脓汁和粪便标本中病原菌的检测实验报告模板三_精品文档.doc
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微生物实验报告
一、实验目的
1、掌握培养基制备的原则和一般方法。
2、掌握病原菌的分离与培养方法。
3、掌握油镜的正确使用、细菌涂片标本的制备、革兰氏染色法，熟悉细菌基本形态。
4、熟悉几种常用的细菌生化反应的名称、原理、方法、结果分析及用途。
5、掌握血浆凝固酶试验的原理、方法及用途。
6、熟悉药物敏感性试验方法的种类、原理及应用，掌握纸片扩散法。
7、掌握玻片凝集试验的原理、方法、结果观察与判断。
二、实验器材
1、天平、称量纸、干粉培养基、锥形瓶、量筒、15支试管、试管架、试管筐、5ml刻度吸管、平皿、洗耳球、酒精灯
2、脓汁标本1支，粪便标本1支；伊红美兰平板2个，营养琼脂平板2个，伊红美蓝平板2个，接种环，酒精灯
3、斜面4支、细菌分离培养物（上次实验平板）
4、斜面培养物4支，营养肉汤4支，生理盐水2支，镜油瓶、拭镜纸1套，吸水纸1本，载玻片4张，染色瓶，染色架
5、斜面培养物4支，营养肉汤培养物（菌液）4支，半固体琼脂4支，营养琼脂平板4个，糖发酵管1套，抗菌素纸片1套，眼科镊子2把
6、半固体培养物4支，药敏试验培养物4个，微量发酵管培养物1套。
三、方法与步骤
1、培养基的制备：
培养基
称量干粉培养基（g）
水量（ml）
煮沸（次）
分装（ml）
备注
营养琼脂
11.4
300
2瓶，500ml锥形瓶，平板
营养琼脂
2.9
75
3
5
15支，中试管，斜面
营养肉汤
1.1
50
1
1
15支小试管，液体
半固体琼脂
1.7
60
3
3
15支，小试管，高层
干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→集中放在试管筐里，然后罩上硫酸纸、牛皮纸，用橡皮筋扎好→放入讲台边的灭菌桶或灭菌筐内→送到髙压蒸汽灭菌室→灭菌（用于倒平板的培养基不用加热溶解，摇匀即可）
2、细菌的分离培养
平板划线分离法
甲→脓汁标本→营养琼脂平板（黄色）乙→脓汁标本→营养琼脂平板（黄色）
丙一粪便标本一伊红美蓝平板（紫色）丁一粪便标本一伊红美蓝平板（紫色）
方法：
（1）右手拿接种环（如握笔式），烧灼灭菌，欲伸入试管内的接种环杆部分亦要迅速通过火焰2~3次，以杀灭其表面细菌；
（2）左手握住盛有标本的试管的下端，右手以无名指、小指与手掌在火焰旁拔出试管棉塞并挟住之，将管口迅速通过火焰三次灭菌；（3）立即将已灭冷却的接种环伸入试管内，沾取标本（或菌液）一环，试管口火焰灭菌后塞好棉塞;（4）左手斜持平板，略开盖，在酒精灯火焰左前方约5~6cm处，将接种环上的菌液涂抹于平板表面的边缘部分；（5）烧灼接种环，冷却后，从原涂抹部分开始，连续平行划线，每次只划平板的1/4~1/5，划毕后接种环再经火焰灭菌，冷却后用同样方法在平板其余部分划线，每次划线要与前次划线重叠1-3条，共计3^次（区）；（6）接种完毕，将接种环烧灼灭菌后方可放下；（7）将培养皿倒置，37°C培养34小时后，观察结果。
3、细菌的纯培养
斜面接种分工
甲→普通平板→黄色菌落→1支斜面乙→普通平板→白色菌落→1支斜面
丙→EMB平板→紫黑菌落→1支斜面丁→EMB平板→粉红菌落→1支斜面
方法：
接种环→套住菌落→轻刮取菌→接种环取菌后，伸入斜面底部，自下向上先拉→条细菌接种线→再伸入底部，自下向上，作蜿蜒划线→细菌涂布接种在斜面培养基的表面→斜面正面上2/3作标记：
组号、颜色→收集平板-灭菌桶内（平板底部朝下，盖朝上放置）→速送灭菌室→高压蒸汽灭菌→洗刷。
4、细菌的形态学检查
涂片→干燥→固定→染色
（1）涂片→干燥→固定
甲→黄色，紫黑。
乙→白色，粉红。
丙→黄色，紫黑。
丁→白色，粉红。
方法：
涂片：
