分子生物学讲义13章.docx

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分子生物学讲义13章

《分子生物学》课程讲义

第1章绪论

参考书目：

1、杨荣武等著，《分子生物学》（第一版），南京大学出版社，2007

2、Turneretal.MolecularBiology（ThirdEdition），科学出版社，2009

3、朱玉贤等编，《现代分子生物学》（第3版），高等教育出版社，2007

4、杨荣武，《分子生物学学习指南与习题解析》，高等教育出版社，2010

5、向本琼等编，《分子生物学精要·题解·测试》，化工出版社，2006

一、分子生物学的含义：

广义：

蛋白质及核酸等生物大分子的结构与功能的研究都属于分子生物学的范畴，也就是从分子水平阐明生命现象和生物学规律。

狭义：

分子生物学偏重于核酸的研究，主要研究基因和DNA的结构，DNA的复制、转录，RNA的翻译，基因表达调控的过程，其中也涉及到与这些过程有关的蛋白质和酶的结构与功能。

二、分子生物学的起源和发展：

1、对DNA和遗传信息传递的认识阶段

此阶段大事记：

⏹“细胞学说”（Schleiden&Schwann，1847）

⏹性状遗传规律（Mendel，1865）

⏹首次从鲑鱼精子中分离出DNA（Miescher，1869）

⏹将“性状”与“基因”相偶联（Morgan，1926）

⏹首次分离出腺嘌呤、胸腺嘧啶和组氨酸（Kossel，1910）

⏹证明DNA是遗传物质（Avery，1944）

⏹提出DNA双螺旋结构模型（Watson&crick，1953）

⏹DNA的半保留复制机制（Meselson&Stahl，1958）

⏹发现DNA聚合酶Ⅰ，首次实现试管内细菌细胞DNA的复制（Kornberg，1959）

⏹发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA分子决定了蛋白质分子中的氨基酸序列（Uchoa，1959）

⏹提出三联体密码子（Yanofsky&Brener，1961），破译第一个遗传密码（Nirenberg，1961）；原核基因调节的乳糖操纵子模型（Jacob&Monad，1961）

