分子生物学实验.docx

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分子生物学实验

分子生物学实验

目录

分子生物学实验综合规程············································································3

实验内容········································································································4

实验一实验基础知识和基本技能培训······················································4

实验二大肠杆菌感受态细胞的制备·························································6

实验三质粒DNA的转化···········································································7

实验四碱裂解法提取质粒DNA································································9

实验五琼脂糖凝胶电泳检测DNA···························································12

实验六PCR基因扩增················································································14

参考书目：

分子生物学实验指导，魏群主编，高教出版社

分子生物学实验指导，刘进元主编，清华大学出版社

分子生物学实验综合规程

☐上课时间提前5分钟进入实验室；不迟到、不早退，无故旷课累计3次没成绩；

☐请假须医院病假条或班主任签字的假条；

☐上课时需穿实验服，不许在实验室内吃东西，不背着书包做实验，不穿拖鞋进实验室；

☐实验课期间不许打闹、闲聊等，不大声喧哗，保持课堂纪律，实验过程中，至始至终需全组同学一起完成，任何人中途不得缺席。

☐必须做到课前认真预习，课间做好实验记录、课后详细总结实验结果并按时提交实验报告；

☐公用试剂不得污染！

每次都必须用新枪头。

公用台上公用试剂不得私自拿到自己实验台上；

☐不得私自拿走或乱放别人的实验物品、实验产品；

☐不得擅自使用实验室中非本实验仪器、试剂。

☐实验废液不随便倾倒，随时保持实验台的整洁；

☐爱护实验器材，实验器材损坏必须按规定赔偿；

☐实验前按仪器性能与要求，进行仪器预热；

☐实验完成后检查电源插座，用完仪器后必须复位，仪器清洁干净、摆放整齐；每组实验物品齐全，需教师验收，枪量程要归位，发现问题及时报修；

☐每位同学负责自己实验台面和柜体的卫生，值日生负责公用实验台、地面等处卫生；

☐每次轮到打扫卫生的小组，要认真做好值日工作，离开实验室须向教师声明；

☐同学与老师之间、同学与同学之间、实验班与实验班之间一定要互相协作配合保持公用房间卫生，注意门窗水电的安全。

☐遵守通用的实验室规则。

违反上述任何一条规则责任自负，并要扣分，造成损失要照价赔偿。

实验一实验基础知识和基本技能培训

实验目的学习和掌握分子生物学实验的基本技术和技能，了解分子生物学实验中常用的仪器设备，熟悉常用玻璃器皿、耗材。

实验原理通过多媒体、胶片、板书、实物演示等各种教学方式，让学生初步学习和掌握分子生物学实验的基本知识和基本技能，了解分子生物学实验常用仪器设备，熟悉常用玻璃器皿、耗材。

1.分子生物学实验综合规程（见前页）

2.分子生物学实验设备

1）温度控制系统：

冰箱：

4℃、-20℃、-70℃--样品、试剂和材料等的保存

2）恒温培养箱：

细菌平板的培养

3）恒温空气摇床；菌体的培养

4）灭菌器:

