发酵工艺实验.docx

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发酵工艺实验

实验一菌种的传代培养

一、实验目的

1．掌握菌种传代培养的原理

2．掌握菌种传代培养的操作过程

二、实验原理

细胞在培养器中长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长并且活化细胞的代谢性能，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。

活化后的菌种经过扩大培养就会大量繁殖，把菌种通过逐级扩大培养，使其大量繁殖并保留生长更加良好的菌种。

传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法，同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。

三、实验器材

1．菌种：

金色链霉菌

2．培养基（麸皮培养基）：

麸皮36．0克；磷酸氢二胺3．0克；磷酸氢二钾0．2克；硫酸镁0．1克；琼脂15．0克；蒸馏水1．0升；ph7．0

3．其它：

电子天平；250ml三角瓶；电炉；灭菌锅；培养皿（5个）；试管；无菌操作台；酒精灯；接种环；涂布棒；报纸；细绳；棉塞；牛皮纸；玻璃棒。

四、实验步骤

使用培养皿培养菌种

1.按上述培养基配方配制250毫升培养基，装入一只三角瓶中，加热使药品溶解，用棉塞塞住瓶口，并用牛皮纸扎紧，以备灭菌。

2.把培养皿用报纸包好，细绳系牢，以备灭菌。

3.把物品放入灭菌锅中在121℃下灭菌15～20分钟，灭菌后放入已杀菌的无菌操作台中。

4.在无菌条件下，在每只培养皿中分别倒入培养基20ml左右，放平，冷却后备用。

5.待培养基冷却凝固后，在无菌条件下，选择一个生长良好的菌种，用接种环在平板培养基上接种，并用涂布棒将菌种均匀涂遍整个培养皿。

6.将接种好的平板做好标号后，将其放入29℃的培养箱中培养，倒置培养。

使用试管培养菌种

1．按上述培养基配方配制250毫升培养基，装入一只三角瓶中，加热使药品溶解，然后将其倒入试管用棉塞塞住瓶口，并用牛皮纸扎紧，以备灭菌。

2．把物品放入灭菌锅中在121℃下灭菌15～20分钟，灭菌后放入已杀菌的无菌操作台中。

3．将灭了菌的试管取出并斜放（保证足够的斜平面），待其冷却凝固。

接下来的步骤同培养皿的培养方法。

注意事项：

1．4和5步均为无菌实验。

2．传代培养周期为4～5天。

实验二发酵种子培养

一、实验目的

掌握发酵种子培养的原理和方法。

二、实验原理

种子扩大培养简称种子扩培是发酵工程的一个组成部分，其实指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。

其目的首先是出于接种量的需要与菌种的驯化，同时对于缩短发酵时间、保证生产水平也有帮助。

所以种子扩大培养的任务是为了得到纯而壮的培养物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。

对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢决定种子扩大培养的级数。

抗生素生产中，放线菌的细胞生长繁殖较慢，常采用二级或三级种子扩大培养；一般50t发酵罐多采用二级或三级发酵，有的也采用四级发酵如链霉素生产。

种子扩培所得的纯种培养物称为种子。

对于种子而言，应当具备以下要求：

总量及浓度能满足要求；生理状况稳定，个体与群体区隔明显；活力强，移种发酵后，能够迅速生长；无杂菌污染。

种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。

种龄的确定受到诸多因素的影响，如果种龄过短则菌体太少，如果种龄过长，则菌体易老化。

种子扩培的一般过程是：

斜面菌种→一级种子培养（摇瓶）→二级种子培养（种子罐）→发酵

对于种子制备过程，其大致可区分为实验室阶段和生产车间阶段，前期不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此将这一培养过程称为实验室阶段的种子培养。

而后期种子培养在种子罐里面进行，一般在工程上归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。

并非所有的种子扩大培养都采用从摇瓶到种子罐的二级发酵模式，其实际发酵级数受到发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。

种子培养基与发酵培养基的区别：

1种子培养基一般是基础培养基，含有微生物生长繁殖需要的基本营养物质，微生物生长过程中不需在添加营养素、改变PH值的外界条件；2发酵培养基多为营养培养基，添加特殊营养成分，且发酵过程中要调PH值，温度等外界条件。

