ELISA技术在马铃薯病毒检测中的应用本科生毕业论文设计.docx
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ELISA技术在马铃薯病毒检测中的应用本科生毕业论文设计
本科生毕业论文（设计）
ELISA技术在马铃薯病毒检测中的应用
学部食品与环境工程学部
专业食品科学与工程
姓名
学号
班级
指导教师
答辩日期
毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明
原创性声明
本人郑重承诺：
所呈交的毕业设计（论文），是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。
尽我所知，除文中特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。
对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。
作者签名：
日 期：
指导教师签名：
日 期：
使用授权说明
本人完全了解大学关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定，即：
按照学校要求提交毕业设计（论文）的印刷本和电子版本；学校有权保存毕业设计（论文）的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。
作者签名：
日 期：
学位论文原创性声明
本人郑重声明：
所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。
除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。
对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。
本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。
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日期：
年月日
学位论文版权使用授权书
本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。
本人授权 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。
涉密论文按学校规定处理。
作者签名：
日期：
年月日
导师签名：
日期：
年月日
注意事项
1.设计（论文）的内容包括：
1）封面（按教务处制定的标准封面格式制作）
2）原创性声明
3）中文摘要（300字左右）、关键词
4）外文摘要、关键词
5）目次页（附件不统一编入）
6）论文主体部分：
引言（或绪论）、正文、结论
7）参考文献
8）致谢
9）附录（对论文支持必要时）
2.论文字数要求：
理工类设计（论文）正文字数不少于1万字（不包括图纸、程序清单等），文科类论文正文字数不少于1.2万字。
3.附件包括：
任务书、开题报告、外文译文、译文原文（复印件）。
4.文字、图表要求：
1）文字通顺，语言流畅，书写字迹工整，打印字体及大小符合要求，无错别字，不准请他人代写
2）工程设计类题目的图纸，要求部分用尺规绘制，部分用计算机绘制，所有图纸应符合国家技术标准规范。
图表整洁，布局合理，文字注释必须使用工程字书写，不准用徒手画
3）毕业论文须用A4单面打印，论文50页以上的双面打印
4）图表应绘制于无格子的页面上
5）软件工程类课题应有程序清单，并提供电子文档
5.装订顺序
1）设计（论文）
2）附件：
按照任务书、开题报告、外文译文、译文原文（复印件）次序装订
指导教师评阅书
指导教师评价：
一、撰写（设计）过程
1、学生在论文（设计）过程中的治学态度、工作精神
□优□良□中□及格□不及格
2、学生掌握专业知识、技能的扎实程度
□优□良□中□及格□不及格
3、学生综合运用所学知识和专业技能分析和解决问题的能力
□优□良□中□及格□不及格
4、研究方法的科学性；技术线路的可行性；设计方案的合理性
□优□良□中□及格□不及格
5、完成毕业论文（设计）期间的出勤情况
□优□良□中□及格□不及格
二、论文（设计）质量
1、论文（设计）的整体结构是否符合撰写规范？
□优□良□中□及格□不及格
2、是否完成指定的论文（设计）任务（包括装订及附件）？
□优□良□中□及格□不及格
三、论文（设计）水平
1、论文（设计）的理论意义或对解决实际问题的指导意义
□优□良□中□及格□不及格
2、论文的观念是否有新意？
设计是否有创意？
□优□良□中□及格□不及格
3、论文（设计说明书）所体现的整体水平
□优□良□中□及格□不及格
建议成绩：
□优□良□中□及格□不及格
（在所选等级前的□内画“√”）
指导教师：
（签名）单位：
（盖章）
年月日
评阅教师评阅书
评阅教师评价：
一、论文（设计）质量
1、论文（设计）的整体结构是否符合撰写规范？
□优□良□中□及格□不及格
2、是否完成指定的论文（设计）任务（包括装订及附件）？
□优□良□中□及格□不及格
