蛋白质工程论文doc.docx

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蛋白质工程论文doc

蛋白质工程

学

末

论

文

学院：

生命与地理科学学院

班级：

10级生物工程

姓名：

吉毛措

学号：

20101911242

目录

摘要、关键词-----------------------------------------------------3

英文翻译-----------------------------------------------------------4

1.蛋白质工程-----------------------------------------------------5

1.1蛋白质工程的诞生---------------------------------------5

1.2蛋白质工程的概述---------------------------------------5

2.蛋白质工程的应用——抗体工程-------------------------6

2.1抗体工程的研究现状和发展前景---------------------7

（1）多克隆抗体---------------------------------------------7

（2）单克隆抗体（杂交瘤技术）-----------------------10

（3）基因工程抗体（人源化抗体）------------------------17

3.抗体融合蛋白--------------------------------------------------21

3.1免疫毒素-------------------------------------------------18

3.2基因工程抗体—酶融合蛋白-------------------------21

3.3基因工程抗体—细胞因子融合蛋白----------------22

4.注释--------------------------------------------------------------23

5.参考文献--------------------------------------------------------23

蛋白质工程在抗体工程方面的应用与发展

摘要：

蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等学科而发展起来的综合性研究邻域。

蛋白质工程的出现，为认识和改造蛋白质分子提供了强有力的手段，在揭示蛋白质形成和功能表达的关系研究中发挥了重要作用。

它不仅可以带动生物技术进一步发展，还可以推动与人类生产、生活关系密切的相关科学的发展。

已有研究表明，蛋白质工程在医药、工业、农业等各行各业中均具有广阔的应用前景。

随着蛋白质工程研究对象的扩大和技术的成熟，其应用领域也将不断拓宽。

本论文就以抗体工程中单克隆抗体、多克隆抗体、基因工程抗体等的研究现状和抗体融合蛋白、杂交瘤技术、人源化抗体等为例介绍蛋白质工程的应用情况和发展概况。

关键词：

单克隆抗体多克隆抗体基因工程抗体抗体融合蛋白杂交瘤技术人源化抗体

Application and development of protein engineering in antibody engineering

Abstract:

Protein engineering is the basis of recombinant DNA technology, biochemistry, molecular biology, molecular genetics and other disciplines, the fusion protein crystallography, protein dynamics, protein chemistry and other disciplines as computer-aided design and develop a comprehensive research neighborhood. The emergence of protein engineering, in order to understand and transform the protein molecules provides a powerful instrument, played an important role in the study of the relationship between to reveal protein formation and functional expression. It can not only drive the further development of biotechnology, can also promote the development of science and human production and life are closely related. Studies have shown that protein engineering has broad prospects for application in medicine, industry, agriculture and other industries. With the expansion of the object of protein engineering and technology mature, will also continue to broaden its applications. The papers on antibody engineering monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, genetically engineered antibody Research and antibody fusion protein, hybridoma technology, humanized antibodies, for example to introduce the application of protein engineering and development overview.

Keywords:

Monoclonal antibodies polyclonal antibodies genetically engineered antibody antibody fusion protein hybridoma technique humanized antibody.