①接种环取盐水3ulX2滴，水滴间距小于2cm;②取菌苔少许（1mm小菌落半个）与盐水混勻，涂成大于lcm2;③涂毕→环移至涂膜中央侧立，待环内菌膜破裂，接种环烧灼灭菌。
→干燥→固定：
手持载玻片→端，涂膜朝上，两个涂膜快速通过火焰外层3次，时间2〜3秒钟。
（2）革兰染色
涂片→干燥→固定→结晶紫→初染1分钟→水洗→卢戈碘液→媒染1分钟→水洗→95%乙醇→脱色约20秒钟—7尺洗—稀释品红—复染1分钟—水洗—吸干，镜检。
油镜使用方法：
10X物镜—看清标本—滴加香柏油—100X油镜—浸泡油中→模糊物象→细调节调焦，观察物像→记录结果→关闭电源→擦镜纸拭去香柏油—擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:
3）混合液擦拭→擦镜纸擦拭油镜。
5、液体培养基接种（肉汤接种）
甲→黄色，乙→白色，
丙→紫黑，丁→粉红。
方法：
（1）接种环斜面取菌，在靠近液面的管壁上，上下研磨接种；
（2）在管壁上，将接种环内的菌膜拍破。
退出接种环，烧灼灭菌；（3）标记：
组号，颜色
6、细菌的生化试验等
a.细菌的糖发酵试验
甲—紫黑菌苔—①葡萄糖乙—紫黑菌苔—②乳糖
丙→粉红菌苔→③葡萄糖丁→粉红菌苔→④乳糖
方法：
①用砂轮在糖发酵管液面上方2〜3cm处切割，然后，向切口外侧分离掰断，管口烧灼灭菌。
②接种针斜面取菌，伸入培养基内，在管壁上，上下研磨接种。
③退出接种针，烧灼灭菌。
④管口朝向相同，放置在平皿内。
b.抗菌素敏感性试验
纸片扩散法
甲→黄色菌液乙→白色菌液
丙→紫黑菌液丁→粉红菌液
方法：
①先取→环菌液；②沿平板直径拉一条细菌接种线；③再取一环菌液；④旋转平板90度角，拉另一条接种线，使两条细菌接种线呈“十字形”；⑤然后在平板上半部，作连续来回密集划线，每次划二分之一平板；⑥旋转平板90度角，二次密集划线；⑦旋转平板90度角，三次密集划线；⑧旋转平板90度角，四次密集划线；⑨设三点，呈等边三角距离；⑩点距离平板边缘约15mm;⑪作标记：
青、先、庆；⑫镊子尖嘴朝下，夹取相应药物纸片的边缘，平贴在已设定的位置上，轻轻按压纸片。
c.血浆凝固酶试验
兔血浆+黄色，白色
方法：
①取二滴兔血浆（rabbitplasma）置于洁净的玻片上。
②分别用接种环取白色和黄色菌苔（约2〜3个菌落的菌量）与血浆研磨混合成直径8〜10mm的一层薄菌膜，立即观察结果。
③菌液出现明显凝块者为阳性，否则为阴性。
d.半固体穿刺接种法
甲→白色乙→金黄色
丙→紫黑丁→粉红
方法：
①接种针斜面取菌，从半固体中心，垂直刺入，到达培养基底部5分之4处，再循原来的路线,退出接种针；②管口、接种针经火焰烧灼灭菌；③标记:
组号,颜色。
7、细菌的血清学试验、结果分析
玻片凝集试验
方法：
（1）取洁净的载玻片一张，将磨面近端设为对照区，滴加生理盐水15ul。
远端设为试验区，滴加福氏志贺菌诊断血清15ul;
（2）用接种环分别取粉红色菌苔，约2个小菌落的菌量，研磨于盐水或血清内，混合均勻。
四、结果与讨论
（一）实验结果
1.洗手前后对比：
图1.1甲乙洗手前后图1.2丙丁洗手前后
空气的细菌学检查结果（暴露在卫生间窗子边）：
图1.3空气的细菌学检查结果
CFU/m3＝50000N÷AT=50000×3×（3.14×3.5cm2）×40/m3=258/m3
2.细菌的分离培养结果：
（1）脓汁标本在普通平板上有黄色、白色两种菌落，菌落的色素是脂溶性的，是细菌本身的颜色。
菌落直径2mm左右、圆形、隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明。
（2）粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、淡粉红色两种菌落，菌落色素是水溶性的，不是细菌本身的颜色，紫黑色菌落具有金属光泽、大而隆起、不透明的菌落，菌落直径2〜3mm；粉红色菌落淡粉红色，半透明，直径1〜2mm.