二、论文（设计）水平
1、论文（设计）的理论意义或对解决实际问题的指导意义
□优□良□中□及格□不及格
2、论文的观念是否有新意？
设计是否有创意？
□优□良□中□及格□不及格
3、论文（设计说明书）所体现的整体水平
□优□良□中□及格□不及格
建议成绩：
□优□良□中□及格□不及格
（在所选等级前的□内画“√”）
评阅教师：
（签名）单位：
（盖章）
年月日
教研室（或答辩小组）及教学系意见
教研室（或答辩小组）评价：
一、答辩过程
1、毕业论文（设计）的基本要点和见解的叙述情况
□优□良□中□及格□不及格
2、对答辩问题的反应、理解、表达情况
□优□良□中□及格□不及格
3、学生答辩过程中的精神状态
□优□良□中□及格□不及格
二、论文（设计）质量
1、论文（设计）的整体结构是否符合撰写规范？
□优□良□中□及格□不及格
2、是否完成指定的论文（设计）任务（包括装订及附件）？
□优□良□中□及格□不及格
三、论文（设计）水平
1、论文（设计）的理论意义或对解决实际问题的指导意义
□优□良□中□及格□不及格
2、论文的观念是否有新意？
设计是否有创意？
□优□良□中□及格□不及格
3、论文（设计说明书）所体现的整体水平
□优□良□中□及格□不及格
评定成绩：
□优□良□中□及格□不及格
教研室主任（或答辩小组组长）：
（签名）
年月日
教学系意见：
系主任：
（签名）
年月日
ELISA技术在马铃薯病毒检测中的应用
摘要
随着科学技术的不断发展，马铃薯病毒检测技术在日益的完善，DAS-ELISA法已经成为马铃薯病毒检测的常规方法。
容易侵染马铃薯的病毒类型主要有六种，分别是马铃薯的PVX，PVY，PLRV，PVS，PVM，PVA病毒。
马铃薯在生长的过程中，因受到各种不同病害的侵染，容易造成减产和退化。
血清学技术是病毒检测的主要手段，免疫家兔制备血清，并提取免疫球蛋白（IgG）作为反应的抗体，应用血清学技术检测马铃薯病毒是基于抗原（病毒颗粒）与其特异性抗体在离体条件下产生专一性反应的原理。
检测结果表明：
双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）是最为灵敏的血清学技术之一，检测马铃薯病毒具有操作简单，适用性强，准确性好，直观等优点；硝酸纤维素膜酶联免疫吸附法（NCM-ELISA）法具有造价低，反应特异性强，灵敏度较高等优点，很适合于小型企业做病毒检测工作。
关键词：
马铃薯病毒；血清学技术；双抗体夹心酶联免疫吸附法
ELISAtechnologyappliedinpotatovirusdetection
Abstract
Withtheincreasingdevelopmentofscienceandtechnology,themethodofpotatovirusdetectonhasbeenimprovedalot.DAS-ELISAmethodhasalreadybecomeregularandcommon.ThosevirusthatcaneasilyinfectpotatosincludepotatovirusPVX，PVY，PLRV，PVS，PVM，PVA.Thus,duringthelongtermgrowingperiodofpotatos,theyareeasytocatchvariousdeseases,andgraduallydecreasetheproductionandcausedegradation.
Serologicmethodisamainwaytodetectpotatoviruses.Wecanmakerabbitimmunetothatkindofvirusandpreparetheserumandthenextrctimmunoglobulin（IgG）astheantibody.Wecanputthatintopracticebecausethepotatovirusescanonlyworkonthebasisofsinglereactionbetweentheantigen（alsocalledvirusparticles）andtheirspecificantibodies.
TheexpeimentsshowthatDoubleAntibodySandwichElisa（DAS-ELISA）isoneofthemostsensitiveserologytechnology,whichhaslotsofadvantagessuchaseasytooperate,greatadaptablity,perfectaccuracy,directviewingandsoon.Besides,NCM-ELISAneedslowprice,buthasstrongreactingspecificityandhighsensitivity.Verysuitableforsmallbusinessestodotheworkofvirusdetection.
Keywords:
potatovirus;Serologicaltechniques;DoubleAntibodySandwichEnzyme-linkedImmunosorbentAssay.
