整理S2实验二培养基及其配制理论.docx

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整理S2实验二培养基及其配制理论

实验二培养基及其配制（理论）

一、培养基成分及作用

培养基（culturemedium）是植物组织培养的物质基础，也是植物组织培养能否获得成功的重要因素之一。

培养基成分对离体培养植物的生长发育起调控作用。

选择合适的培养基并掌握正确的制备方法是组织培养成功的前提。

（一）植物必需的营养元素

植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素在植物体内起到一定的生理作用：

1、组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；

2、构成一些特殊的胜利活性物质，参与活跃的新陈代谢；

3、这些元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等点化学方面的作用；

4、在发育方面，特定的元素影响植物的形态发生和组织、器官建成。

Arnon和Stout（1939）提出的确定植物必需营养元素的3个标准：

A、缺乏该元素，植物生育发生障碍，不能完成其生活史

B、缺乏该元素，就表现为专一的病症，且这种缺素症可以用补充改元素来预防和恢复

C、改元素在植物营养生理上表现直接的效果，而不是由于土壤的物理、化学、微生物条件的改进而产生的间接效果。

国内外公认的高等植物所必需的营养元素有16（17）种：

C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni）

在植物中含量差别很大，同一元素在植物不同时期、不同条件下含量也不同。

根据植物体内含量多少，可把这些元素分为：

大量营养元素：

占干物质重量的0.1%以上；

C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9种。

微量营养元素：

占干物质重量的0.1%以下

有的只含0.1mg/kg。

Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7种。

（二）培养基营养成分及作用

培养基是外植体生长的土壤，它所含有的不同营养元素直接影响着培养材料的生长发育。

培养基中的营养元素以有机物和无机物两类形式存在，绝大多数营养元素以无机物的形式存在。

按照国际植物生理协会的建议：

所需浓度>0.5mmol/L的元素为大量元素

所需浓度<0.5mmol/L的元素为微量元素

1、大量元素

N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置，又称生命元素。

在培养基中主要以NO3—-N和NH4—-N两种形式存在。

P是磷脂主要成分。

培养基中常用KH2PO4NaH2PO4等。

K对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有密切关系。

培养基中常以KCl、KNO3等盐类提供。

Mg、S、Ca是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；S是含S氨基酸的蛋白质的组成成分。

它们常以MgSO4·7H2O提供，用量为1—3mg/L较为适宜；Ca是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，Ca及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。

常以CaCl·2H2O提供。

2、微量元素

在微量元素中，铁的使用最大，铁是一些氧化酶的组成成分。

同时又是叶绿素形成的必要条件。

由于培养基的pH较高，所以培养中几乎都使用不易分解的乙二胺四乙酸铁这种鳌合物来防止铁的沉淀。

硼与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系；铜是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长；锰参与植物的光合、呼吸代谢；钼参与氮素的代谢；氯是光合作用水光解的活化剂。

