不同植物油脂对体外培养条件下培养液酶活及微生物活力的影响.docx
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不同植物油脂对体外培养条件下培养液酶活及微生物活力的影响
不同植物油脂对体外培养条件下培养液酶活及微生物活力的影响
摘要:
本文旨在研究不同饱和程度的植物油脂对体外培养条件下培养液酶活及微生物活力
的影响。
试验以3头装有瘤胃瘘管的山羊提供瘤胃液，采用单因子试验设计，对照组不加油脂，试验组分别添加花生油、菜籽油、玉米油和豆油进行体外培养。
结果表明:
乳酸脱氢酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶3种酶的活性都以菜籽油组最高，豆油组、玉米油组、花生油组依次降低，除花生油组外，其他试验组均显著高于对照组（P＜0．05），且试验组间存在显著差异（P＜0．05）。
总脱氢酶以豆油组最高，显著高于对照组（P＜0．05），并依次显著高于玉米油组、花生油组和菜籽油组（P＜0．05）。
此外，油脂组原虫DNA、细菌DNA、微生物DNA、原虫/细菌区系比例的均值与对照组，以及试验组间差异均不显著（P＞0．05），但随着培养时间的延长其动态变化模式不尽相同。
微生物DNA在各时间点都以豆油组与玉米油组的较高;而原虫/细菌比例则以豆油组和玉米油组较低。
综上所述，饱和程度不同的油脂对体外培养瘤胃微生物区系及其微生物细胞活力影响不同，其中以豆油促进微生物活力的效应最佳，玉米油较好。
关键词:
油脂;瘤胃微生物;转氨酶;脱氢酶;体外
油脂作为能量饲料，对畜禽生产至关重要。
但有报道认为，不饱和的油脂使用超过一定的量
时，其降解产生的游离脂肪酸的不饱和键将会毒
害瘤胃原虫和部分细菌，减少微生物的群体量并
可能改变其群体结构，进而影响正常的微生物代
谢与瘤胃发酵
［1－2］
。
若能够借助油脂的这种负面
效应，科学使用油脂，则可能达到在一定程度上抑
制原虫群体量和其对细菌的吞噬力，进而增加细
菌量、降低原虫与细菌区系比例、提高微生物生物
总量，促进瘤胃发酵的效果。
研究表明，各区系微
生物（细菌、原虫、真菌和甲烷菌）因各自特点而对
不饱和油脂的响应也不尽一致，如没有体壁的原
虫对油脂较其他微生物为敏感
［1］
，本实验室前期
对微生物微循环的研究也发现适量比例、且适当
结构的油脂能够抑制原虫吞噬细菌的微生物再循
环、增加了细菌生物量，对原虫和细菌区系有一定
的控调效应
［3］
。
因此，利用广泛易得、经济实用的
油脂能量饲料作为瘤胃调控剂，增强瘤胃内酶和
微生物活性、促进发酵，而最终实现饲料碳素、氮
素的利用效率和宿主动物的生产力是可行而又实
践意义的。
关于油脂的研究多以影响瘤胃的微生
物、发酵、甲烷产量等为主
［4－6］
，迄今尚未见关于
影响微生物转氨酶、脱氢酶等细胞活力方面的研
究报道。
鉴于此，本试验拟选用4种植物油脂分
别进行体外培养，测定体系中转氨酶、脱氢酶等的
活性，以研究饱和程度不同的油脂对微生物细胞
活力影响的规律和机制，为反刍动物瘤胃微生态
调控技术的研究和实际生产中油脂的使用提供参考。
动物营养学报23卷
1材料与方法
1．1试验动物与饲养管理
在扬州大学农牧场选择3只1．5岁并装有瘤
胃瘘管的徐淮白山羊，平均体重为（29．7±0．14）kg，
用于采集瘤胃液。
试验山羊分隔单舍，以玉米、豆
粕和羊草为常规饲粮，于07:
00和19:
00分2次饲
喂，自由饮水。
1．2试验设计与培养底物
试验采用单因子试验设计，共分5组，每组3
重复。
对照组不加油脂、试验组分别为花生油组、
菜籽油组、玉米油组和豆油组。
底物组成与油脂
碘价见表1，棕榈酸钙为本实验室生产。
表1底物组成与油脂碘价
Table1Compositionofsubstratesandiodinevaluesofoil%
项目
Items
对照组
Control
group
花生油组
Peanutoil
group
菜籽油组
Rapeseedoil
group
玉米油组
Cornoil
group
豆油组
Soybeanoil
group
碘价
Iodine
value
淀粉Starch1919191919
酪蛋白Casein1010101010
纤维素Cellulose6767676767
棕榈酸钙Calciumpalmitate4
花生油Peanutoil494．1
菜籽油Rapeseedoil4114．5
玉米油Cornoil4131．3
豆油Soybeanoil4143．7
合计Total100100100100100
碘价为实测值。
Iodinevalueswereallmeasuredvalues．
1．3体外培养与取样设计
参考Menke等
［7］
的方法。
配制好培养液（人
工唾液盐∶瘤胃液=2∶1），通入CO
2
，39℃水浴预
热。
按照试验设计准确称取2．0g底物置于培养
瓶中，分别加入150mL培养液。