2.1.1仪器11
致谢26
第1章绪论
1.1马铃薯的定义及分类
1.1.1马铃薯的定义
马铃薯（Solanumtuberosum）为茄科茄属一年生草本块茎植物,别名土豆、洋芋、山药蛋等。
块茎可供食用，是最重要的粮食作物之一、蔬菜兼用作物，素有“地下苹果”之称[1]。
1.1.2马铃薯的分类
1.1.2.1按生育期长短可分为
早熟种（100天以内）、中熟种（100－120天）、晚熟种（130天以上）。
1.1.2.2按季节栽培可分为
南方：
春薯和秋薯
春薯在1－2月播种，5月下旬至6月收获。
秋薯在8－9月播种，11月下旬至12月上旬收获。
北方：
5月份播种，9月份收获。
1.1.2.3按种薯品种可分为
中薯3号、中薯5号、克新1号、克新13号、克新18号、荷兰15号、尤金885、大西洋、早大白、黄麻子等。
1.2马铃薯病毒
1.2.1病毒的成分与结构
1.2.1.1病毒的成分
病毒大部分是由蛋白质和核酸组成的，核酸是一个带交替糖基（alternatingsugar）的长链。
大部分病毒的核酸是单链RNA,而有些病毒含双链RNA，如水稻矮缩病毒或三叶草伤瘤病毒。
具有侵染性的核酸通常称作基因组，核酸携带有病毒复制所必须的遗传信息，病毒核酸携带完成病毒功能所需的全部信息，核酸的特定区域履行着特殊的功能被包裹在蛋白质的外壳内。
1.2.1.2植物病毒的成分
所有的植物病毒粒子是指完整的、具有侵染力的病毒。
其中蛋白质的成分最为丰富，除含脂类的病毒以外，蛋白质实际上代表了其整个病毒粒子的质量。
最容易研究的病毒蛋白质是形成其外壳的蛋白质（即外壳蛋白，coatprotein）
1.2.1.3病毒的结构
病毒的基本结构是核蛋白。
内部是作为遗传物质的核酸，外面是起保护作用的蛋白质外壳。
病毒的外壳蛋白由核酸所编码，病毒的基因组虽然比较小，但仍携带了生命的基本信息。
马铃薯病毒的基本形态可以分为几种类型：
轴状、杆状、线状、弹状、双联体、细丝状、杆菌状等。
下表列出了一些病毒的颗粒大小、传播方式、和地理位置。
表1-1马铃薯病毒的结够特征
病毒属或科
病毒成员
颗粒大小（nm）
自然传播方式
地理分布
烟草脆裂病毒属
TRV
190×22，45×22
线虫
欧洲、美国
毛病毒属
PVT
640×10
机械、种子
安第斯
黄症病毒属
PLRV,BYDV
25（直径）
蚜虫
世界范围
联体病毒科
BCTV,PYMA
SALCV
17（成对的）
17（三联体）
叶蝉
未知
南美洲
秘鲁
1.2.2病毒对马铃薯的影响
1.2.2.1产量的影响
马铃薯病毒对马铃薯的产量有很大的影响,能够侵染很多种不同的作物，遗传范围非常广泛，能够侵染马铃薯、烟草、辣椒、西红柿等，严重者可导致品种退化甚至绝产。
有病毒病引起的数量损失最为严重，产生严重茎叶症状的马铃薯病毒所引起的产量损失要比症状轻微或侵染后不产生症状的马铃薯病毒所引起的产量损失要高得多。
植物病毒为专性寄生物，只能在其寄主的活细胞内复制，马铃薯为营养体繁殖，病毒在寄主体内随继代繁殖而逐渐积累，导致马铃薯种性退化，最后导致产量严重降低。
1.2.2.2块状大小、形状、口感的影响
感染病毒的马铃薯会影响到马铃薯的商品性。
研究病毒病引起的损失在确定该病毒危害的经济显著性方面是很有必要的。
品质损失（对块状的加工或销售的品质）对于马铃薯而言，马铃薯病毒对马铃薯生产的影响与马铃薯病毒的种类、环境条件有关。
而抗病毒品种感染马铃薯病毒后对马铃薯质量和产量影响都很小。
实际中马铃薯生产田中受两种以上病毒复合侵染的现象非常普遍，是马铃薯植株病毒病害症状更为复杂，不同病毒和病毒不同株系的复合侵染对马铃薯生产的质量和产量影响也较复杂。
1.2.2.3马铃薯病毒的类型
俗称马铃薯退化类型，有PVX，PVY，PLRV，PVS，PVM，PVA。
其致病毒源复杂。
由于品种抗病性不同，或者因温度条件等的影响，有时马铃薯病症相似，但其病原不同。
