抗马立克氏病病毒UL13蛋白单克隆抗体的研制及其 初步应用.docx
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抗马立克氏病病毒UL13蛋白单克隆抗体的研制及其初步应用
分类号 学 号
UDC 密 级
学位论文
抗马立克氏病病毒UL13蛋白单克隆抗体的研制及其
初步应用
李舜曦
指导教师姓名：
秦爱建教授，扬州大学兽医学院，江苏扬州，225009
申请学位级别：
硕士 学科专业名称：
预防兽医学
论文提交日期：
2011年5月 论文答辩日期：
2011年6月
学位授予单位：
扬州大学学位授予日期：
答辩委员会主席：
论文评阅人：
2011年5月
抗马立克氏病病毒UL13蛋白单克隆抗体的研制及其
初步应用
国家自然科学基金项目（30371070）
研究生：
李舜曦
指导教师：
秦爱建教授
扬州大学
二〇一一年六月
目录
符号说明1
摘要3
Abstract5
文献综述7
参考文献17
研究内容一抗MDVUL13蛋白单克隆抗体的研制25
1.材料25
2.方法27
3结果31
3讨论36
参考文献37
研究内容二利用单克隆抗体研究MDVUL1339
1.材料和方法39
2结果43
3讨论47
参考文献：
48
研究成果50
致谢51
扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书52
符号说明
AIV
Avianinfluenzavirus
禽流感病毒
Amp
ampicillin
氨苄青霉素
AP
alkalinephosohatase
碱性磷酸酶
DAB
3，3’-diaminoben
3，3’二氨基联苯胺
DMEM
Dulbecco’smodifiedeaglemedium
基础培养基
FCS
fetalcalfserum
犊牛血清
FITC
fluoresceinisothiocynate
异硫氰酸荧光素
H
hypoxanthine
次黄嘌呤
HAT
Hypoxathine-aminopterin-thymidine（medium）
次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷
HRP
horsedradishperoxidase
辣根过氧化物酶
IBDV
Infectiousbursaldiseasevirus
传染性法氏囊病病毒
IFA
immunofluorecentassay
免疫荧光试验
IgG
immunoglobulinG
免疫球蛋白质G
IPTG
Isopropylthio-β-D-galactodise
异丙基硫代-β-D-半乳糖苷
LB
Luria-Bertanimedium
LB培养基
McAb
monoclonalantibody
单克隆抗体
NC
nitrocellulose
硝酸纤维素
NP
nucleoprotein
核蛋白
NT
nucleotide
核苷酸
OD
opticaldensity
光密度
OPD
o-phenylenediamine
邻苯二胺
PAGE
polyacrylamidegelelectrophoresis
聚丙烯酰胺凝胶电泳
PBS
phosphatebuffersodium
磷酸盐缓冲液
PCR
PolymeraseChainReaction
聚合酶链式反应
PEG
polyethyleneglycol
聚乙二醇
SDS
sodiumdodecylsulfate
十二烷基硫酸钠
Sf9
spodopterafrugiperdaclone9
草地贪夜蛾卵巢细胞
T
thymidine
胸腺嘧啶
TEMED
N,N,N,N-teralethylenediamine
N,N,N,N-四甲基乙二胺
Tris
trishydrochloride
三（羟甲基）氨基甲烷
WB
Westernblot
蛋白免疫印迹试验
X-gal
5-Bromo-4-Chloro-3Indolyβ-D-Galactoside
5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷
计量单位
L
liter
升
μg
microgram
微克
mL
millter
毫升
rpm
rotationperminute
转/分
μL
microliter
微升
h
hour
小时
mol/L
mol/litter
摩尔/升
min
minute
分钟
mmol/L
millimol/litter
毫摩尔/升