此阶段特征：

（1）对“遗传物质”的认识贯穿了分子生物学的发展史。

（2）分子生物学的发展经历了“传递遗传学”到“分子遗传学”的发展阶段。

（3）中心法则对分子生物学的发展起了重要推动作用。

（4）DNA双螺旋结构模型的提出是分子生物学诞生的标志。

2、重组DNA技术的建立和发展阶段

此阶段大事记：

⏹DNA连接酶的发现（1967，Gellert）

⏹分离限制性内切酶（Smith，1970）与逆转录酶（Temin，1970）

⏹DNA重组技术的建立（Berg）及基因工程的诞生（CohenandBoyer，1973）

⏹DNA测序技术（Sanger，1977；MaxamandGilbert，1977）

⏹Ti质粒作为植物基因工程的载体（Herrera-Estrella，1983）

⏹PCR技术的发明（Mullis，1985）

重组DNA技术与分子生物学：

Ø重组DNA技术的理论基础是分子生物学

Ø重组DNA技术是基因工程的核心技术

Ø使人类对基因的研究进入反向生物学阶段

重组DNA技术简介：

Ø基本概念：

指把来自不同生物的DNA片段同具有自主复制能力的载体DNA在体外进行人工连接，构成新的重组DNA，然后转入受体生物中去扩增或表达。

常被称为基因工程、遗传工程和分子克隆技术。

Ø四大要素：

工具酶；基因；载体；受体细胞

Ø基本步骤：

（1）获得目的基因；

（2）将目的基因与载体连接，构建重组DNA分子；

（3）用重组DNA分子转化受体细胞；

（4）对转化子进行筛选和鉴定；

（5）将转化子进行发酵、培养、养殖或栽培，获得所需要的性状或产物。

3、分子生物学迅猛发展阶段

此阶段大事记：

⏹人类基因组计划（HGP）全面启动（1990）

⏹美国批准第一个体细胞基因治疗方案（1990）

⏹第一个真核生物染色体（酵母3号染色体）测序完成（1992）

⏹第一个细菌全基因组测序（1995）

⏹克隆羊“多莉”诞生（Wilmut，1997）

⏹RNAi的发现（AndrewandCraig，1998）（2006年度诺贝尔生理学或医学奖）

⏹胚胎干细胞的建立（ThomsonandGearhart，1998）

⏹赛莱拉公司宣布果蝇基因组测序完成（2000）

⏹第一个酵母蛋白质组芯片问世（美国，2001）

⏹中国发表水稻全基因组框架序列图（2002）

⏹2003年4月14日美国宣布人类基因组序列图绘制成功

2007年度诺贝尔生理学奖和医学奖：

美国，马里奥•卡佩奇，奥利弗•史密西斯；英国马丁•埃文斯

基因靶向技术——基因敲除（Knockout）、基因替换（Knockin）对特定基因进行定点改造的技术。

2008年度诺贝尔化学奖

华裔生物化学家钱永健，美国生物学家马丁·查尔菲和日本有机化学家兼海洋生物学家下村修

发现和改造绿色荧光蛋白（GFP），带来了分子细胞生物的革命。

2008年度诺贝尔生理或医学奖

德国人哈拉尔德·楚尔·豪森发现导致宫颈癌的人乳头状瘤病毒（HPV），法国人弗朗索瓦丝·巴尔－西诺西和吕克·蒙塔尼发现艾滋病病毒。

2009年度诺贝尔化学奖

拉曼-莱马克里斯南（英），托马斯-施泰茨（美），阿达·尤纳斯（以）。

三位科学家构筑核糖体原子水平的三维模型（结晶、X射线衍射），核糖体是抗生素的重要靶标。

2009年度诺贝尔生理或医学奖

伊丽莎白-布莱克本，卡萝尔-格雷德，杰克-绍斯塔克。

三名美国科学家发现了端粒酶并揭示染色体DNA末端复制的机制。

三、分子生物学研究的内容

1、DNA重组技术

2、基因表达调控研究

3、生物大分子的结构功能研究

4、基因组、结构基因组与生物信息学研究

四、分子生物学与其他生命科学的联系

分子生物学是由生物化学、生物物理学、遗传学、微生物学、细胞学、以至信息科学等多学科相互渗透、综合融会而产生并发展起来的，已形成它独特的理论体系和研究手段，成为一个独立的学科。

五、分子生物学的应用及展望

习题：

分子生物学的含义，包括那些研究内容？

列举分子生物学发展史上具有重大意义的发现（三个以上）。

试述分子生物学的发展趋势。

第2章遗传物质的分子本质

遗传物质的分子本质探讨：

1、DNA作为遗传物质三大实验证据：

肺炎球菌转化实验；噬菌体侵染实验；真核细胞获得新的表型。

2、RNA作为遗传物质实验证据：

烟草花叶病毒的重建实验

3、具有遗传特性的蛋白质朊病毒：

朊病毒蛋白两种构象正常型PrPc和传染型PrPsc，在一级结构上相似而二级结构上有巨大差别（PrPc仅含3％的β折叠，而PrPsc含43％的β折叠），PrPsc可以促使PrPc转化为PrPsc。

PrPsc与正常型相比，结构特殊，无法被细胞内溶酶体中的蛋白酶分解而大量积累，最终涨破溶酶体，流出的蛋白水解酶对周围的神经细胞造成破坏，产生海绵状空洞。

朊病毒所致病害也称分子构象病。

核酸的种类和化学组成：

DNA：

磷酸、含氮碱、脱氧核糖；

RNA：

磷酸、含氮碱、核糖。

碱基和核糖通过糖苷键形成核苷（nucleoside）

核苷与磷酸通过磷酸酯键形成核苷酸（nucleotide）

核苷酸之间以磷酸二酯键形成多核苷酸链，即核酸（nucleicacid）

第一节DNA的分子结构

一、DNA的一级结构

Chargaff定则：

DNA的碱基组成具有种属特异性。

不对称比率：

（A+T）/（C+G）

所有DAN中：

A=T；G=C；A+G=C+T

一级结构的书写：

左边的是5’磷酸基，右边的是3’羟基。

如pTpApCpG

二、DNA的双螺旋结构

1、提出背景：

（1）查加夫对碱基含量测定的结果：

A=T，C=G；

（2）威尔金斯和富兰克林的DNA晶体X射线衍射结果；

（3）碱基的理化数据分析表明A与T、G与C间氢键配对较合理。

（4）电位滴定行为，DNA的磷酸基团可以滴定，而嘌呤和嘧啶的可解离基团却不能滴定。

2、1953年，Watson&crick提出DNA双螺旋结构。

其基本内容是：

（1）反平行，共同的轴右手螺旋;

