分光光度计的原理与应用.docx

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分光光度计的原理与应用

分光光度计的原理与应用

分光光度计就是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器。

它是现代实验室检测用的常规仪器。

常用于核酸、蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。

在印染方面，我们可以用分光光度计测量染色时染料的上染百分率，以及整理在织物上助剂的浓度，还可以用于颜色的测量。

同时它还广泛地应用于食品检测、农药的检测及工业上石油的检测等。

紫外可见分光光度计在实验中的应用非常广泛，故我们要熟悉并掌握它的原理及应用。

一、分光光度计的组成

各种型号的可见分光光度计，就其基本结构来说，都是由五个基本部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器及信号指示系统。

1.光源

在紫外可见分光光度计中，常用的光源有两类：

热辐射光源和气体放电光源。

热辐射光源用于可见光区，如钨灯和卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。

2．单色器

单色器的主要组成：

入射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜等部分。

单色器质量的优劣，主要决定于色散元件的质量。

色散元件常用棱镜和光栅。

3.吸收池

吸收池又称比色皿或比色杯，按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外区。

吸收池的种类很多，其光径可在0.1～10cm之间，其中以1cm光径吸收池最为常用。

4、检测器

检测器的作用是检测光信号，并将光信号转变为电信号。

现今使用的分光光度计大多采用光电管或光电倍增管作为检测器。

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5、信号显示系统

常用的信号显示装置有直读检流计，电位调节指零装置，以及自动记录和数字显示装置等。

二、分光计的分类

国际上一般按紫外可见分光光度计的仪器结构将其分为单光束、准双光束、双光束和双波长四类。

单光束可见分光光度计光度准确度差。

常见的721、751、753、754等可见分光光度计都是单光束仪器，因为他们的分析误差较大，所以,它们在使用上受到限制。

一般来讲,对要求较高的制药行业、质量检验行业、科研等行业不适宜使用单光束紫外可见分光光度计。

准双光束紫外可见分光光度计有两种类型:

一种是两束单色光,一只比色皿,两只光电转换器;另一种是一束单色光,一束复合光,一只比色皿,两只光电转换器。

常见类型有TU-1800、TU-1800S、TU-1800PC、TU-1800SPC、UV-762、UV-1600等。

双光束紫外可见分光光度计就是有两束单色光的紫外可见分光光度计。

它有两种类型:

一种是两束单色光,两只比色皿,两只光电转换器;另一种是两束单色光,两只比色皿,一只光电转换器。

目前,国内外的双光束紫外可见分光光度计中,两只光电转换器的双光束紫外可见分光光度计仪器已很少见。

双波长紫外可见分光光度计都采用两个单色器。

光源发出的光被两个单色器分别分离出波长为λ1和λ2,通过斩波器将两束单色光λ1和λ2交替入射到同一试样中,光电倍增管交替地接收到经过试样吸收后的这两束单色光,并把它们变成电信号。

常见的类型有WFZ800-5，UV-265。

三、原理及测试方法

原理：

朗伯-比尔定律：

当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即

A=εLc

式中比例常数ε与吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关。

c为吸光物质浓度，L为透光液层厚度。

测试方法：

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（1）最大吸收波长λmax的测定：

配置任意浓度的染液，用1㎝厚的比色皿在分光光度计上测定不同波长时的吸光度值，要求读数范围在0.2～0.8。

然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，作出吸收光谱曲线图，从而得出该浓度下染料的最大吸收波长λmax。