三、实验器材

1．菌种：

金色链霉菌

2．培养基（％）：

葡萄糖4.2；氯化钠0.2；硫酸胺0.3；碳酸钙0.4；硫酸镁0.025；磷酸二氢钾0.025；ph6.0。

3．试剂：

蒸馏水

4．其它：

电子天平；三角瓶（250ml、100ml）；电炉；棉塞；牛皮纸；细绳；灭菌锅；无菌操作台；酒精灯；无菌吸管；摇床。

四、实验步骤

1．按上述培养基配方配制50毫升培养基，装入一只250毫升三角瓶中，加热使药品溶解后（保持低温加热），用棉塞塞住瓶口，并用牛皮纸扎紧，以备灭菌。

2．用一个100毫升的三角瓶装入蒸馏水，用棉塞塞住瓶口，并用牛皮纸扎紧，以备灭菌。

3．把物品放入灭菌锅中在115℃时灭菌15—20分钟，灭菌后放入已杀菌的无菌操作台中。

4．待培养基和无菌水冷却至适宜温度时，在无菌条件下，将两支斜面的孢子用无菌水制成悬浮液，用无菌吸管吸1ml接入摇瓶的培养基中。

5．将摇瓶放置在29℃、160r/min的摇床上培养22—24小时。

注意事项：

1．接种必须在无菌条件下进行。

2葡萄糖在超过115℃的时候就会发生变性，灭菌时必须特别注意，要有人看护。

实验三金霉素的发酵

一、实验目的

1．掌握摇瓶发酵的原理

2．掌握摇瓶发酵的操作过程

二、实验原理

1、发酵来源

发酵现象早巳被人们所认识，但了解它的本质却是近200年来的事。

英语中发酵一词fermentation是从拉丁语fervere派生而来的，原意为“翻腾”，它描述酵母作用于果汁或麦芽浸出液时的现象。

沸腾现象是由浸出液中的糖在缺氧条件下降解而产生的二氧化碳所引起的。

在生物化学中把酵母的无氧呼吸过程称作发酵。

我们现在所指的发酵早已赋予了不同的含义。

发酵是生命体所进行的化学反应和生理变化，是多种多样的生物化学反应根据生命体本身所具有的遗传信息去不断分解合成，以取得能量来维持生命活动的过程。

发酵产物是指在反应过程当中或反应到达终点时所产生的能够调节代谢使之达到平衡的物质。

实际上，发酵也是呼吸作用的一种，只不过呼吸作用最终生成CO2和水，而发酵最终是获得各种不同的代谢产物。

因而，现代对发酵的定义应该是：

通过微生物（或动植物细胞）的生长培养和化学变化，大量产生和积累专门的代谢产物的反应过程。

2、发酵的定义

（1）微生物生理学严格定义的“发酵”：

有机物被生物体氧化降解成氧化产物并释放能量的过程统称为生物氧化。

微生物生理学把生物氧化区分为呼吸和发酵，呼吸又可进一步区分为有氧呼吸和无氧呼吸。

因此，发酵是生物氧化的一种方式。

发酵是这样一种生物氧化方式：

在没有外源最终电子受体的条件下，化能异养型微生物细胞对能源有机化合物的氧化与内源的（已经经过该细胞代谢的）有机化合物的还原相耦合，一般并不发生经包含细胞色素等的电子传递链上的电子传递和电子传递磷酸化，而是通过底物（激酶的底物）水平磷酸化来获得代谢能ATP；能源有机化合物释放的电子的一级电子载体NAD，以NADH的形式直接将电子交给内源的有机电子受体而再生成NAD，同时将后者还原成发酵产物（不完全氧化的产物）。

细胞中的NAD是有限的，如果作为一级电子载体的辅酶NAD不能得到再生，就不能被回用，有效的电子载体就会愈来愈少，脱氢反应就不能持续进行下去了。

因此辅酶NAD的再生是生物氧化（包括发酵）继续进行下去的必要条件。

（2）专业词汇“发酵（fermentation）”