d
day
天
μmol/L
micromol/litter
微摩尔/升
U
unit
单位
pmol
picomol
皮摩尔
kDa
kilodalton
千道尔顿
kg
kilogram
千克
bp
basepair
碱基对
g
gram
克
kb
kilobases
千碱基对
mg
milligram
毫克
V
volt
伏特
抗马立克氏病病毒UL13蛋白单克隆抗体的研制及其
初步应用
研究生：
李舜曦
导师：
秦爱建教授
摘要
1抗马立克氏病病毒UL13蛋白特异性单克隆抗体的研制
我们实验室在Genbank上查找出公布的马立克氏病病毒不同毒株的UL13基因序列，发现各种毒株的基因序列基本一致。
利用DNAstar分析软件将CVI988病毒UL13蛋白基因序列翻译成相应的蛋白质。
再利用分析软件对该蛋白质进行分析，得到其高亲水区、高抗原性表达区所在位点。
选择其高抗原性、高亲水性肽段，合成小肽。
利用合成的高抗原性、高亲水性小肽作为免疫原对小鼠进行免疫。
经腹腔免疫注射8周龄雄性Balb/c小鼠。
第一次免疫:
完全佐剂与等体积的多肽混合,腹腔免疫,0.2-0.3ml/只,含多肽20ug/只。
两周后第二次免疫:
不完全佐剂与等体积的多肽混合,腹腔免疫,0.2-0.3ml/只,含多肽50ug/只。
两周后第三次免疫:
不完全佐剂与等体积的多肽混合,腹腔免疫,0.2-0.3ml/只,含多肽70ug/只。
10天后第四次免疫:
取一只balb/c小鼠.腹腔免疫,0.2-0.3ml,含多肽100ug/只。
第四次免疫后72小时-96小时取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合.利用小肽包被的ELISA板反复筛选阳性克隆，并经有限稀释法3次亚克隆。
结果获得了4株特异性分泌抗马立克氏病病毒UL13蛋白的阳性杂交瘤细胞株，分别命名为MDVUL13-DE4，MDVUL13-CF8，MDVUL13-FB3，MDVUL13-EC3。
这4株单抗能与MDV病毒发生间接免疫荧光特异性反应。
并具有具有ELISA和Western-blot反应性。
这些单抗的研制为UL13蛋白功能的相关研究奠定了坚实基础。
2利用单克隆抗体研究MDVUL13
为研究病毒复制表达过程中,UL13蛋白在细胞上的定位，病毒在复制过程中，UL13蛋白的功能以及表达含量。
通过利用特异性的抗MDVUL13的单克隆抗体，运用间接免疫荧光试验、Western-blot试验，对CVI988弱毒疫苗感染鸡胚成纤维细胞进行了MDVUL13蛋白检测，以考察UL13的细胞定位。
以及用Western-blot试验鉴定原核表达蛋白是否能反应。
并且通过一种新的方法诱导表达邓旭芳所构建的大肠杆菌表达UL13蛋白，并运用小鼠多抗血清加以验证，使得纯化出的蛋白能够得到运用，开辟了纯化蛋白的新途径，为今后蛋白质激酶的纯化提供了新的方法，并为研究其激酶功能奠定了良好的基础。
DevelopmentofMonoclonalAntibodiestoUL13proteinofMarek’sdiseasevirusanditspreliminaryapplication
M.SCandiate:
ShunxiLi
Supervisor:
Prof.AijianQin
Abstract
1DevelopmentandCharacterizationofMonoclonalAntibodytoUL13proteinofMarek’sdiseasevirus
OurlaboratoryfindoutinGenbankpublishedonMarek'sdiseasevirusUL13genesequencesofdifferentstrains,Foundthatthegenesequencesofvariousstrainsisconsistent.UsingDNAstaranalysissoftwaretranslatedCVI988virusUL13proteinsequenceintothecorrespondingprotein.Re-useanalysissoftwaretoanalyzetheprotein,obtainthesitesofthehighhydrophilicareas,highexpressionofantigen.Choosethehighantigenicityandhighhydrophilicpeptides,syntheticpeptides.