通入CO
2
，39℃
恒温水浴震荡培养。
分别在培养后0、4、8、12、16、24h取样，每次
取约15mL培养液，分装于3支离心管，其中1支
立即离心并取上清液用于测定谷丙转氨酶、谷草
转氨酶、乳酸脱氢酶的酶活;1支立即离心并用于
测定总脱氢酶酶活;1只立即于－20℃冷冻保存，
待分离微生物与微生物DNA的测定。
1．4测定指标及方法
1．4．1谷丙转氨酶、谷草转氨酶及乳酸脱氢酶测定
各个时点取样后立即7000r/mim离心15min
离心，并取上清液送江苏省苏北人民医院，采用全
生化分析仪测定。
1．4．2总脱氢酶活性测定
参考Humeyan等
［8］
的方法，并略有改进。
取
100目尼龙布过滤的新鲜培养液2mL于试管中，
加入0．2mL1．5%的氯化三苯四氮唑（TTC）反
应，而对照管先加入5mL异丙醇抑制酶反应。
在
厌氧条件下恒温水浴（38～39℃）10min。
试验组
加入5mL异丙醇终止反应后，以4000r/mim离
心10min。
上清液稀释15倍，于分光光度计在
485nm处比色。
酶活单位定义为在38．5℃、pH
6．8条件下，每分钟引起测定液吸光度上升0．1的
酶量为1个酶活单位。
酶活单位（U/mL）=（样品A485nm/min－
对照A485nm/min）×15。
1．4．3微生物分离与其DNA的测定
依据差速离心原理分离微生物，具体步骤为:
1）原虫:
取瘤胃液加等体积生理盐水置于恒温
（39℃）水浴锅中震荡（125r/min）水浴孵育
60min，并辅以搅拌，再经4层纱布过滤，滤液离心
（400r/mim离心10min），收集沉淀为原虫，用生
理盐水洗涤2次后用生理盐水悬浮，－20℃贮存
待测。
2）细菌:
收集上述1）中离心后的上清液，
再高速离心（15000r/mim离心15min），收集沉
淀为细菌，其余处理同1）中所述。
微生物DNA测定原理:
微生物体内DNA所
占比例比RNA或蛋白质等成分更为恒定，利用微
生物的DNA量来代表微生物的总量更加科学。
DNA二苯胺显色后其595nm处的吸光度与样品
13108期王曙等:
不同植物油脂对体外培养条件下培养液酶活及微生物活力的影响
中含量成线性关系，线性范围为40～400μg/mL，
据此将待测样品释至线性范围内测定其光密度
值、再据标准品测定得到的标准曲线即可查得样
品浓度。
微生物DNA测定采用二苯胺显色法并
参照赵亚华
［9］
的步骤。
制备小牛胸腺DNA钠盐
（上海生工公司）标准溶液，制作以DNA量为横
坐标，吸光度值为纵坐标的标准曲线。
以样品的
吸光度值从标准曲线上查出相对应DNA含量。
1．5统计分析
Excel整理数据和作图，用SPSSv16．0软件中
comparemean的One-way-ANOVA过程进行方差
分析和Tukey多重比较。
2结果与分析
2．1转氨酶及脱氢酶随时间的动态变化
由表2和表3可见，培养液谷草转氨酶、谷丙
转氨酶、乳酸脱氢酶等随培养时间的延长大体上
都不断提高，其中以菜籽油组变化幅度最大、豆油
组次之，并且该2组持续在远高于对照组和其他
油脂组的水平上变化;而玉米油组与花生油组与
对照组接近，变化幅度不大。
各个时间点比较，其
中谷草转氨酶、谷丙转氨酶随时间变化的幅度较
大，同一组的随时间变化有显著变化（P＜0．05）;
而乳酸脱氢酶随时间变化的幅度不大，同一组的
各个时间点间没有显著差异（P＞0．05）。
由表3可见，随着培养时间的延长，各组培养
液总脱氢酶的活性有显著增长的趋势（P＜0．05），
除玉米组外，都以16h的该酶活性最高，而后又略
有下降。
各组间变化不尽一致，其中以豆油组增
长幅度最大，其次依次为玉米油组、花生油组、对
照组和菜籽油组，总体看来仅菜籽油组的总脱氢
酶活性在培养过程中持续低于对照组。
表2培养液中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活性变化
Table2TheactivitiesofGOTandGPTinculturesolutionIU/L
项目
Items
时间Time/h
0481624
SEM
P值
P-value
谷草转
氨酶
GOT
对照组
Controlgroup
9．67±
0．58
b
8．67±
0．58
b
10．33±
1．15
b
9．67±
0．58
b
12．33±
0．58
a
0．5960．001
花生油组
Peanutoilgroup
14．33±
1．15
b
15．33±
0．58
b
14．00±
1．00
b
16．33±
0．58
ab
18．67±
1．15
a
0．7600．001
菜籽油组
Rapeseedoilgroup
107．00±
2．65
c
108．67±
2．31
c
107．33±
4．62
c
123．33±
5．86
b
142．67±
4．51
a
3．4320．000
玉米油组
Cornoilgroup