1.蛋白质工程

定义：

是研究蛋白质分子结构规律与生物学功能的关系，对现有蛋白质加以定向修饰改造、设计和剪切，构建生物学功能比天然蛋白质更加优良的新型蛋白。

从预期功能出发，设计期望结构、合成目的基因并有效表达或通过定向诱变、定向修饰和改造等一系列工序，合成优良蛋白。

1.1蛋白质工程的诞生

我们知道生物产生的天然蛋白质是在长期进化过程中产生的，它的结构性能已经不能完全满足人类生产生活的需要。

例如：

干扰素是一种动物体内的抗病毒、抗肿瘤的药物蛋白，但在体外保存相当困难，以及其需求量日益增加。

于是我们要对现有的蛋白质进行改造，制造出目前从天然蛋白质中找不到的蛋白质来满足人类生产和生活的需要。

这样人们就开始了新一轮的探索，蛋白质工程应运而生了。

早在80年代初美国Genex公司K.Ulmer第一次提出蛋白质工程概念,并建立了专门研究实体,制定了相应研究开发计划。

其后,以美国为首的几家生物技术公司同时应用蛋白质工程技术得到几种蛋白质结构,标志着蛋白质工程正式诞生。

1.2蛋白质工程的概述

目标：

根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。

蛋白质工程的原理：

基因改造

基本途径：

从预期的蛋白质功能出发

设计预期的蛋白质结构

推测应有的氨基酸序列

找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）

蛋白质工程的流程：

（如下图）

3.蛋白质工程的应用——抗体工程

抗体不仅在哺乳动物机体中担负着重要的体液免疫功能,还在医学、生物学免疫诊断中被广泛地应用。

本世纪证明了抗体是一类免疫球蛋白,并相继阐明了抗体产生及其多样性的细胞和分子机制,使免疫学研究成为生命科学前沿领域。

Porter等对血清IgG抗体的研究证明，Ig分子的基本结构是由四肽链组。

即由二条相同的分子量较小的肽链称为轻链和二条相同的分子量较大的肽链称为重链组成的。

轻链与重链是由二硫键连接形成一个四肽链分子称为Ig分子的单体，是构成免疫球蛋白分子的基本结构。

Ig单体中四条肽链两端游离的氨基或羧基的方向是一致的，分别命名为氨基端（N端）和羧基端（C端）。

Ig分子酶水解片段示意图

随着生命科学技术的发展，抗体的制备技术也经历着一次又一次革命,由血清抗体到杂交瘤单克隆抗体,再到基因工程抗体库技术,可谓日新月异。

下面主要是介绍杂交瘤单抗克隆技术，以及其遇到的问题是如何通过蛋白质工程加以解决的。

2.1抗体工程的研究现状和发展前景

（1）多克隆抗体（polyclonalantibody）：

抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。

抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Moncloneantibody）。

由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。

　　抗原上那部分可以引起机体产生抗体的分子结构，叫做抗原决定簇。

一个抗原上可以有好几个不同的抗原决定簇，因而使机体产生好几种不同的抗体，最终产生出抗体是浆细胞。

只针对一个抗原决定簇起作用的浆细胞群就是一个纯系，纯系的英文为Clone，音译就是克隆。

由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。

单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。

另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。

多克隆抗体又简称多抗。

与之相对应的叫单克隆抗体，简称单抗。

抗原准备

概述

　　可以作为抗原的物质有很多种，一般的科研实验中，经常使用的抗原有：

偶联多肽、偶联的小分子或化合物、天然或重组蛋白等等。

　　对可溶性抗原而言，为了增强其免疫原性或改变免疫反应的类型、节约抗原等目的，常采用加佐剂的方法以刺激机体产生较强的免疫应答。

佐剂应用

　　1．佐剂的类型目前实践中常应用的佐剂有氢氧化铝胶、明矾、弗氏佐剂、脂质体和石蜡

　　油等。

也有采用结合杆菌等分枝杆菌、白喉杆菌以及细小棒状杆菌等。

　　⑴弗氏不完全佐剂（incompleteFreund'sadjuvant,IFA）

　　羊毛脂1份

　　石蜡油5份

　　混合，高压灭菌后保存。

用时加热融化，冷却至50℃左右，加抗原进行乳化处理。

　　⑵弗氏完全佐剂（completeFreund'sadjuvant,CFA）

　　弗氏不完全佐剂10ml

　　卡介苗10mg～200mg卡介苗可100℃10min灭活处理。

　　初次免疫时，最好用弗氏完全佐剂，以刺激机体产生较强的免疫反应。

再次免疫时，一般不用完全佐剂，而采用弗氏不完全佐剂。

但在研究分枝杆菌及相关抗原时，一般不用弗氏完全佐剂，以免卡介苗的干扰。

　　⑶脂质体：

是人工制备的类脂质的小球体，由一个或多个酷似细胞膜的类脂双分子层组成，这种结构使其能够携带各种亲水的、疏水的和两性物质，他们被包裹在脂质体内部的水相中，或插入类脂双分子层或吸附、联接在脂质体的表面，起到明显的免疫增强作用。