（2）外侧：

戊糖、磷酸；

内侧：

碱基，碱基平面与轴垂直，糖平面与碱基平面几乎成直角；

（3）互补配对，互补链；

（4）直径2nm，0.34nm，10碱基上升一个螺旋，3.4nm；

（5）两凹槽，大沟，小沟。

大沟：

1.2nm×0.85nm；小沟：

0.6nm×0.75nm

3、稳定DNA双螺旋结构的作用力

氢键；碱基堆积力（疏水作用和范德华力）；磷酸基团的静电排斥力；碱基分子内能

4、双螺旋结构的提出具有重要的生物学意义：

DNA双螺旋结构的提出在分子生物学的发展史上具有划时代的意义，第一次用精密的化学结构语言解释了遗传信息的存储方式；为揭示DNA复制的机制提供了理论基础，对生物遗传的稳定性和变异性的规律等的阐明起了重要的作用；是分子生物学诞生的标志。

三、DNA二级结构的多态性

（1）B型DNA：

右手螺旋，10bp/螺圈，0.34nm/bp；高湿度（92％）；大沟宽略深；天然DNA构象。

（2）A型DNA：

右手螺旋，11bp/螺圈；湿度低于75％；小沟宽而浅；RNA双链及DNA-RNA杂交链常为A型。

（3）Z型DNA：

左手螺旋，12bp/螺圈，0.35nm/bp；CG交替或CA交替；只有小沟，遗传信息暴露。

Z型DNA的存在对基因的转录调控具有重要的意义：

①转录活化时，Z型DNA转变成B型DNA；②Z型DNA可以改变负超螺旋的水平，调控转录起始过程。

（4）三链DNA：

也称H-DNA，同型嘧啶和同型嘌蛉的两股链，低pH下能形成三链，胞嘧啶先与H＋结合（质子化）才能与鸟嘌呤配对，这就是H-DNA的由来。

在基因的调节区和染色体的重组热点区容易形成三链DNA。

（5）四链DNA：

富含G的序列容易形成四链结构。

如端粒的结构。

探讨DNA的多型性的生物学意义：

对于DNA的复制和转录中DNA的解链很重要；不同构象DNA的沟的特征不同，与基因表达调控有关。

四、DNA的三级结构

1、原核生物DNA的三级结构——DNA超螺旋

DNA双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋，它实际是DNA分子能量的一种储存方式，包括正超螺旋和负超螺旋。

正超螺旋：

盘绕方向与DNA双螺旋方向相同。

两条链不断开的情况下，双螺旋进一步解开，则会形成正超螺旋。

负超螺旋：

盘绕方向与DNA双螺旋方向相反，易于解链，一旦超螺旋解开，则会形成解链环形DNA。

自然条件下的共价闭合环状DNA呈负超螺旋。

描述DNA超螺旋变化的公式：

L=T+W

连接数（L，linkingnumber）：

两条链交叉的次数。

扭转数（T，twistingnumber）：

Watson-Crick螺旋数。

缠绕数（W，writhingnumber）：

超螺旋数。

超螺旋密度：

λ＝（L-L0）/L0

拓扑异构体（topisomer）：

一级结构相同L值不同的环状DNA。

2、真核生物DNA的三级结构——核小体

核小体（Nucleosome）：

是构成染色体的重复单位，由200bp的DNA缠绕在组蛋白八聚体（H2A、H2B、H3、H4各2分子）上而形成。

核小体上200bpDNA详细结构解析为，缠绕DNA165bp（其中145bp绕八聚体1.8圈，H1占据20bp）＋连接DNA35bp

组蛋白特性：

分子质量小；保守性强（但H1变异性较强，有时被H5替代）；带有大量正电荷（含大量精氨酸和赖氨酸）；具有共价修饰现象（乙酰化、甲基化、磷酸化），组蛋白乙酰化可激活转录。