微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调节。

缺铁症状：

叶面呈绿色网纹状失绿。

随病势发展，叶片失绿程度加重，出现整叶变为白色，叶缘枯焦，引起落叶。

严重缺铁时，新梢顶端枯死。

缺铜症状：

新梢顶端叶片的叶尖失绿变黄，叶片出现褐色斑点至扩大变成深褐色，引起落叶。

枝顶端生长不良，其下部的芽开始生长，形成丛生的细枝。

缺锰典型症状：

叶脉间失绿褪色，但叶脉仍保持绿色，脉间出现坏死斑，缺素症状由幼叶开始。

缺钼典型症状：

叶较小，叶脉间失绿,有坏死斑点，且叶边缘焦枯，向内卷曲。

十字花科植物缺钼时叶片卷曲畸形，老叶变厚且枯焦

缺硼典型症状：

受精不良,籽粒减少，“花而不实”，“蕾而不花”；根尖、茎尖的生长点停止生长，而形成簇生状；常引起各种腐烂病。

3、碳源

碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，以糖类物质最重要。

一般来说，蔗糖是最好的糖源，它具有热易变的性质，经高压灭菌后，大部分分解为D-葡萄糖、D-果糖，仅剩下部分的蔗糖，这更利于吸收和利用。

蔗糖使用浓度一般在2%—5%。

此外，糖还可以提供能源和调节渗透压，调节培养基的渗透压一般在1.5—4.1MPa。

4、维生素类

这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长，分化等有很好的促进作用。

主要分为脂溶性维生素和水溶性维生素。

5、肌醇

又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用，是细胞壁的构建材料。

肌醇参与碳水化合物、磷脂代谢及离子平衡等生理活动，具有促进活性物质发挥作用的效果，在培养基中加入1.0mg/L的肌醇就足以影响VB1的效应。

使用浓度一般在50—100mg/L。

6、氨基酸

氨基酸是蛋白质的组成成分，也是一种很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。

培养基中常用的是甘氨酸，还有其他氨基酸，用量一般在10—1000mg/L之间。

7、天然复合物

为了促进某些愈伤组织和器官的生长，在培养基中还常加入多种化学成分不明的、复杂的天然营养混合物，如水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物等。

8、琼脂

为使培养材料在培养基上固定和生长，要外加一些支持物，构成固体培养基。

琼脂是使用最普遍的凝固剂。

用量一般在6—10g/L之间，以颜色浅、透明度高好，洁净为上品。

除了琼脂外，在组织培养中还可以使用琼脂糖、结冷胶等。

9、活性炭

培养基中加入活性炭主要是为了吸附培养基及培养物分泌物中的抑制物质。

加入适量的活性炭对抑制外植体褐变、防止玻璃苗的产生、促进培养物生长和分化、促进生根具有一定作用。

但活性炭也有副作用，它的吸附作用没有选择性，所以在吸附抑制物的同时，使一些营养成分也吸附了。

10、抗生素

主要目的是防止外植体内生菌造成的污染。

11、生长素类

主要生理作用是促进细胞伸长和分裂，还有促进生根、抑制器官脱落、性别控制、延长休眠、顶端优势、单性结实等作用。

在职物组织培养中，主要被用于诱导愈伤组织的形成、根的分化以及细胞的分裂和伸长。

生长素一般溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，以后者的溶解效果更好。

常用的生长素有IAA（吲哆乙酸）、NAA（奈乙酸）、2,4-D（二氯苯氧乙酸）和IBA（吲哆丁酸）等。

12、细胞分裂素类

细胞分裂素影响细胞分裂、顶端优势的变化和茎芽的分化等。

主要作用是促进细胞分裂和分化，诱导胚状体和不芽的形成，延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成。

还用于离体成花的调控。

细胞分裂素一般溶于0.5—1.0mol/L的盐酸或稀薄的NaOH中。

常用的细胞分裂素有KT（激动素）、BA（6-卞基腺嘌呤）、2-ip（异戊烯氨基嘌呤）玉米素等。

13、赤霉素类和脱落酸

在组织培养中不常使用。

赤霉素主要作用是加速细胞的伸长生长，也促进细胞的分裂。

主要是GA3。

脱落酸具有抑制细胞分裂和伸长、促进脱落和衰老、促进休眠和提高抗逆能力等作用。

二、培养基的分类与配制

（一）培养基的种类

根据培养基的形态不同可以分为固体培养基与液体培养基；根据培养过程不同可以分为初代培养基与继代培养基；根据其作用不同可以分为诱导培养基、增殖培养基和生根培养基；根据其营养水平不同则分为基本培养基和完全培养基。

（二）几种常见培养基的特点

1、MS培养基特点是无机盐浓度高，具有高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐的用量很大，同时还含有一定数量的铵盐，营养丰富，不需要添加更多的有机附加物。