　　⑷油佐剂：

采用植物油和矿物油均可，包括豆油、花生油、油菜油等。

目前应用最广的矿物油。

10号白油（石蜡油）100ml

　　硬脂酸铝2g

　　司本806ml

　　混合加热融化，分装。

用时按下列配方进行乳化。

　　油相3份

　　水相（加4%吐温－80）1份

　　先把油相搅拌起来，然后缓慢加入水相乳化。

司本是油分散剂，吐温是水分散剂，均有利于

　　乳化。

乳化作用

　　将抗原与佐剂混合的过程称为乳化。

乳化的方法很多，可采用研钵乳化；可直接在旋涡振荡器上乳化；可用组织捣碎器乳化。

少量时，特别是弗氏佐剂与抗原乳化时，常采用注射器乳化，用两个注射器，一个吸入抗原液，一个吸入佐剂，两注射器头以胶管连接，注意一定扎紧，然后来回抽吸。

当大量乳化时，可采用胶体磨进行。

　　乳化好的标志是取一滴乳化剂滴入水中呈现球形而不分散。

如出现平展扩散即为未乳化好。

乳化过的物质放置一段时间（在保存期内）出现油水分层也是未乳化好的表现。

根据抗原的性质、免疫原性和动物的免疫反应性来决定免疫途径、免疫次数和间隔时间等。

免疫途径包括皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射以及淋巴结内注射等。

抗原量少，则一般多采用加佐剂，淋巴结内或淋巴结周围、或足掌、或皮内、皮下多点注射，如抗原量多，则可采用皮下、肌肉、以至静脉注射。

注射间隔时间带佐剂的皮内、皮下注射，一般为间隔2～4周免疫一次。

不带佐剂的皮下或肌肉注射，一般为1～2周间隔时间；肌肉或静脉免疫的，可5天左右的间隔时间。

可以把各种注射途径联合起来应用，最终以达到效价要求为目的。

免疫动物

　　供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。

动物的选择常根据抗体的用途和量来决定，也与抗原的性质有关。

如要获得大量的抗体，多采用大动物；如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体；如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备；一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备。

　　免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物，雌性动物特别是妊娠动物用于制备免疫抗体则非常不合适，有时甚至不产生抗体。

由于对免疫应答的个别差异，免疫时应同时选用数只动物进行免疫。

抗原是多种多样的，而且千差万别。

就其化学成分而言，有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。

就抗原性而言，有完全抗原和不完全抗原。

为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原，如要制备用于筛选细菌表达的cDNA文库或免疫印迹的抗血清，最好选用可降解的蛋白质抗原。