第三节RNA的分子结构与功能

一、RNA二级结构和三级结构

RNA分子常以单链形式存在，近似球形；与DNA相比，构型具多样性，与其功能的多样性相适应。

RNA二级结构以单链为主，形成局部双螺旋，存在GU配对。

RNA三级结构为假节结构

二、其他小分子RNA及RNA组学

（1）小RNA类型

miRNA（microRNA），一般为小RNA的总称；

snRNA（smallnuclearRNA），小核RNA，参与mRNA前体中内含子的剪接；

snoRNA（smallnucleolarRNA），小核仁RNA，参与rRNA的甲基化和假尿苷酸化修饰；

scRNA（smallcytoplasticRNA），小细胞质RNA，位于细胞质中的小RNA的总称；

siRNA（smallinterferingRNA），小干扰RNA，参与RNA干扰，引起靶mRNA的降解；

piRNA：

与Piwi蛋白结合的小RNA，2006年新发现的一类小RNA，参与小鼠睾丸发育，其作用机理与siRNA类似，但来源有差别；

asRNA（antisenseRNA），反义RNA，与mRNA互补的单链RNA分子；

tmRNA，tRNA与mRNA的杂合RNA，参与原核生物缺失终止密码子的mRNA的补救合成过程。

（2）RNA组学：

研究细胞中snmRNAs的种类、结构和功能。

同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时间、不同状态下snmRNAs的表达具有时间和空间特异性。

（3）RNA生物学功能的多样性

1、在遗传信息的传递中起决定性作用；

2、具催化功能的核酶；

3、参与mRNA和rRNA前体的加工，如snRNA、snoRNA；

4、参与基因表达调控，如asRNA、siRNA、piRNA；

反义RNA（asRNA，antisenseRNA，micRNA，mRNA-interferingcomplementaryRNA，与特定RNA互补的RNA）它能够抑制或封闭基因的表达。

RNAi（RNAinterference）：

利用小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）使细胞内同源基因的特异性沉默（silencing）的技术。