26．67±
1．53
b
29．33±
1．15
b
27．67±
1．15
b
35．00±
2．00
a
37．67±
2．08
a
1．3330．000
豆油组
Soybeanoilgroup
58．67±
2．08
c
66．33±
3．51
b
64．00±
1．73
bc
65．33±
1．52
b
72．33±
1．15
a
1．7640．000
谷丙转
氨酶
GPT
对照组
Controlgroup
16．00±
1．00
b
16．00±
1．00
b
18．33±
0．58
ab
17．00±
1．00
ab
18．67±
1．15
a
0．7890．017
花生油组
Peanutoilgroup
24．00±
1．73
b
24．67±
1．53
b
24．00±
1．00
b
25．33±
0．58
b
29．67±
1．53
a
1．0950．002
菜籽油组
Rapeseedoilgroup
147．67±
7．02
c
175．00±
7．00
b
176．67±
4．93
b
188．67±
4．51
ab
201．33±
8．08
a
5．2700．000
玉米油组
Cornoilgroup
47．33±
1．53
b
51．00±
4．00
b
49．33±
1．53
b
53．33±
1．15
b
64．67±
3．79
a
2．2010．000
豆油组
Soybeanoilgroup
82．67±
3．79
c
95．00±
2．00
b
90．33±
3．51
bc
93．67±
2．08
b
102．00±
2．64
a
2．3660．000
同行数据肩标相同小写字母表示差异不显著（P＞0．05），相邻小写字母表示差异显著（P＜0．05），相间小写字母表示
差异极显著（P＜0．01）。
下表同。
Inthesamerow，valueswiththesamesmalllettersuperscriptsmeannosignificantdifference（P＞0．05），withadjacent
smalllettersuperscriptsmeansignificantdifference（P＜0．05），whilewithalternatesmalllettersuperscriptsmeanextremelydif-
ferent（P＜0．01）．Thesameasbelow．
1311动物营养学报23卷
表3培养液中乳酸脱氢酶和总脱氢酶的活性变化
Table3TheactivitiesofLDHandtotaldehydrogenaseinculturesolution
项目
Items
时间Time/h
0481624
SEM
P值
P-value
乳酸脱氢酶
LDH/
（IU/L）
对照组
Controlgroup
0．007±
0．006
0．003±
0．006
0．000±
0．000
0．007±
0．006
0．013±
0．015
0．0060．256
花生油组
Peanutoilgroup
0．013±
0．006
0．010±
0．010
0．007±
0．006
0．007±
0．006
0．023±
0．006
0．0060．068
菜籽油组
Rapeseedoilgroup
0．030±
0．002
0．023±
0．006
0．023±
0．006
0．033±
0．006
0．060±
0．010
0．0090．011
玉米油组
Cornoilgroup
0．017±
0．015
0．013±
0．006
0．033±
0．006
0．010±
0．010
0．013±
0．012
0．0080．507
豆油组
Soybeanoilgroup
0．027±
0．015
0．017±
0．015
0．010±
0．010
0．013±
0．006
0．020±
0．010
0．0100．509
总脱氢酶
Totaldehydro-
genase/
（U/L）
对照组
Controlgroup
0．543±
0．021
c
0．747±
0．021
b
0．863±
0．032
a
0．897±
0．005
a
0．840±
0．036
a
0．0270．000
花生油组
Peanutoilgroup
0．490±
0．062
c
0．890±
0．036
b
0．963±
0．038
ab
1．050±
0．046
a
0．883±
0．032
b
0．0360．000
菜籽油组
Rapeseedoilgroup
0．437±
0．015
e
0．547±
0．025
d
0．790±
0．062
b
0．890±
0．017
a
0．663±
0．021
c
0．0270．000
玉米油组
Cornoilgroup
0．447±
0．021
b
1．043±
0．055
a
1．103±
0．015
a
1．063±
0．055