培养基、试剂、耗材等的灭菌

5）PCR仪：

PCR扩增、保温实验等

6）恒温水浴及微量加热器：

保证实验温度的恒定

7）电泳仪：

电泳时提供电压和电流

8）电泳槽：

核酸或蛋白质的电泳定性分析时的凝胶支架

9）凝胶成像系统：

电泳结果的定性和定量分析

10）紫外分析仪：

电泳结果的定性分析

11）台式高速冷冻离心机：

样品的分离

12）分光光度计：

样品的定量测定

13）超净工作台：

提供洁净工作环境

14）电子天平：

样品、试剂等的称量

15）pH计：

精确的pH值测定

16）移液器；液体试剂的精确取量

17）制冰机：

保证操作过程中温度的恒定

3.分子生物学基本技术

3.1实验规范训练－仪器的操作

要求：

1）仪器在未经培训前，不得擅自使用

2）严格按操作规程使用仪器，

3）有些仪器必须有教师在场时才能使用，并由教师操作

4）违反规定的使用者，造成的后果由使用者承担

3.2实验规范训练－量程的选择

1）天平

2）烧杯、量筒、容量瓶、试剂瓶－－不同规格

3）量程的选择－移液器

3.3实验规范训练－标签

1）所用的器皿上一定要做标记

2）标签一定要贴到固定的位置

3）标签上应包括具体的名称、组别、实验班、日期

3.4实验规范－实验操作

1）详细记录和分析实验结果并按时提交实验报告

2）实验中一定要处处用心、勤动手，多问为什么

3）仔细操作和观察

4）保留好每一步的实验样品，在确准的情况下才能当废液扔掉

4实验准备

4.1清点和熟悉常用玻璃器皿、耗材等

4.2洗涤本学期实验用玻璃器皿

4.3配制试剂

1）0.1mol/LCaCl2100mL

2）5mol/LNaOH100mL胶塞

3）LB液体培养基100mL

胰蛋白胨（typtone）1g

酵母提取物（yeastextract）0.5g

NaCl1g

加部分水溶解后加20μL5mol/LNaOH，定容到100mL（40mL到两个250mL锥形瓶，3mL分别到大试管中，用于预培养及复苏）

4）10%（w/v）SDS储液50mL，室温保存

5）1mol/LTris200mL

6）2mol/LHCL100mL

7）0.5mol/LEDTA100mL

80mL水中加18.61gEDTA-Na2H2O，用NaOH调pH8（约需2gNaOH），后定容至100mL

8）5xTAE1000mL

9）70%乙醇500mL

10）Amp：

100mg/mL20ml，分装每管1mL，－20℃保存

注意：

先将所需烧杯、量筒、玻棒、双蒸水、微量离心管灭菌待温度降到室温后，在超净台中配制，再用一次性滤器过滤分装于1.5mL无菌微量离心管中，－20℃保存

4.4高温灭菌

1）LB液体培养基

2）1.5mL离心管2瓶/组

3）枪头/1组：

1mL1盒，200uL1盒

4）培养皿12套/组

5）无菌水100mL/班

6）0.1mol/LCaCl2

实验二大肠杆菌感受态细胞的制备

实验目的制备出感受态细胞。

实验原理感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。

受体细胞经过一些特殊方法（如：

电击法，CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法，简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法为使用更广泛。

一、材料

大肠杆菌E.coliDH5α，100ml三角瓶，1.5ml离心管（又称eppendorf管）,离心管架，1000ul、200ul枪头，大量冰块，

二、设备

微量移液器（200μl,1000μl），高压蒸汽消毒器（灭菌锅），恒温摇床、冷冻离心机,超净工作台,紫外光度计，双蒸水器，冰箱等。

三、试剂准备

1、LB液体培养基：

称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml蒸馏水中，用NaOH调pH至7.5,加水至总体积1升，高压下蒸气灭菌15min。

2、LB固体培养基：

液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。

3、高压灭菌的0.1mo1／LCaCl2：

母液1MCaCl2147gCaCl22H2O，加水到1L

4、高压灭菌过的30％甘油

四操作步骤

大肠杆菌感受态细胞的制备

（1）（已预先准备好）从新活化的E.coliDH5α菌平板上挑取一单菌落（超净工作台操作），接种于3～5mlLB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。

将该菌悬液以1：

100～1：

50转接于20mlLB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养；

（2）取培养液1.5ml转入微量离心管中，在冰上冷却10min，于4℃，5000r／min离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）。

（3）倒净上清培养液，用1ml冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴，0～4℃，5000r／min离心10min；

（4）弃去上清液，加入500µl冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心悬浮细胞。

0～4℃，5000r／min离心10min；

（5）弃去上清液，加入100µl冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；

（6）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后在超净工作台分装到Eppendorf微量离心管中，液氮速冻后，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。

五实验结果及分析讨论：

实验三质粒DNA的转化

实验目的把DNA引入感受态受体细胞，使受体菌具有新遗传性，并从中选择出转化子。

实验原理受体细胞经过一些特殊方法如化学试剂法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。

进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（即带有异源DNA分子的受体细胞）。

CaCl2法的基本原理：

细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面，经短时间42℃热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。