不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构、物理形状和弥散速度等。

　　抗原的免疫剂量是依照给予动物的种类、免疫周期以及所要求的抗体特性等不同而不同。

剂量过低，不能引起足够强的免疫刺激，免疫剂量过多，有可能引起免疫耐受。

在一定的范围内，抗体的效价是随注射剂量的增加而增高。

蛋白质抗原的免疫剂量比多糖类抗原宽。

一般而言，小鼠的首次免疫剂量为50μg～400μg/次，大鼠为100μg～1000μg/次，兔为200μg～1000μg/2次。

加强剂量为首次剂量的1/5～2/5。

免疫剂量与注射途径有关，一般而言，静脉注射剂量大于皮下注射，而皮下注射又比掌内和跖内皮下注射剂量大，也可采用淋巴结内注射法。

加佐剂比不加佐剂的注射剂量要小，对家兔而言，采用弗氏完全佐剂，则需注射0.5mg～1mg/kg./次，如采用弗氏不完全佐剂则注射剂量应大10倍以上。

如要制备高度特异性的抗血清,可选用低剂量抗原短程免疫法。

如需要获得高效价的抗血清，宜采用大剂量长程免疫法。

免疫周期长者，可少量多次。

免疫周期短者，应大量少次。

两次注射的间隔时间应长短适宜,太短起不到再次反应的效果太长则失去了前一次激发的敏感作用。

一般间隔时间应为5~7天，加佐剂者应为2周左右。

注射的Ig纯度高，则一般不易引起过敏反应，如注射血清，即使是少量，在再次免疫时，极易引起过敏反应，所以一定要采取措施。

除此之外，多克隆抗体也可研究并开发成抗体药物。

例thymoglobulin

（兔抗胸腺细胞球蛋白）是美国Sangstat公司的新产品，是用人胸腺细胞免疫家兔后纯化其中的免疫球蛋白得到多抗药物。

美国FDA先后批准了thymoglobulin用于治疗肾移植手术的急性排异反应，和作为脊髓发育不良综合症（MDS）的指定用药。

2002年，该药在加拿大也获准使用。

（2）单克隆抗体（monoclonalAB，MCAB）：

动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。

当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。

被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。

如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。

单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。

单克隆抗体的制备过程

　　1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。

一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。

抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞[1]。

　　2、细胞融合采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。

将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。

在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。

　　3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。

在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。

未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。

只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。

　　4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。

通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。

采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。

经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。

　　5、单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。

（1）体内诱生法取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石腊或降植烷进行预处理。

1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。

杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。

约1-2周，可见小鼠腹部膨大。

用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。

（2）体外培养法将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。

在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。

但这种方法产生的抗体量有限。

近年来，各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。

抗原准备

　　抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。

抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。

很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。

动物免疫

　　单克隆抗体制备的宿主动物一般选用Balb/c小鼠，鼠单抗的应用范围相当广泛，也有一些公司声称开发出了兔的单克隆抗体制备技术。

　　免疫原分为可溶性抗原和颗粒性（细胞）抗原，用无菌盐水稀释并与佐剂混合，腹腔注射抗原与佐剂彻底混匀后形成的稳定乳状液，在免疫原提供持续的免疫应答基础上进行加强免疫

　　周期第1天采血0.2ml（获得0.1ml免疫前血清）

　　第一次免疫（抗原加弗氏完全佐剂）

　　第14天第二次免疫（抗原加弗氏不完全佐剂）

　　第21天采血和ELISA检测

　　第35天第三次免疫（抗原加弗氏不完全佐剂）

　　第42天采血和ELISA检测

　　第56天第四次免疫（抗原溶于PBS或盐水）

　　第61天细胞融合

细胞融合

（一）融合剂

　　细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合法和生物融合法，如灭活的仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。

聚乙二醇（PEG），在分子量为200～700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品不起作用。

用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4000者，常用浓度为50%，pH8.0～pH8.2（用10%NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。

50%浓度，pH偏碱时融合效应最高。

也有采用30%～50%浓度的PEG加上10%二甲亚砜。

不同批号的PEG，即使分子量相同，但融合率却有明显差异，选用时必须注意。

每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。

要买高纯度的，一般选供气相色谱用的PEG。

（二）融合过程

　　融合的方法很多，常用的有转动法和离心法。

融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:

1至10:

1不等。

3:

1或5:

1最为常用。

　　1．试剂与材料

（1）供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。

（2）1640培养液100ml。

　　（3）完全1640液100ml。

　　（4）2.5%FCS－1640液50ml。

　　（5）HAT培养液100ml。

　　（6）50%PEG：

取分子量4000，高纯度的（日本进口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前用预热于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚红检查pH，一般不必调pH。

如pH有改变，可用HCl或NaHCO3调整。

　　（7）10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。

　　（8）40孔塑料培养盘。

　　2．操作方法

　　⑴准备好脾细胞。

　　⑵在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml2.5%FCS－1640液。

　　⑶室温400g离心3min，使细胞沉淀。

　　⑷移去上清液。

　　⑸轻敲管底部，使沉淀流动，把沉淀管放于40℃水浴中，使其达融合温度。

　　⑹加预热至40℃的50%PEG0.8ml，用1ml吸管缓慢滴加，边加边摇沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程要求持续2min。

　　⑺加1ml1