吸收光谱曲线图

（2）标准工作曲线的测定：

分别测定不同浓度染液在最大吸收波长λmax时的吸光度值，然后以染液浓度为横坐标，以测定的吸光度值为纵坐标作图，得到该染料的标准工作曲线图。

（3）测未知液的浓度：

在最大吸收波长下，测出未知液的吸光值，然后在标准工作曲线上找出相应的浓度。

四、紫外分光光度计的特点

①应用广泛：

紫外-可见分光光度计应用范围很广。

任何物质只要在紫外

-可见波段中吸收光谱，均可用紫外-

可见分光光度计来进行定性、定量分析；②灵敏度高：

由于新的显色剂的大量合成，并在应用研究方面取得了可喜的进展，使得对元素测定的灵敏度有所推进，特别是有关多元络合物和各种表面活性3

剂的应用研究，使许多元素的摩尔吸光系数由原来的几万提高到数十万；③选择性好：

目前已有些元素只要利用控制适当的显色条件就可直接进行光度法测定，如钴、铀、镍、铜、银、铁等元素的测定，已有比较满意的方法；④准确度高：

对于一般的分光光度法，其浓度测定的相对误差在1～3%范围内，如采用示差分光光度法进行测定，则误差可减少到0.X%；

④适用浓度范围广可从常量（1%～50%）到痕量（10-8～10-6%）；

⑤分析成本低、操作简便、快速由于分光光度法具有以上优点，因此目前仍广泛地应用于化工、冶金、地质、医学、食品、制药等部门及环境检测系统。

单在水质分析中的应用就很广，目前能有直接法和间接法测定的金属和非金属元素就有70多种。

五、紫外分光光度计的操作

1.准备工作

（1）确认环境温度、相对湿度是否满足要求（要求温度为15℃～35℃、相对湿度不大于80%）；

（2）开机前打开仪器样品室盖，观察确认样品室无挡光物后再打开电源。

2.启动

（1）打开电源，仪器显示初始化工作界面，仪器将进行自检并初始化，若初始化正常结束，系统将进入仪器操作主界面；

（2）仪器需进行预热使光源达到稳定后开始测量，预热时间一般为15～30分钟。

3.运行

（1）选择数字键“3”→按“F1”→按“1”键选择工作模式为“标样法”→按“2”键用数字键将波长值输入，输入完成按“ENTER”键→按“3”键选择需要的浓度单位。

（2）继续按“F1”键进入标样法工作曲线参数设置界面→按“1”键输入标样数，输入完成按“ENTER”键→按“2”键，按照系统提示用数字键输入标样浓度，输入完成按“ENTER”键→再按“2”键，在一号池位置放置空白溶液，按“A/Z”键进行自动校零，校零结束将要测量的标样放入对应的比色池位置，接着再按“START/STOP”键对当前测试的标样进行测量→测量结束系统提示输入下一号标样的浓度值，重复以上操作，直至标准曲线测试完成。

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（3）按“3”键可看到标准曲线、曲线方程及相关系数，将线性方程及相关系数记录在原始记录本上，按“RETURN”键返回定量测量参数设置界面。

（4）按“F3”键进入试样池设置→再按“1”键选择试样池为5联池→按“2”键可利用数字键对样品池数进行设置，输入完成后按“ENTER”键→继续按“3”键选择一号池空白校正为“否”→按“4”键对移动试样池数进行设置，按“RETURN”键返回到定量测量画面→在一号池位置放入空白溶液，按“A/Z”键对当前工作波长进行零吸光度校正，将测量的样品依次放入设定的使用样品池中，继续按“START/STOP”键测量样品的浓度值。

4.结束

测量结束将比色皿用去离子水冲洗干净倒置晾干，清理台面，关闭电源开关，并及时填写相关记录。

六、紫外分光光度计使用时的注意事项

1.比色皿使用时注意不要沾污或将比色皿的透光面磨损，应手持比色皿的毛面。

2.待测液制备好后应尽快测量，避免有色物质分解，影响测量结果。

3.测得的吸光度A最好控制在0.2～0.8之间，超过1.0时要做适当稀释。

4.开关试样室盖时动作要轻缓。

5.不要在仪器上方倾倒测试样品，以免样品污染仪器表面，损坏仪器。

6.比色皿在盛装样品前，应用所盛装样品冲洗两次，测量结束后比色皿应用蒸馏水清洗干净后倒置晾干。

若比色皿内有颜色挂壁，可用无水乙醇浸泡清洗。

7.向比色皿中加样时，若样品流到比色皿外壁时，应以滤纸點干，镜头纸擦净后测量，切忌用滤纸擦拭，以免比色皿出现划痕。

8.测定紫外波长时，需选用石英比色皿。

9.测量过程中不可打开测量室的窗门，否则会影响测量结果的准确性。

七、应用

1.生物医药上的应用

可利用分光光度计进行氨基酸含量的测定、测量未知蛋白溶液的浓度及含量、新生儿血清胆红的测定以及蛋白质与核酸的结构分析等。

2．印染上的应用

可以测定纺织品上的甲醛含量、染料对织物的上染百分率、测定蛋白助剂在织物上的均匀程度、测定整理在织物上助剂的浓度、测吸附速率曲线、半吸附时5

间、吸附饱和值、平衡吸附量、测吸附量与K/S值的关系、吸附助剂量与其他性能的关系（如防毡缩）等。

3．药品分析中的应用.我国和世界上许多国家的药典都明确规定,许多药品都要求用紫外可见分光光度计作质量控制。

因此,紫外可见分光光度计已是制药行业和药检行业必备的分析仪器。

且规定,用于药品质控的紫外可见分光光度计,光谱带宽要求2nm以下。

紫外可见分光光度计在药品检测中的应用已经非常广泛。

其中,使用紫外可见分光光度计分析最多的药物有:

维生素、抗生素、解热药、去痛药、降血压药、安定药、镇咳药、滴眼药、磺胺类药、利尿药、某些妇科药、痢疾药、腹泻药、抗肿瘤药、抗结核药等。

4.石油油品分析

在石油开采、加工过程中,石油有可能造成污染。

在石油工业生产污水中,一般将排水中石油含量规定为10mg/L。

而在地面水中,最高允许石油含量为0.1～0.3mg/L。

一般石油炼油厂中,石油所含的芳烃组成是相对稳定的,所测得标准油品的吸收峰,都在221～225nm和251～255nm处。

石油的两个特征吸收峰（225nm和254nm）是测定炼油厂污水中的含油量时要选用的吸收波长。

另外,轻油组分（初馏约180℃）几乎无明显紫外特征吸收,而中油（180～250℃）和重油（250～280℃）,以及蒽油（>280℃）等组分在225nm处吸收较强。

它代表了石油成分的主峰,在254nm处吸收较弱,有时显示出某种重质油品的特性。

这些分析工作,都用紫外可见分光光度计来进行。

还有,在炼油过程中,石油在320nm附近有一个芳烃杂质,也是必须要用紫外可见分光光度计来检测的。

因此,紫外可见分光光度计是石油工业中非常重要的质量控制仪器。

5.环境中有害物质检测

环境（包括空气、水、土壤）中许多的对人有毒有害物质的检测,都用到紫外可见分光光度计,如检测自来水中的木素磺酸、木质素、单宁、表面活性剂、黄腐酸、酚类、苯胺类、硝基酚类化合物等对人体有毒害的物质。

有些自来水中,含有氨氮、亚硝酸盐、总酚、总苯胺、硝基酚类等对人体有毒害的物质,一般也是用紫外可见分光光度计来检测。

6.饲料工业中的应用

饲料的原料、添加剂、混合饲料等中的维生素A、维生素C、维生素E、维生素K、山梨酸、苯甲酸、棉酸、甲酯、乙酸酯、胡萝卜素、烟酸、总氨基酸等微量元素钾、铁、硒、碘、铜、磷、锰等都经常用紫外可见分光光度计来检测，常6

用饲料添加剂中的皮蝇磷、磺胺类药物、灰黄霉素、二甲硝咪唑,以及普鲁卡因等的测定,基本上也都可用紫外可见分光光度计来进行检测。

7.农药及其残留物分析

施加的农药进入土壤中,一部分被农作物吸收（如六六六可被胡萝卜、花生等吸收）、一部分进入大气、一部分流入水中。

农药残留包括农药原体、农药的有毒代谢物、农药的降解物和杂质。

人们往往只把农药原体看成农药残留量,忽略了农药原体的代谢物、降解物和杂质。

其实,代谢物、降解物的毒性与原药一样或更严重。

例如,滴滴涕的代谢物为滴滴依,工业六六六的代谢物为乙体六六六,农药1605的代谢物为1601,这些代谢物的毒性都比原体更强。

杀虫脒的代谢物的毒性,比原药大10倍。

许多农药对人体的危害非常大,如六六六和滴滴涕对人的肝脏组织和肝功能的损害很大,会引起血液细胞染色体突变,有机氯农药能透过胎盘进入胎儿体内,危害胎儿。

有机磷农药、氨基甲酸酯类农药等是神经毒物,它抑制血液和组织中的乙酰胆碱酯酶的活性,引起神经功能混乱、出汗、精神错乱、语言失常等病症。

所以现在人们都很注重对农药及其残留物的检测。

8.水产品质量控制

紫外可见分光光度计在海水、淡水鱼类、贝类、虾类、海蜇类等的质量控制中已得到非常广泛的应用。

如苯、总三卤甲烷、甲苯基三唑、多氯联苯、氟、汞等,目前都采用紫外可见分光光度计作质量控制。

因此,紫外可见分光光度计将是渔业中必不可少的分析工具。

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