Usethehighantigenicity,highhydrophilicsmallpeptideasimmunogenforimmunizationofmice.Intraperitonealimmunization8weeksBalb/cmice.First:
MixtureCompleteadjuvantandpeptide,intraperitonealimmunization0.2-0.3ml,containingpeptides20ug/oneMouse.Thesecondtimeintwoweeks:
incompleteadjuvantandpeptidemixture,intraperitonealimmunization0.2-0.3ml,containingpeptides50u/oneMouse.Thethirdtimeintwoweeks:
incompleteadjuvantandpeptidemixture,intraperitonealimmunization0.2-0.3mlcontainingpeptides70ug/oneMouse.Thefourthtimein10days:
takeaBalb/cmice,intraperitonealimmunization0.2-0.3ml,containingpeptides100ug/oneMouse.After72hours-96hours,fusionspleensofmicelymphocytesandSP2/0myelomacells.Useofsmallpeptide-coatedELISAplatesselectedpositiveclonesrepeatedly,and3timesbylimitingdilutionsubcloning.Resultobtainedaspecificanti-secretoryproteinofMarek’sdiseasevirusUL13positivehybridomacelllines.NamedMDVUL13-DE4，MDVUL13-CF8，MDVUL13-FB3，MDVUL13-EC3.This2monoclonalantibodycanspecificallyreactwithMDVvirus.ThedevelopmentofmonoclonalantibodiesuseforUL13proteinfunctionresearchhaslaidasolidfoundation.
2UsingmonoclonalantibodyresearchMDVUL13
Tostudytheexpressionoftheprocessofviralreplication，UL13proteinlocalizationincells.IntheVirusreplication,UL13proteinfunctionandexpressioncontents.ThroughtheuseofspecificmonoclonalantibodiesagainstMDVUL13,Usingindirectimmunofluorescenceassay,Western-blottest,detectCVI988attenuatedinfectionofchickenembryofibroblastsfortheobservationofMDVUL13proteindetection,toexaminethecellularlocalizationofUL13protein.AndidentifiedbyWestern-blottestwhethertheprokaryoticproteinresponse.
AnewapproachthroughinducedexpressionofDengXufangconstructedUL13proteinofE.coli.Andusingmouseantiserumtoverify,Makesthepurifiedproteincanbeused,Openedupnewwaysofpurifiedprotein,inthefutureprovideanewmethodofpurificationProteinkinase.Andtostudyitskinasefunctionhaslaidagoodfoundation.
