次配制培养基都要对几十种成分进行称量。
2、减少了称量微量元素造成的误差。
配制MS培养基:
(1)用量筒和移液枪从各种母液中分别取出所需的用量:
母液Ⅰ(大量元素20×)为10mL,母液Ⅱ(微量元素200×)、Ⅲ(铁盐200×)、Ⅳ(有机成分200×)各1mL,加入烧杯中,再加入蔗糖6g,加蒸馏水至175mL左右。
(2)用滴管吸取物质的量浓度为1mol/L的NaOH溶液,逐滴滴入溶化的培养基中,边滴边搅拌,并随时用pH计测培养液的pH,一直到pH为5.8为止(培养基的pH必须严格控制在5.8。
(3)在大量筒中定容至200mL,倒入锥形瓶,加入1.6g琼脂粉。
(4)同样的方法配制200mL含盐的培养基,在第
(1)步中加入2.34gNaCl。
(5)称0.005g左右的琼脂粉与10mL蒸馏水混合,配成0.05%琼脂液。
(6)高压灭菌
第一,码放锥形瓶。
将装有培养基的锥形瓶直立于金属小筐中,再放入高压蒸气灭菌锅内。
第二,放置其他需要灭菌的物品。
将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内,如用牛皮纸包裹的培养皿、枪头、无菌水、琼脂液等。
第三,灭菌。
待需要灭菌的物品码放完毕,盖上锅盖。
在98kPa、121.3℃下,灭菌20min。
第四,灭菌后取出锥形瓶,让其中的培养基自然冷却凝固,或立即倒平板。
2.2.2培养拟南芥幼苗
(1)培养皿分装培养基
将锥形瓶中的培养基加热融化,在超净工作台上将其趁热倒入四个培养皿,令其自然冷
却凝固。
(2)种子灭菌
种子在EP管内经体积分数70%乙醇漂洗lmin,无菌水洗l次,等量无菌水和10%次氯酸钠混合浸洗10min,无菌水洗5遍,最后加入质量分数0.05%的琼脂液悬浮,分别均
匀撒于平板上。
(3)适宜环境培养
培养条件:
在人工气候室培养,调节温度20℃,湿度75%,光照300μmol/sm2
,光周期
16h光照/8h黑暗(4)盐处理
将MS培养基上培养一周多的植株取10株左右转移到含有200mmolL-1
NaCl的培养基上
相同条件下培养16小时,剩下一半原条件继续培养。
3.结果
PT1染色深于PT2,说明PT1中启动子多于PT2的序列能增强GUS基因的表达。
而PT2的小叶未被染色,说明PT2缺失的部分基因可能与GUS基因在小叶中的表达有关。
PT7染色与PT2相似,说明PT7相对PT2缺失的启动子序列对于GUS基因表达作用效果影响相对较小。
但是PT7中小叶染色,因此说明在所缺失中的启动子序列中存在调控GUS基因在小叶中表达的序列,同时根据PT2与PT1的对比,说明PT2相对PT1中缺失的序列与PT7相对PT2缺失的序列共同影响GUS基因在小叶中的表达。
PT8相对PT7染色较浅,说明PT8相对PT7缺失的序列对GUS表达有增强作用。
而PT8中根基本无染色,说明缺失部分序列对GUS基因表达影响较大。
PT2经盐处理后,染色明显加深,而且小叶中也出现轻微染色,说明盐处理能促进GUS基因的表达。
PT7经过盐处理后,染色也出显的加深,说明GUS基启动子仍然活性较强。
现明因的PT8经盐处理后,染色稍加深,但对比不明显,说明PT8上存留的启动子序列对GUS基因表达的作用已经不是很强烈了。
4.讨论4.讨论经结果讨论推断,启动子关键序列有可能存在与PT7与PT8序列之间,但是由于7、8号拟南芥染色差别不明显,因此,不能十分确定,也有可能关键序列在PT8剩余的序列内,如需确定,还应经过进一步实验确定。