（3）从四张平板画线的结果上来看，第三张图分离效果很好，得到的菌落典型。
而其他三张均有不足。
第一二张脓汁的营养琼脂平板，前面两区涂抹太密集，而板的其他部位未充分利用，得不到十分明显的菌落。
第四张粪便的平板第一区太稀疏，未充分利用平板，故在培养后未见到数量较少的粉红菌落，原因是划线时不熟练，不能连续划线。
图2.2丙，丁→粪便标本→伊红美蓝平板
图2.1甲，乙→脓汁标本→营养琼脂平板
3.细菌的纯培养：
在斜面培养基上得到四种菌体的纯培养标本，从普通平板上挑取的黄色或白色菌落接种的斜面，菌苔的颜色，还是原来菌落的颜色，黄色或白色。
从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔已经没有原来菌落的颜色。
菌苔灰白色、表面湿润、光滑、前者不透明，后者透明。
图3.1四种菌落在斜面培养基上生长情况
右左向右依次为金黄，白色粉红，紫黑菌苔
4.细菌的形态学检查:
图4.1脓汁菌苔（左边为白色菌苔，右图为金黄色菌苔）
图4.2粪便菌苔（左图为粉红菌苔，右图为紫黑色菌苔）
镜下观察：
用普通平板，从浓汁标本中分离得到黄色、白色两种菌落，这两株细菌，显微镜油镜下均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌。
结合菌落色素，这两株葡萄球菌可能是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。
用伊红美蓝平板，从粪便标本分离、获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。
紫黑色菌落可能是能分解乳糖的非致病菌大肠埃希菌。
粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。
显微镜下，均为G-杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。
5、液体培养基接种
图5.1液体培养基接种结果
6.细菌的生化试验等:
（1）半固体穿刺接种法
图6.1半固体穿刺
结果观察及讨论：
表1.动力试验结果
菌苔半固体实验
紫黑细菌1+
紫黑细菌2-
粉红细菌1-
粉红细菌2-
+：
阳性-：
阴性
1、紫黑细菌1细菌自接种部位向四周移动、扩散生长，培养基呈云雾状或根须状混浊状态，有鞭毛。
但是实验时发现紫黑菌苔2无任何现象。
经过分析，应当是用接种针取菌苔时，操作者仅针尖未接触到菌苔，导致穿刺后无细菌的生长。
但是结合其他组的结果，我们认为紫黑菌苔应当是动力阳性的。
2、粉红细菌菌苔均沿着直线生长，可看出其无鞭毛。
（2）细菌的糖发酵试验
6.2糖发酵实验结果图.从左至右分别为：
（④粉红→乳糖③粉红→葡萄糖②紫黑→乳糖①紫黑→葡萄糖）
编号
菌苔
糖发酵管
反应现象
结果描述
符号
甲
紫黑
糖发酵管变黄色有气泡
分解X糖产酸又产气
⊕
乙
紫黑
糖发酵管变黄色有气泡
分解X糖产酸又产气
⊕
丙
粉红
糖发酵管变黄色无气泡
分解X糖产酸不产气
+
丁
粉红
④
糖发酵管变紫色无气泡
分解X糖产酸不产气
-
+：
产酸或阳性⊕：
产酸产气-：
阴性
紫黑细菌微型发酵关内液体变黄，产生气泡，气泡的高度分别为10mm和17mm，说明紫黑色菌苔既分解葡萄糖也分解乳糖，产酸产气；粉红细菌只分解葡萄糖，不产气，不分解乳糖。
（3）抗菌素敏感试验结果:
图6.
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