小鼠胰岛素说明书.docx

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小鼠胰岛素说明书

小鼠胰岛素说明书

（1）

　　小鼠胰岛素定量分析酶联免疫检测试剂盒

　　本试剂盒仅供科研使用。

用于体外定量检测小鼠血清、血浆或细胞培养上清液中的胰岛素浓度。

使用前请仔细阅

　　读说明书并检查试剂组分是否完整,如有疑问请与上海巧伊生物科技有限公司联系，我们将提供力所能及的帮助。

　　如您有其它需求，请登录上海巧伊生物科技有限公司网站或致电本公司。

胰岛素简介：

　　胰岛素是糖代谢中最主要的激素之一。

胰腺的?

细胞岛细胞产生胰岛素前体蛋白，前体蛋白被加工成C肽和胰岛素。

它们以等摩尔浓度进入血循环中。

成熟的胰岛素由A、B两条链组成。

这两条链是通过两个二硫键桥接形成有功能的胰岛素分子。

　　血浆葡萄糖浓度的变化是胰岛素产生并分泌的最主要刺激因素，产生的胰岛素具有一些代谢调节作用。

其最主要的作用是，将外周血中糖转运到肝脏中贮存起来。

一些诸如肝糖生成障碍或在促进血糖升高的激素诸如胰高血糖素、肾上腺素、生长激素和皮质醇等作用下促进肝糖分解都可拮抗胰岛素的作用。

　　检测原理:

　　本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中胰岛素的浓度。

胰岛素捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的胰岛素会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。

当加入与HRP耦连的抗胰岛素抗体后，抗小鼠胰岛素抗体与胰岛素接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。

最后加入显色剂，若样本中存在胰岛素将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。

通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，胰岛素浓度与OD450值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中胰岛素浓度。

　　小鼠胰岛素定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

　　组分

　　小鼠胰岛素预包被板标准品稀释液小鼠胰岛素标准品小鼠胰岛素抗体HRP结合物浓缩洗涤液20×TMB底物终止液封板胶纸说明书

　　规格（96T/48T）12条/6条10ml/5ml2支/1支（冻干）10ml/5ml30ml/15ml10ml/5ml5ml/3ml3/2张1份

　　标本收集:

　　1.标本的收集请按下列流程进行操作；A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；

　　B.血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集若待测样本不能及时检测，D.标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复冻融。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；

　　3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。

4.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。

　　注意事项:

　　1.试剂盒请保存在2～8℃。

　　2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。

3.标准品复溶加样后，剩余部分请丢弃。

4.底物请勿接触氧化剂和金属。

　　5.加样时，请及时更换枪头，避免交叉污染。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。

　　7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。

8.室温反应，请严格控制在25～28℃。

　　9.洗涤过程是至关重要的，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。

11.加样过程中避免气泡的产生。

　　12.血清和血浆标本的检测时，检测抗体的孵育时间应适当延长。

　　检测前准备工作:

　　1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25～28℃）平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释（1份加19份水）。

　　3.标准品:

加入标准品稀释液至冻干标准品瓶中使胰岛素终浓度达到ml，室温反应，请严格控制在25～28℃，静置10~15分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。

（标准曲线取七个点，最高浓度为ml,标准品稀释液直接加入作为0

　　浓度.）

　　　　洗涤方法:

　　自动洗板机或人工洗板：

每孔洗涤液为300ul，注入与吸出间隔15-30秒。

洗板5次。

最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。

　　实验过程需自备的材料：

　　1.不同规格的加样枪及相应的枪头；2.酶标仪；

　　3.自动洗板机；4.去离子水或双蒸水；

　　操作步骤:

　　1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃。

　　2.建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。

每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。

　　3.分别将标本或不同浓度标准品（10ul/孔）加入相应孔中，快速加入小鼠胰岛素抗体HRP结合物（100ul/孔）。

用封板胶纸封住反应孔，室温（25～28℃）孵育120分钟。

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

　　5.加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温（25～28℃）孵育10分钟。

6.加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。

　　结果判断:

　　1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效，复孔的值平均后可作为测量值。

　　2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。

　　3.手工绘制标准曲线。

以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。

通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

　　4.若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

　　典型数值和参考曲线

　　浓度ng/ml

　　典型OD值1

　　典型OD值2

　　OD平均值

　　0

　　小鼠胰岛素参考标准曲线

　　　　注意：

本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。

　　灵敏度，特异性和重复性:

　　1.灵敏度：

多次重复结果表明，最小检出量为ml。

　　2.特异性：

不与IGF-I、IGF-II、小鼠C肽、大鼠C肽反应，与猪胰岛素、绵羊胰岛素、大鼠胰岛素、牛胰岛素及人胰岛素分别有628%，256%，146%，110%和195%交叉反应。

3.重复性：

板内，板间变异系数均<10%.