将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药性（Ampr）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp的选择性培养基上，倒置培养过夜，可获得细菌菌落。

转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

一、材料

pUC19质粒，大肠杆菌感受态，1.5ml塑料离心管，离心管架，

1000ul、200ul枪头，9cm培养皿，一次性滤膜（0.22um），大量碎冰

二、设备

微量移液器（2μl,200μl,1000μl），高压蒸汽消毒器（灭菌锅），培养箱，恒温水浴锅，恒温摇床，离心机超净工作台，双蒸水器，冰箱等。

三、试剂准备

LB固体培养基

LB液体培养基

氨苄青霉素（apm）：

无菌水配置成100mg/ml溶液，用滤膜抽滤，-20℃保存

灭菌双蒸水ddH2O

四实验操作

（1）平板的制备：

LB固体培养基中加入Amp（100μg/ml），转化反应前一天，倒置平板，保存。

（2）分别用2个100µl感受态细胞悬液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面操作：

第一组，质粒DNA组：

2µlpUC19质粒DNA+100µl感受态细胞悬液

第二组，空白对照组，2ul无菌水＋100µl感受态细胞悬液

（3）将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置20-30min，于42℃水浴中保温90s，然后迅速冰上冷却2min

（4）立即向上述管中分别加入0.4mlLB液体培养基（在超净工作台操作，不需要在冰上），使总体积到0.5ml，摇匀后于37℃振荡培养约30-60min，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物（Ampr）。

（5）将培养液以5000rmp离心2min，在超净工作台取各样品培养液0.1ml在平板上涂布，分别接种于含抗菌素LB平板培养基上（做好标记，日期），涂匀。

（6）在菌液完全被培养基吸收后，培养皿倒置于37℃培养箱中过夜（12-16小时），

（7）观察转化子出现的情况，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养，

五实验结果和分析讨论：

思考题

1、制备感受态细胞的原理是什么？

2、可将外源基因转化受体细胞的方法有哪些？

实验四碱裂解法提取质粒DNA

实验目的1、掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法；

2、了解制备原理及各种试剂的作用。

实验原理碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。

在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。

质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

（简明原理：

碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。

碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。

）

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。

各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。

目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。

一、材料

含pUC19质粒的大肠杆菌，1.5ml塑料离心管,离心管架，枪头及盒、卫生纸。

二、设备

微量移液器（20μl,200μl,1000μl），台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器（灭菌锅），涡旋振荡器，恒温水浴锅，双蒸水器，冰箱，等。

三、试剂准备

1、LB液体培养基：

称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml蒸馏水中，用NaOH调pH至7.5，加水至总体积1升，高压下蒸气灭菌15分钟。

2.氨苄青霉素（Ampicillin,Amp）母液：

配成100mg/ml水溶液，-20℃保存备用。

3.溶液Ⅰ：

50mM葡萄糖，25mMTris-HCl（pH8.0），10mMEDTA（pH8.0）。

配制方法：

1MTris-HCl（pH8.0）12.5ml，0.5MEDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。

在121℃高压灭菌15min，贮存于4℃。

4.溶液Ⅱ：

0.2MNaOH，1%SDS。

配制方法：

2MNaOH1ml，10%SDS1ml，加ddH2O至10ml。

使用前临时配置。

5.溶液Ⅲ：

醋酸钾（KAc）缓冲液，pH4.8。

配制方法：

5MKAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml。

4℃保存备用。

6.苯酚/氯仿/异戊醇（25：

24：

1）。

氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。

酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。

7.无水乙醇；

8.70%乙醇；

9.TE：

10mMTris-HCl（pH8.0），1mMEDTA（pH8.0）。

配制方法：

1MTris-HCl（pH8.0）1ml，0.5MEDTA（pH8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。