a
1．013±
0．067
a
0．0390．000
豆油组
Soybeanoilgroup
0．443±
0．029
c
1．077±
0．045
b
1．153±
0．049
ab
1．213±
0．051
a
1．183±
0．067
ab
0．0410．000
2．2油脂对转氨酶、脱氢酶均值的影响
由表4可见，各组间培养液乳酸脱氢酶、谷草
转氨酶、谷丙转氨酶在各组间有显著差异（P＜
0．05）。
3种酶都以菜籽油组最高、其次依次为豆
油组、玉米油组、花生油组，除花生油组与对照组
差异不显著外（P＞0．05），其他油脂组都显著高于
对照组（P＜0．05）。
总脱氢酶组间差异显著（P＜0．05）。
其中总
脱氢酶以豆油组最高，显著高于对照组（P＜
0．05）、玉米油组次之、花生油组再次之，菜籽油组
最低，在数值上低于对照组，但差异不显著（P＞
0．05）。
2．3油脂对培养液原虫、细菌区系的影响
由表4还可知，培养液原虫、细菌、微生物
DNA，以及原虫/细菌区系比例的均值与对照组差
异不显著（P＞0．05），添加油脂的试验组间也没有
显著差异（P＞0．05）;但本试验中脱氢酶、转氨酶
等动态指标在时间点间基本均有显著变化趋势
（表2、3），而且同时进行的各时间点微生物DNA
及原虫/细菌区系比例测定也表明，各组的微生物
DNA、原虫/细菌比例（图1、2）随时间都有显著或
极显著的变化（P＜0．05、P＜0．01）。
这说明了微
生物在培养过程中其区系、活力等都发生了变化，
而要考察体系中微生物的客观情况不仅要考察其
均值或终点值，还要考察其动态指标;同时也表
明，在本试验的各组培养过程中微生物的量与活
力虽然有较大的动态变化，但微生物的均产量受
到的影响不大。
可通过调节微生物的活力改变其
发酵状态，而不影响微生物蛋白产量。
3讨论
3．1油脂对转氨酶和乳酸脱氢酶活性的影响
谷草转氨酶、谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶等一
般在胞内的浓度远远高于胞外，但若细胞受损、胞
膜破坏将导致胞外的浓度上升。
在本研究中，各
组培养液乳酸脱氢酶、谷草转氨酶和谷丙转氨酶
等随时间培养时间的延长皆不断提高，其原因可
能即是在培养过程中随时间的延长微生物与代谢
物的积累而微生物细胞自溶导致细胞壁、细胞膜
的破坏而释放上述的酶所致
［10－11］
。
其中以菜籽
油组的变化幅度最大、豆油组次之，玉米油组与花
13128期王曙等:
不同植物油脂对体外培养条件下培养液酶活及微生物活力的影响
生油组与对照组接近，变化幅度不大。
可能是由
于植物油脂的不饱和脂肪酸对原虫或细菌具有一
定的负效应，而且不饱和程度越高其负效应越大
所致
［2］
。
本试验也表明碘价最高的豆油组其培养
液转氨酶、乳酸脱氢酶的活性较碘价较低的玉米
油组、花生油组高，其微生物细胞的破损更为
严重。
表44种油脂对培养液酶活及微生物区系的影响
Table4Effectsofthe4kindsofoilsonenzymeactivityandmicroflorainculturesolution
项目
Items
对照组
Control
group
花生油组
Peanutoil
group
菜籽油组
Rapeseedoil
group
玉米油组
Cornoil
group
豆油组
Soybeanoil
group
SEM
P值
P-value
谷草转氨酶
GOT/（IU/L）
10．13±
1．41
d
15．73±
1．91
d
117．80±
14．77
a
31．27±
4．67
c
65．33±
4．89
b
2．6800．000
谷丙转氨酶
GPT/（IU/L）
17．20±
1．42
d
25．53±
2．47
d
177．87±
19．24
a
53．13±
6．71
c
92．73±
6．97
b
3．5480．000
乳酸脱氢酶
LDH/（IU/L）
0．006±
0．007
b
0．012±
0．009
b
0．034±
0．017
a
0．013±
0．009
b
0．017±
0．012
a
0．0040．000
总脱氢酶
Totaldehydrogenase/
（U/mL）
0．778±
0．135
bc
0．853±
0．201
bc
0．665±
0．171
c
0．934±
0．257
b
1．014±
0．302
a
0．0810．001
原虫DNA
ProtozoaDNA/
（mg/mL）
0．010±
0．003
0．009±
0．003
0．008±
0．002
0．010±
0．003
0．010±
0．003
0．0010．411
细菌DNA
BacteriaDNA/
（mg/mL）
0．025±
0．008
0．026±
0．008
0．023±
0．008
0．027±
0．009
0．028±
0．010
0．0030．541
微生物D
升级会员 