文献综述
Ⅰ利用多肽作为免疫原的研究进展
多肽疫苗是一种新型疫苗，因其含有能被机体淋巴细胞识别的抗原表位，故可模拟靶抗原，并诱导机体产生保护性免疫应答。
1肽疫苗的合理性
与MHCⅠ类分子一样，MHCⅡ类分子亦是多态性蛋白，它们对启动机体免疫应答具有非常重要的作用[10]。
当外源性蛋白在抗原提呈细胞的初级或次级溶酶体内降解，所产生的肽与MHCⅡ类分子结合，并被转运至细胞膜表面，肽/MHC复合物同时被T细胞共同识别，它们刺激T辅助细胞（CD4+）及抗体反应[23]。
Peters等的观察表明，在溶酶体结构中，抗原受到广泛的蛋白水解作用，而较容易降解的肽段很少能与MHC分子结合[34]。
在某些情况下，由抗原提呈细胞降解的蛋白可被直接在体外用化学或蛋白水解方法裂解的蛋白以及合成的肽段所代替[56]。
抗原性肽则可绕过由抗原提呈细胞完成的处理过程，而直接与细胞表面的MHCⅡ类分子结合[57]。
Roy等在鼠MHC（即H-2）多态性及T细胞特异性方面的研究发现，针对噬菌体阻遏蛋白的T细胞反应，因小鼠的H-2不同而有改变，如B10.BR鼠的T细胞可识别3个不同的抗原表位，而BALA/C和C57BL/6鼠的T细胞仅对一个表位反应[58]。
显然，MHC的多态性优势在物种水平上影响个体能否产生保护性免疫[43]。
这样有些个体有较广泛的免疫应答，而另一些只能得到部分保护[42]。
在另一方面，有关破伤风毒素（tt）表位分析发现，P2能与大多数的DR等位基因产物结合。
这些Ⅱ类分子在β链上的残基有所不同，而拥有相同的α链[36]。
推测可能α链提供了与P2相互作用的位点，使P2的相似构型能被来自不同DR等位基因产物修饰的提呈细胞识别[65]。
因此从理论上推测，合理设计的靶肽若同时能具备免疫原性以及被提呈的广谱性，则有克服MHC多态性限制的可能性，并发展成为对大多数人群有保护力的肽疫苗[69]。
2肽疫苗的设计
测绘T或B细胞所识别的抗原表位的工作近年来颇受重视，T细胞受体（TCR）能识别在抗原提呈细胞表面上的MHCⅡ类分子-抗原二重复合物[78]。
基于一些模型研究的推测，TCR的杂二聚体有类似Fab片段的多肽叠合[77]。
α和β链各有3个互补性决定区域（CDR）[76]。
在四级结构中，每条链的CDR3互相比邻，它们与CDR1及CDR2疏远。
推测TCR的CDR1及CDR2环状结构相对保守，与MHCα螺旋结构相接触，而CDR3为高度变异区，位于MHC抗原结合位点的中央[43]。
后者能与MHC结合裂口配合。
对于抗原/MHC/受体三重复合物的分子特征的了解尚很有限，但T表位几乎是一个小段肽的事实，使我们可以利用一些技术从蛋白质的初级结构上寻找有意义的表位[47]。
2.1使用各种演段法（Algorithms）预测表位，而后进行化学合成。
DeLisi提出T表位为两性分子（Amphipathic）的结构假说，即分子的一部分是亲水的，另一部分是疏水的，分子的极性部份可能被T细胞受体识别，非极性部份可能与提呈细胞作用[63]。
某些研究结果支持此假设：
T表位与抗原分子α螺旋结构的偶极性之间呈强烈相关[62]。
在此仅以Margalit的最优演段法加以说明：
（1）演段法的理论基础；当序列中的氨基酸随或长或短的周期改变其极性时，即可形成偶极性结构。
（2）限制性；适合于大于11个氨基酸，并小于20个氨基酸的片段。
（3）检测方法；按分离的Fourier转换及正弦曲线的最小平方配合计算能谱，后者将应用到适当的疏水性的序列上；当区域的最大强度接近1000的频率θ出现时，则反映为每一螺旋为3.6个残基的周期性，即偶极性α螺旋结构；对于具有良好周期性的区域进一步确定形成稳定的偶极性结构的可能性；用基础数据训练此程序，建立成为一个偶极片段所应达到的阈值[49]。
Margalit检查了23个已知的抗原表位，其中18个表位用此程序得以确认，敏感性达75%[46]。
Rothbard-Tayler提出T表位的线性结构（motifstructure）的假说，自然他们的演段法与α螺旋结构的演段法不同[44]。
愈来愈多的实验结果表明并非所有的T表位都遵循这些作者提出的规则。
2.2化学合成肽
根据Rothbard-Tayler的T细胞线性表位假说，vanderZee用Pepscan方法合成一批短线性肽，用于确定已知序列的抗原中的T表位[66]。