　　参考文献:

　　KornerJ,SavontausE,ChuaSC,Jr.,LeibelRL,WardlawSL（2001）LeptinregulationofAgrpandNpymRNAinthemousehypothalamus.JNeuroendocrinol13:

959-966

　　OlssonRandCarlssonPO（2005）Bettervascularengraftmentandfunctioninpancreaticisletstransplantedwithoutpriorculture.Diabetologia48:

469-476

　　RydtrenTandSandlerS（2002）Efficacyof1400W,anovelinhibitorofinduciblenitricoxidesynthase,inpreventinginterleukin-1beta-inducedsuppressionofpancreaticisletfunctioninvitroandmultiplelow-dosestreptozotocin-induceddiabetesinvivo.EurJEndocrinol147:

543-55110

　　ELISAKitfortheQuantitativeAnalysisofMouseInsulin

　　ThemouseInsulinELISA（enzyme-linkedimmunosorbentassay）kitisusedfordetectionofmouseInsulinincellculturesupernatants,mouseserumandELISAKITISFORRESEARCHUSEONLY.Pleasereadthisinstructionmanualcarefullyandcheckoutthematerialprovidedbeforeuse,andyoucancontactwithourcompanyifanyquestions.Youcanenterourwebsiteorcallusforotheraim.

　　Introduction

　　Insulinistheprincipalhormoneresponsibleforthecontrolofglucosemetabolism.Itissynthesizedinthe?

-cellsoftheisletsofLangerhansastheprecursor,proinsulin,whichisprocessedtoformC-peptideandinsulin.Botharesecretedinequimolaramountsintotheportalcirculation.Thematureinsulinmoleculecomprisestwopolypeptidechains,theAchainandBchain（21and30aminoacidsrespectively）.Thetwochainsarelinkedtogetherbytwointer-chaindisulphidebridges.

　　Secretionofinsulinismainlycontrolledbyplasmaglucoseconcentration,andthehormonehasanumberofimportantmetabolicprincipalfunctionistocontroltheuptakeandutilisationofglucoseinperipheraltissuesviatheglucosetransporter.Thisandotherhypoglycaemicactivities,suchastheinhibitionofhepaticgluconeogenesisandglycogenolysisarecounteractedbythehyperglycaemichormonesincludingglucagon,epinephrine（adrenaline）,growthhormoneandcortisol.

　　PrinciplesoftheTest

　　Thekitsisasolidsandwichenzyme-linkedimmunosorbentassayfordetectionofmouseInsulin.Ananti-mouseInsulinmonoclonalantibodyhasbeenabsorbedontothewellsofthemicrotiterstripsprovided.Samplesincludingspecimensorstandardswerepipettedintowells.ThemouseInsulininspecimensorstandardswouldbecapturedbythecoatedantibodyandthefreeotherswereremovedbywashing.ThemouseInsulinHRP-conjugatedantibodywereaddedandbindstomouseInsulincapturedbythefirstantibody,whichformedasandwich.Afterthis,subtratesolutionwouldbeaddedandcatalyzedbytheHRP,andacolouredproductisformed.TheintensityofthecoloredproductisusedtocalculateinproportiontotheamountofmouseInsulinintheoriginalspecimen.

　　Materialsprovidedwiththekits:

　　reagent

　　MouseInsulinAntibody-CoatedWellsStandardDiluentMouseInsulinStandardHRPcoupledAntibodyWashBufferConcentrate20×TMBStopSolutionPlateCovers

　　CompleteInstructionManual

　　96/48TestKit12strips/6strips10ml/5ml2/1vial（s）10ml/5ml30ml/15ml10ml/5ml5ml/3ml3/21

　　SpecimenCollection

　　specimenasfollowing:

　　particulateofthecellculturesupernatantsshouldberemovedbeforeuse.wasobtainedfromclotatroomtemperature.collectplasmawithEDTA.

　　immediatelyorstoresamplesat-20℃.Avoidfree-thawcycles.andanticoagulantshouldnotappearinSerumsamples.particulateshouldberemovedfromsamplesbeforeuse.4.Donotusegrosslyhemolyzedorlipemicsamples.