2、White培养基是1943年White设计的，1963年做了改良，特点是无机盐浓度较低。

使用广泛，在生根培养、胚胎培养中有良好的效果。

3、B5培养基是1968年由Gamborg等设计的，特点是含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。

4、N6培养基是1974年由我国的朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计的，特点是KNO3和（NH4）SO4含量高，不含钼。

（三）培养基的配制

配制培养基应做好几点工作：

1、实验用具的准备。

包括配制过程中所需电炉、酸度计、高压灭菌锅等设备及其他玻璃器皿的清洗和准备；

2、试剂、药品的准备。

3、根据培养基的配方、母液扩大倍数及需要配制的培养基体积计算所需各种母液及其他附加物的量。

具体操作如下：

1、取规定数量的糖源和凝固剂置于烧杯或搪瓷锅内，加蒸馏水或去离子水至培养基最终体积的3/4，在恒温水浴中加热使之溶解，并不断搅拌，防止琼脂凝块儿。

配制液体培养基时因不含凝固剂，无须高温加热。

2、根据计算所需量依次加入大量元素、微量元素、铁盐、有机物、生长调节物质母液及其他特殊的附加物，搅拌均匀。

吸取各种母液的移液器应专用，以免产生交叉感染。

对高温高压条件下不稳定或容易分解的植物生长调节物质必须在培养基进行高温高压灭菌后，用过滤的方法加入。

3、加水定容至规定体积，搅拌均匀。

在标准温度下将培养基定容后进行称量，并以此质量为标准进行较高温度的培养基的定容。

4、调整培养基的pH值。

一般采用1mol/LNaOH与1mol/LHCl来调整其pH值。

5、分装。

已经配制好的培养基应尽快的分装，以防止含琼脂的培养基在较低温度下凝固。

分装时应注意到培养基占该容器的1/3—1/4为宜。

6、封口。

培养基分装后，应立刻用封口膜将容器口部封严。

封口膜应具有透光、透气性，但不通透尘埃、微生物等杂质。

（四）培养基的灭菌

组织培养必须在无菌环境中进行，因此作为外植体生长的介质的培养基的灭菌操作非常重要。

培养基分装封口后立刻进行灭菌，至少在24h内完成灭菌程序。

一般采用的是高压蒸汽灭菌。

2.间接市场评估法高压蒸汽灭菌的原理：

通过加热，在密闭的高压锅内随着水蒸汽压力的不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。

在0.105MPa压力下，锅内温度达121℃。

在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度乃热的芽孢。

2.环境影响评价工作等级的划分依据一般情况下，灭菌在温度121℃，压力0.105MPa下，保持20—30min即可。

灭菌锅有很多种，实验室中手提式高压蒸汽灭菌锅是最常用的，但是在使用时要注意一下几点：

（4）是否满足环境功能区划和生态功能区划标准。

1、锅中应放足量的水，以免造成空烧或干烧；

（五）规划环境影响评价的跟踪评价2、装锅时不要过度倾斜，可保持内部有一定的空间，利于蒸汽流动；

8.编制安全预评价报告3、增压前高压锅内的空气必须排净，否则易影响灭菌效果；

一、环境影响评价的发展与管理体系、相关法律法规体系和技术导则的应用4、灭菌过程中，应尽量保持压力恒定，严格遵守灭菌时间；

5、排气降压时应缓慢进行；

3.建设项目环境影响评价文件的审查要求6、只有待高压锅内压力表指针恢复到零后，才能开启压力锅；

7、高压锅工作时，应有专人看守。

（2）综合规划环境影响篇章或者说明的内容。

（五）培养基的保存

1.环境总经济价值的构成灭菌后的培养基经冷却和凝固后即可使用，若要检验灭菌效果，可将培养基置于培养室中3天，若没有污染现象，说明灭菌可靠，可以使用。

培养基最好保存在低温条件下，但在常温下保存时要进行防尘和避光处理，保存时间不可过长。