5、生物进化中起重要作用。

RNA的可变剪接增加遗传信息的多样性，促进生物进化；逆转座子促进基因组的流动性。

三、核酶（ribozyme）

概念：

指具有催化功能的RNA分子。

20世纪80年代，Cech首先发现。

两种类型：

剪接型：

Ⅰ型内含子、Ⅱ型内含子；剪切型：

M1-RNA、L-19。

结构：

Symous提出“锤头结构”模型（至少含3个茎，1～3个环，13个保守性核苷酸）。

第三节核酸的变性、复性与分子杂交

一、核酸的光谱学特性及应用

OD260的应用：

1、核酸定量

50μg/ml浓度下的OD260：

dsDNA＝1.0；ssDNA、ssRNA＝1.37；游离碱基、核苷酸＝1.60

2、判断核酸样品的纯度：

DNA纯品：

OD260/OD280=1.8；RNA纯品：

OD260/OD280=2.0

3、跟踪DNA变性与复性过程

二、核酸的变性

定义：

在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。

特点：

双螺旋破坏；碱基间的氢键断裂；共价键并未断裂（否则称降解）。

其他理化性质的变化：

OD260增高（增色效应）；沉降速度增加；黏度下降；浮力密度升高；生物活性丧失。

变性方法：

加热（用于PCR）；过量酸、碱（用于分子杂交）；尿素、甲酰胺、甲醛等变性试剂（用于DNA、RNA变性电泳）。

解链温度（meltingtemperature，Tm）：

光吸收值达到最大值的一半时的温度（双螺旋结构解开一半时的温度）。

经验公式：

Tm＝69.3＋0.41×（G+C）％

三、核酸的复性

定义：

变性的两条DNA链在适当条件下重新缔合成为双螺旋结构的过程。

特点：

缓慢，随机，可逆的过程。

其他理化性质的变化：

OD260降低（减色效应）；沉降速度降低；黏度增高；浮力密度下降；生物活性恢复。

影响因素：

DNA复杂性；片段大小；温度；阳离子浓度

DNA复性动力学：

复性动力学实验：

基因组片段化；加热后，复性；复性比例（1－C/C0）对C0t作图

复性程度的检测：

羟基磷灰石吸附双链DNA

复性动力学研究意义：

根据复性动力学结果可以粗略估计基因组的大小及单拷贝基因和重复DNA的量。

四、核酸的分子杂交

见第11章

第四节DNA的序列分析

1977年Sanger提出了DNA的双脱氧链终止测序法，同年Maxam和Gilbert提出了DNA的化学修饰测序法。

一、化学法（Maxam-Gilbert法）

（1）要点：

碱基通过特定化学试剂（硫酸二甲酯、肼、甲酸）修饰后，哌啶甲酸使该位置的磷酸二酯键断裂。

（2）化学试剂修饰类型：

G反应：

硫酸二甲酯G上的N7甲基化

A＋G反应：

甲酸使A和G嘌呤环上的N质子化

C＋T反应：

肼使T和C的嘧啶环断裂后重新环化成五元环

C反应：

盐存在的条件下，肼只与C反应

（3）化学法测序基本步骤：

①取代DNA一端进行标记（5’端用32P标记）。

②样品分成4份，分别与专一性试剂作用，分别发应生成一套长短不一的放射性片段。

③电泳分离各反应产物，读出序列。

二、酶法（Sanger法、双脱氧法、末端终止法）

（1）要点：

利用双脱氧核苷酸2‘，3’-ddNTP来终止DNA的聚合反应。

（2）酶法测序步骤：

①取代测样品的一条链为模板，5’端标记的引物互补于模板3’端。

②样品分成4份，分别加入4种脱氧核甘酸和一种双脱氧核甘酸为底物。

DNA聚合酶能够用2‘，3’--双脱氧核苷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3‘-末端，从而终止其延伸反应，分别生成一套长短不一的片段。