　　Note:

Stronglyrecommendthattheserumandplasmasamplesshouldbediluentasdoublingdilutionbeforeuse.

　　Precautionsforuse:

　　storagetheKitat2～8℃。

　　2.Washingbufferconcentratemayhavecrystalinlowtemperature,andyoucanmeltitsinwater-bathbeforeuse.3.Pleasediscardthedissolvedstandardafter3daysforuse.contactofsubstratesolutionwithoxidizingagentsandmetal.

　　ofdisposablepipettetipsavoidmicrobialcontaminationorcross-contaminationofreagentsorspecimens.6.Donotmixorsubstitutereagentswiththosefromotherlotsorothersources.

　　7.Toensuretheadequatemixureofaddedreagents,pleasetapgentlytheplateafterthewellswerefilledwithliquid.8.Incubationtemperatureshouldbe25～28℃.9.Washstepwascrucialforwholeassayprocess.

　　10.Duplicatewellsofthesamesamplewererecommendedinassayprocess.11.Avoidthefoamwhilepourtheliquidintowells.

　　12.Forserumorplasmasamples,thebiotin-conjugatedantibodyshouldbeincubateforatleast90minutes.

　　　　ReagentPreparation

　　reagentsshouldbewarmeduptoroomtemperaturebeforeuse.Theremanentreagentsmustresealandputintorefrigeratoryagainassoonaspossible.

　　1mlofwashbufferConcentrateinto19mldeionizedordistilledwatertowork.

　　3.Addmlstandarddiluenttobottlewait15minutesforcompletedissolution.Andinturnaddthehalfconcentrationdiluentbystandarddiluent.

　　Washstep:

　　Automatedmicroplatewasheroroperatingbypipette:

Eachwellshouldbepourinto300ulwashbufferandsoak15or30seconds,thenbeaspirated,fivetimesprocesswererepeated.Afterthelastwash,removeremainingwashbufferbytheplateandblotitagainstcleanpapertowels.

　　MaterialsRequiredButNotProvided

　　1.pipettesandpipettetips

　　2.Microwellstripreadercapableofreadingat450nm（540nmasoptionalreferencewavelength）3.automatedmicroplatewasherordeionizedwater

　　　　Assayprocedure

　　neededstripswereputtedintotheframe,theremainswerereturnedintofoilpouchandresealed.wellwererecommended,whichonlycolorreagentandstopsolutionbeadded.Itissuggestedthateachtestingwithgradientdensityofstandardforstandardcurve.

　　10ulofstandardorsamplethenadd100ulofHRP-antibodywiththePlateCoversfor120minutesatroomtemperature.timeswashprocesswererepeated..

　　5.Add100ulofTMB，Lucifugalincubationfor10minutesatroomtemperature.

　　6.Add50ulofstopsolutiontoeachwell,determinetheopticaldensityofeachwellwithin10minutes.

　　CalculationofResults

　　shouldbewithin20percentofthemean.Averageabsorbancevaluesforeachsetofduplicatesampleswereusedasdetectionresults.

　　blankabsorbancevaluesofsubtractshouldbededucted.

　　abestfitcurvethroughthepointsofgraph.DrawthestandardcurvebyplottingassayedODvalure（ontheYaxis）vs.concentration（ontheXaxis）.ThesampleconcentrationwasobtainedbasedonitsODvaluefoundinginthestandardconcentrationcurve.

　　thevaluesobtainedarenotwithintheexpectedrangeofthestandard,Samplesshouldbediluteandassayagain.

　　TypicalDataandStandardCurve

　　concentration（ng/ml）

　　Typicaldata1

　　Typicaldata2

　　Average

　　0

　　MouseInsulinstandardcurve

　　　　Sensitivity,Specificity,Repeatability

　　Sensitivity:

repeatedassayswereevaluatedandtheminimumdetectabledosewasml.

　　Specificity:

Nosignificantcross-reactivityorinterferencewithIGF-I,IGF-II,MouseC-peptide,RatC-peptideandhas628%cross-reactivitywithporcine