PVS，PVM，PVA的病原虽较单纯，但常与花叶型的病毒复合侵染，呈综合症状。
其中矮生型病株，除某种病原的特定症状外，有时一些抗病弱的马铃薯品种，如果被多种病原侵染，发病严重，导致植株生育停滞，从而造成植株矮缩现象。
1.2.3马铃薯病毒的传播方式、分布及其防治
1.2.3.1传播方式
要成功地传播具有寄生特性的植物病毒，需要其他介体将他们从感病的细胞传到健康植株的细胞中去。
其传播方式大体分为五种
（1）植株之间的接触传播
当感病植株伤口流出的汁液侵染健康植株的伤口时才会发生这种类型的传播，要使这种类型的传播起作用，病毒应达到一定的浓度而且寄主植物易受侵染。
（2）机械传播
即植株间的接触传播。
侵染性病毒作为侵染源先沾染某物，后者再与健康植株接触而传播病毒，当手触摸过带毒植株后可以机械的传播病毒或偶尔也会通过沾染病毒的衣服摩擦植株而机械传播病毒。
当动物在田间行走时也会以同样的方式传播病毒。
然而在田间最重要的是农用机具和田间作业。
（3）嫁接传播
在自然的条件下，这种传播方式很少发生，马铃薯卷叶病毒可通过此方法传毒。
（4）介体传播
昆虫、线虫和真菌均是马铃薯的传播媒介，由于昆虫的数量居多，所以是主要的媒介，其中蚜虫最为主要[2]。
（5）线虫传播
线虫作为病毒传播媒体在马铃薯上并不常见。
1.2.3.2分布
（1）马铃薯的Y病毒（PVY）
这种病毒属于马铃薯的Y病毒科属（potyvirus）。
病毒粒子是弯曲的螺旋结构纤丝，约750nm长，11~12nm宽。
目前在世界范围内以鉴定出三种主要株系。
PVYO代表普通的种类，初期感染造成程度不同的叶片枯斑和脉缩，次生感染造成严重的皱缩和花叶。
PVYN称为坏死的株系，因为它造成烟草的叶脉坏死，而马铃薯的主要症状是花叶并伴有一定程度的皱缩，敏感栽培种有坏死的现象。
PVYC造成茎条斑和大多数栽培种的坏死。
此株系的病毒进来较少在马铃薯上发现。
PVY病毒寄主范围广泛但大多数寄主属于茄科。
主要由蚜虫以非持久性方式进行传播[3]，由于其传播途径较复杂，因而在国外马铃薯产区广泛传播，
并且造成敏感栽培品种减产可达80%，与其他病毒尤其是PVX协同作用是，造成更加严重的病害称为皱花叶病，减产可达50~80%[4]。
（2）马铃薯的卷叶病毒（PLRV）
PLRV被认为是马铃薯中最重要的病毒。
他是黄症病毒属的成员，具有六角形的等轴外形，直径为26nm。
主要经过桃蚜传播。
PLRV寄主范围较窄，敏感性寄主主要是属于茄科。
大多数栽培品种中PLRV使初期感病植株卷曲并且顶端褪绿，使次生植株感病矮化，并且基部叶片卷曲，顶部的叶片黄花并且显紫色，极度敏感品种的块茎内部有坏死斑，通常呈网状。
因栽培种对PLRV的敏感性而造成的减产可达90%。
这种病毒几乎发生在所有马铃薯种植区域，然而，在高温气候地区（印度平原和北非）PLRV并没有那么严重。
（3）马铃薯的X病毒（PVX）
马铃薯的X病毒，又名马铃薯的普通花叶病，是发现最早，传播最广的一种马铃薯病毒，症状表现出轻微的斑驳至严重的皱缩花叶，引起植株矮化，叶片缩小。
病原为马铃薯的X病毒，是弯曲的线条状病毒[3]。
这种病毒属于马铃薯的X病毒属，由弯曲的纤细螺旋构成特征性的病毒粒子，约515nm长，13nm宽。
PVX在自然界中主要靠接触传播。
PVX在世界范围内分布于马铃薯和其他的茄科寄主中。
除非和其他病毒（尤其是PVY）协同作用，否则PVX并不造成严重减产。
单纯有PVX引起的减产在10~30%。
（4）马铃薯的S病毒和M病毒（PVS和PVM）
PVS和PVM是香石竹病毒的成员，具有特征性的螺旋结构，病毒粒子纤维状，稍有弯曲，650nm长，12~13nm宽。
PVS在马铃薯上的症状很难辨别。
严重的病毒株系感染敏感的栽培品种可观察到叶片发青铜色、叶脉轻微下陷。
PVM的症状多样，从完全潜伏到严重的皱缩和花叶都存在。
某株系感染会出现顶部叶片轻微卷曲。