所谓Pepscan方法，是借助自动程序，少量的肽在活化的、排列成微量滴定板式的聚乙烯条上按已知的氨基酸序列顺序合成[66]。
一般短肽为8-10个氨基酸。
在合成及去保护后，肽任然附着在聚乙烯条上[67]。
再用较缓和的条件将合成的肽从固相上解离，使之与抗原提呈细胞相互作用，在被T细胞识别[67]。
用此方法确定大分子蛋白质一级结构的表位较繁琐的。
2.3肽疫苗的合理应用
合理设计的体外合成或基因重组产生的肽能被机体抗原提呈细胞识别，后者将其提呈给相关的淋巴细胞，诱导机体保护性反应，并在此过程中产生记忆细胞；多重成分组成的疫苗有可能为较大范围人群提供保护[84]。
这些特点表明肽疫苗是符合当今对理想疫苗的要求。
但由于对事物认识的阶段性、局限性，在实践中必将遇到各种问题，如抗原性靶肽在血浆或抗原提呈细胞的表面继续被降解；一般来说抗原性肽的构象介于变性与自然构象之间，如果有保护力的淋巴细胞要求抗原的自然构象，那么合成肽免疫动物的淋巴细胞将不能识别亲本、自然蛋白，而后者用Pepscan方法亦测绘不出B表位；或抗原表位涉及不连续的多肽骨架区域；普通存在的MHC分子限制性；以及编码T细胞受体的多态性等[84]。
2.4口蹄疫化学合成肽苗的保护作用
口蹄疫为主要的动物传染病之一,病毒侵袭反刍动物和猪，易于传播，儿乎遍及世界各地[83]。
预防此病的疫苗为灭活疫苗，在幼地鼠等组织培养上制备。
虽然疫苗有一定预防效果，也存有缺点，热稳定性不好,尤其热带地方使用受限制；在欧洲由于疫苗灭活不当而造成该病流行[83]。
有些学者借助基因工程的技术试图利用大肠杆菌生产多肽疫苗，但表达蛋白的活性很低，还存在不少困难。
作者们致力于化学合成肽来免疫,发现有一定保护作用[82]。
口蹄疫病毒属小核糖核酸病毒科（picornaviridae）的口疮病毒属（aphthovirusgenus）,含有一分子的感染性单链RNA，分子量2.6×106，有4个多肽（VP1~VP4）。
已知VP1具有免疫活性[82]。
目前借助重组DNA技术，口蹄疫病毒A型2个株和O型的1个株的核苷酸序列已搞清楚，并证明免疫活性部位在VP1分子羧基端的一半[83]。
于是,作者合成了个肽,相似于VP1氨基酸序列氨基末端1~41的肽有四个片段,羧基未端200~213的一个片段,近分子中间部分的二个片段（141~160和151~160）[84]。
将这些肽结合到血兰蛋白上免疫家兔,结是仅中间部位的片段（141~160）和羧基末端肽（200~213）可以引起家兔产生抗体反应,这种抗体可中和同源病毒,对异型病毒有低的交叉反应。
接种合成肽所得抗血清的型特异性和接种完整病毒相仿[83]。
将合成肽和等量弗氏完全佐剂或氢氧化铅凝胶混合,皮下接种给豚鼠（20或200ug）。
另设接种1或10ug提纯的灭活病毒颗粒为对照。
35天后,一方面取血清中和抗体,同时于爪心接种104ID50的同源病毒进行攻击。
结果证明,肽141~160诱导产生的中和抗体可保护动物免受攻击感染。
300ug时可提供完全保护,既使20ug也有一定保护作用。
中和抗体水平与对病毒攻击的保护能力呈正相关[83]。
在试验中指出,一次接种合成肽141~160可引起充分的中和抗体以保护豚鼠对抗后来用口蹄疫病毒的攻击[82]。
由肽引致的中和抗体滴度比用病毒衣壳蛋白VP1免疫大儿个级数,不论这种衣壳蛋白是由病毒颗粒裂解产生或是由大肠杆菌表达[83]。
引起这种差异的原因可能是由合成肽引起的抗体比VP1更接近于病毒颗粒引起的相关质量,有可能分离的VP1由于有其它衣壳蛋白提供的骨架影响其不能适当的折叠,结果对免疫系统所存在的免疫优势部位不能充分显露出来。
相反,小的游离肽可能符合于病毒颗粒所能显露的结构特征。
这些就构成了合成肽苗进一步研究的意义[84]。
2.5FMDV多肽疫苗
自80年代初开始，许多科学家在探索应用基因工程技术手段，研制新颖疫苗来预防FMD。
1982年，Bittle等证实FMDVVP1中141~160位肽段（20肽）和200~213位肽段（14肽）是主要的免疫活性肽。
Broekhuigsen、Morgan等对FMDV生物合成多肽苗的免疫原作出估价[84]。
尤永进、郑兆鑫、盛祖恬于80年代中期开始，首先完成了“O”型FMDVVP
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