③电泳分离各反应产物，读出序列。

化学法和酶法测序的比较：

化学法测定的长度较短（化学法250bp，酶法500bp）

化学法所得结果理论上更精确

化学法可用于研究DNA二级结构以及蛋白质一DNA相互作用

酶法日趋方便

酶法可实现自动化

三、DNA测序自动化

（1）自动荧光标记ddNTP法

Sanger方法的基础上，用4种不同颜色的荧光染料标记4种ddNTP，同时加入dNTP和4种分别标记的ddNTP进行反应。

反应产物在同一个泳道上进行分离。

对结果进行分析。

带有不同染料标记的每一种产物将发出不同波长的光，经检测器检测，然后通过电脑解译。

（2）DNA杂交测序（Sequencingbyhybridization，SBH）

靶DNA与完全随机合成的一段较短的DNA探针混合杂交，根据与靶DNA能完全互补的探针之间的线性关系，可推算出靶DNA的序列。

本章小结：

熟悉碱基的结构；

双螺旋结构模型提出背景、内容、作用力及生物学意义；

B-DNA、A-DNA、Z-DNA结构比较；

超螺旋结构变化规律；

核小体DNA结构解析；

RNA二级结构和三级结构；

miRNA种类及功能；RNAi机制；

名词：

变性、增色效应、Tm、复性、减色效应、Cot1/2

Cot曲线的绘制及应用；

DNA酶法测序原理及自动化测序；

练习题：

1、长度为20μm的DNA分子有多少个碱基对？

含多少匝螺旋？

2、假定大肠杆菌基因的平均分子量是106U，并且所有DNA都用来组成基因，计算大肠杆菌和人（5％为编码序列）各有多少基因？

（脱氧核苷酸dNMP的平均分子量为340U）

3、计算浓度为32μg/mg的DNA溶液的A260值。

4、讨论DNA和RNA结构稳定性的差别。

5、解释自然界DNA选择以负超螺旋的形式存在的原因。

6、正常DNA的超螺旋密度为-0.05，在无拓扑异构酶的条件下复制到密度为0.07时，由于正超螺旋的阻力而不能继续复制，求此时的复制百分数。

7.试述RNA的生物学功能。

8.DNA热变性有何特点？

Tm值表示什么？

9.在pH7.0，0.165mol/LNaCl条件下，测得某一DNA样品的Tm为89.3℃，求出四种碱基百分组成。

10.想弄清一种单细胞真核生物的基因组的构成，请设计出实验：

（1）确定重复DNA的含量和种类；

（2）如何确定某一单一序列DNA的那些部分可被转录成RNA。

11.简述DNA酶法（Sanger法）测序原理。

第3章基因、基因组和基因组学

第一节基因的概念

一、对基因认识的发展

⏹基因是“遗传因子”（孟德尔,1865；Johannsen，1909）

⏹基因是有机的化学实体，在染色体上呈直线排列（Morgan，1926）

⏹“一个基因一个酶”（Beadle，1941）

⏹基因的本质是DNA（Avery，1944）

⏹一个顺反子就是一个基因，是一个遗传功能单位，是编码一条完整多肽链的一段核苷酸序列（Benzer，1955）

⏹基因包括结构基因、调节基因、操纵子和启动子（JacobandMonod，1961）

⏹分子生物学上基因的概念为：

能够表达和产生一条多肽链或者功能RNA的一段DNA序列。

二、基因概念的发展

断裂基因：

DNA分子中基因编码序列常被非编码的序列隔开，这类基因称为断裂基因。

编码序列称为外显子（exon）；非编码序列称为内含子（intron）。

假基因：

与有功能的基因相比，有相似的结构但没有功能。

重叠基因：

具有独立性，但使用部分共同序列的基因称重叠基因或嵌套基因。

三、基因种类和结构

种类：

结构基因、调控基因、RNA基因

结构：

编码区（起始～终止密码子）、非编码区（5’UTR、内含子、3’UTR）

第二节基因组

基因组：

一个物种的单倍体所包含的遗传物质的总和。

基因：

是遗传物质的基本单位，它的产物是蛋白质或功能RNA。

基因座：

基因在染色体上的位置。

一、原核生物染色体基因组

1、原核生物染色体和基因组的特点：

1、单个环状染色体，基因组小；2、结构简练；3、存在转录单元，mRNA以多顺反子形式存在；4、有重叠基因；5、蛋白质基因常以单拷贝的形式存在，而RNA的基因常是多拷贝的。

6、DNA并不和蛋白形成固定的结合物；

2、染色体外基因组——质粒

质粒是细菌染色体外的可以自主复制的双链环状DNA分子。

松弛性质粒：

可独立于宿主染色体的复制而自行繁殖，每个宿主细胞中平均有10～200份拷贝。

严紧型质粒：

随宿主细胞染色体同步复制，每个宿主细胞中只有一份或很少几份拷贝。

质粒常采用碱裂解法制备，溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心进行纯化。

二、真核生物染色体和基因组

1、真核生物染色体和基因组的特点：

1、具有一定数目染色体，基因组复杂；2、具大量不编码蛋白的DNA序列；3、mRNA以单顺反子存在；4、具大量的重复序列（单一、中度和高度重复）；5、有持家基因和奢侈基因之分；6、一般为不连续基因（断裂基因，内元，外元）；7、来源相同、结构相似和功能相关的基因组成基因家族。

2、核外基因组

（1）线粒体基因（mtDNA）组：

①动物中较小，植物中较大。

人的16.5kb；植物在100kb以上。

②双链环状DNA。

③半自主性。

④遗传密码的变异。

UGA（stop）→Trp；AGG（Arg）→stop

（2）叶绿体基因（ctDNA）组：

①基因组较大，高等植物140bp，低等植物200bp。

②双链环状DNA。

③半自主性。

④G＋C较低。

3、真核生物基因组DNA的复杂程度

C-值及C-值悖理：

基因组中DNA的含量称为C-值。

进化上的复杂程度与C-值不一致的现象称为C-值悖理。

Cot1/2：

DNA复性时DNA单链初始浓度与复性一半所经历时间的乘积，表示DNA复杂程度。

4、基因家族

基因家族：

真核细胞中许多相关的基因常按功能成套组合，称为基因