PVS和PVM都能以非持久性方式接触传播或蚜传，他们的寄主范围较狭窄。
PVM主要发生在某些气候温和的地区，例如东欧。
有PVS和PVM造成的减产通常不超过20%
1.2.3.3防治
常见的防止方法有以下几种[5]
（1）种属生产，拔杂去劣
在作物播种前，播种时或接种后，淘汰不好的植株或植株材料。
（2）通过热处理和组织培养脱除病毒
通过热处理和组织培养脱除病毒生产无病母株，目前在马铃薯生产上已广泛应用，解决了马铃薯品种退化的问题。
（3）实生种子生产种植材料
实生种子几乎不带病虫害，易于长时间储藏，成本低，几乎不传播病毒，易于检测，实生种子的使用越来越受重视。
（4）种薯病毒的检测
根据马铃薯生产中允许带病毒指标，通过检测判断种薯质量，并依据检测结果对种薯做适当的处理。
（5）抗病毒育种
利用野生种或原始栽培种抗性材料培育抗病毒品种。
将外源核酸导入植物细胞并从转化细胞中再生植株培育抗病毒植物。
（6）隔离防止病毒
种薯繁育过程中病毒传播可通过隔离条件来控制。
植物检疫防止病毒进入某一国家或地区。
1.3西南地区与东北地区马铃薯主要病毒发生比较
1.3.1西南、东北地区马铃薯发生频率
1.3.1.1西南地区马铃薯的发生频率
从田间检验地块中取回具有典型马铃薯病毒症状的或疑似病毒样品（样品来自于原种田、良种田和商品薯田：
其中南方样品来自于广东、贵州和云南，共124份）。
表1-2西南马铃薯生产田病毒检测结果
地点
样品量（个）
PVX
PVY
PVS
PLRV
复合侵染
广东
10
7
3
1
5
6
贵州
54
30
11
8
1
10
云南
60
4
10
16
4
5
合计
124
41
24
25
10
21
1.3.1.2东北地区马铃薯的发生频率
从田间检验地块中取回具有典型马铃薯病毒症状的或疑似病毒样品（样品来自于原种田、良种田和商品薯田:
北方样品主要来自于黑龙江、吉林和辽宁，共356份）。
表1-3东北马铃薯生产田病毒检测结果
地点
样品量（个）
PVX
PVY
PVS
PLRV
complexinfection
黑龙江
283
17
114
64
39
80
吉林
17
1
9
1
2
1
辽宁
17
0
14
0
1
0
内蒙古
39
0
31
7
1
4
合计
18
72
43
1.3.2西南地区与东北地区马铃薯病毒发生频率的比较
表1-4西南与东北马铃薯生产田病毒发生数据比较
病毒种类
地区
PVX
PVY
PVS
PLRV
complexinfection
西南（%）
33.1
19.4
20.2
8.1
16.9
东北（%）
5.1
47.2
20.2
12.1
23.9
图1-1西南、东北马铃薯生产田病毒发生比较
两个地区马铃薯生产田病毒发生情况进行比较，结果见图1，可以看出PVS、PLRV和复合侵染情况两地区基本相近，PVX和PVY差别较大，南方PVX病毒发生率比北方高，而北方PVY病毒发生率比南方高。
1.4国内外马铃薯病毒检测的研究进展
马铃薯是世界上第四重要的作物。
在它被引入欧洲不久，1570年的某个时期，马铃薯开始退化，最初在英格兰观察到马铃薯退化病，并认为这是影响马铃薯栽培的主要因素[6]。
1775年以前它使英格兰部分地区的马铃薯间断生长。
1913年美国的Orton确认了病毒是导致退化的主要原因[7]。
从那以后在荷兰和英格兰人们主要致力于研究花叶病、条斑病和卷叶病。
PLRV、PVY和PVX这几种病毒的体征最先被描述出来，它们是马铃薯作物上常见的病毒，20世纪早期农民们意识到需要生产健康的种薯以减少退化的影响，从此产生了一些农艺措施，并在安全的可以延缓或减少病毒感染的地方种植它们[8]。
1930年以后新出现的种薯产业取得了显著的进步。
病毒检测技术最早依赖于马铃薯表现的症状，后来引进了用指示植物检测PVX和PVY
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