121℃高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。

1MTrisCl（Tris（三羟甲基）氨基甲烷）：

800mlH2O中溶解121gTris碱，用浓盐酸调pH值，混匀后加水到1L；

0.5MEDTA（乙二胺四乙酸）：

700mlH2O中溶解186.1gNa2EDTA.2H2O，用10MNaOH调pH8.0（需约50ml），补H2O到1L。

10.RNA酶A母液：

将RNA酶A溶于10mmol/LTris·Cl（pH7.5）,15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加热15分钟，使混有的DNA酶失活。

冷却后用1.5mleppendorf管分装成小份保存于-20℃。

四、操作步骤 

1.挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于20mlLB（含Amp100ug/ml）液体培养基中，37℃、250rmp振荡培养过夜（约12-14hr）。

2.取1.5ml培养液倒入1.5mleppendorf管中，12000rmp离心1-2min。

弃上清，将离心管倒置于卫生纸上，使液体尽可能流尽。

3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中（需剧烈振荡，使菌体分散混匀。

）,室温下放置5-10min。

4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴5min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。

5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置5min。

12000rmp离心10min。

溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。

6、上清液移入干净eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀,12000rmp离心10min。

（450μl的苯酚/氯仿/异戊醇。

）

7、小心移出上清于一新微量离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，离心12000rmp×10min。

8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml70％乙醇洗沉淀一次，12000rmp离心5min。

9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。

10、将沉淀溶于20μlTE缓冲液（pH8.0），完全溶解后加入20μg/mlRnaseA约4μl，37℃水浴30min以降解RNA分子，储于-20℃冰箱中。

五实验结果和分析讨论：

注意事项

1.提取过程应尽量保持低温。

2.沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。

沉淀DNA也可用异丙醇（一般使用等体积），且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。

思考题

1、裂解细菌时需注意的事项有哪些？

2、碱裂解法提取质粒DNA中溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的作用是什么？

实验五琼脂糖凝胶电泳检测DNA

实验目的本实验旨在学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测DNA含量与分子量。

实验原理根据DNA分子量不同，采用外加电场使其分开，用EB嵌入DNA分子后在紫外下显色。

琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

1）在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下，带负电的核酸分子向正极迁移。

由于糖一磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。

2）在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。

具有不同的相对分子质量和不同构型的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。

3）溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。

在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。

一、材料

pUC19质粒，1.5ml塑料离心管，离心管架，透明胶带，防护眼镜

二、设备

微量移液器（20μl），高压灭菌锅，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置，微波炉，紫外透射仪等。

三、试剂准备

1.TAE电泳缓冲液：

50X储存液，pH8.5：

242gTris碱，57.1ml冰醋酸，37.2gNa2EDTA.2H2O，加水至1L；

1X工作液：

40mmol/LTriAc，2mmol/LEDTA

2．溴化乙锭（EB）：

10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。

（注意：

EB为强诱变剂，操作时带手套）

3.DNAloadingbuffer（上样缓冲液）：

0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液，贮存于4℃。

（作用：

增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内；使样品带有颜色便于简化上样过程；其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。

在0.5×TBE琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝的迁移率约与300bp的线状双链DNA相同，而二甲苯氰FF约与4000bp的DNA相同。

）

4DNAMaker标准分子量：

λDNA/EcoRI+HindIIIMaker

5.1%琼脂糖凝胶：

称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml1×TAE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液1×TAE），即可上样。

6.无菌水

四实验操作

1、琼脂糖凝胶的制备

1）取50×TAE缓冲液20ml，加水至1000ml，配制成1×TAE稀释缓冲液，待用。

2）胶液的制备：

称取1g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入100ml1×TAE稀释缓冲液，放入微波炉里（或电炉上）加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀,此为1％琼脂糖凝胶液。

加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。

3）胶板的制备：

将有机玻璃胶槽两端分别用透明胶带（宽约1cm）紧密封住。

将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子。

4）向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入5μl溴化乙锭（EB）溶液轻轻摇匀，使其终浓度为0.5μg/ml（也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色）。

小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。

检查有无气泡。

室温下约30-45分钟后，琼脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和挡板，注意不要损伤梳底部的凝胶；清除碎胶，将凝胶放入