“发酵”这个词汇在生活中往往是人联想到发面制作大饼、油条、馒头、包子，或者联想到食品酸败物品霉烂。

“发酵”作为专业词汇其含义不但覆盖发面制作大饼、油条、馒头、包子，更重要的是指用发酵的手段工业化生产酒及酒精饮料、食品及食品添加剂、饲料及饲料添加剂、药品、化工材料等等。

（3）工业生产上定义的发酵——“工业发酵”

工业生产上笼统地把一切依靠微生物的生命活动而实现的工业生产均称为“发酵”。

这样定义的发酵就是“工业发酵”。

工业发酵要依靠微生物的生命活动，生命活动依靠生物氧化提供的代谢能来支撑，因此工业发酵应该覆盖微生物生理学中生物氧化的所有方式：

有氧呼吸、无氧呼吸和发酵。

近百年来，随着科学技术的进步，发酵技术发生了划时代的变革，已经从利用自然界中原有的微生物进行发酵生产的阶段进入到，按照人的意愿改造成具有特殊性能的微生物以生产人类所需要的发酵产品的新阶段。

3、发酵的特点

发酵和其他化学工业的最大区别在于它是生物体所进行的化学反应。

其主要特点如下：

1）发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学反应，反应安全，要求条件也比较简单。

2）发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为主，只要加入少量的有机和无机氮源就可进行反应。

微生物因不同的类别可以有选择地去利用它所需要的营养。

基于这—特性，可以利用废水和废物等作为发酵的原料进行生物资源的改造和更新。

3）发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的，反应的专一性强，因而可以得到较为单—的代谢产物。

4）由于生物体本身所具有的反应机制，能够专一性地和高度选择性地对某些较为复杂的化合物进行特定部位地氧化、还原等化学转化反应，也可以产生比较复杂的高分子化合物。

5）发酵过程中对杂菌污染的防治至关重要。

除了必须对设备进行严格消毒处理和空气过滤外，反应必须在无菌条件下进行。

如果污染了杂菌，生产上就要遭到巨大的经济损失，要是感染了噬菌体，对发酵就会造成更大的危害。

因而维持无菌条件是发酵成败的关键。

6）微生物菌种是进行发酵的根本因素，通过变异和菌种筛选，可以获得高产的优良菌株并使生产设备得到充分利用，也可以因此获得按常规方法难以生产的产品。

7）工业发酵与其他工业相比，投资少，见效快，开可以取得显著的经济效益。

基于以上特点，工业发酵日益引起人们重视。

和传统的发酵工艺相比，现代发酵工程除了上述的发酵特征之外更有其优越性。

除了使用微生物外，还可以用动植物细胞和酶，也可以用人工构建的“工程菌’来进行反应；反应设备也不只是常规的发酵罐，而是以各种各样的生物反应器而代之，自动化连续化程度高，使发酵水平在原有基础上有所提高和和创新。

4、发酵的类型

根据发酵的特点和微生物对氧的不同需要，可以将发酵分成若干类型：

1）按发酵原料来区分：

糖类物质发酵、石油发酵及废水发酵等类型。

2）按发酵产物来区分：

如氨基酸发酵、有机酸发酵、抗生素发酵、酒精发酵、维生素发酵等。

3）按发酵形式来区分，则有：

固态发酵和深层液体发酵。

4）按发酵工艺流程区分则有：

分批发酵、连续发酵和流加发酵。

5）按发酵过程中对氧的不同需求来分，一般可分为：

厌氧发酵和通风发酵两大类型。

三、实验器材

1．菌种：

金色链霉菌

2．培养基（％）：

葡萄糖4.2；氯化钠0.2；硫酸胺0.3；碳酸钙0.4；硫酸镁0.025；磷酸二氢钾0.025；pH6.0。

3．试剂：

蒸馏水

4．其它：

电子天平；三角瓶（500ml）；纱布；牛皮纸；细绳；灭菌锅；无菌操作台；酒精灯；无菌吸管；摇床。

四、实验步骤

1．按上述培养基配方配制50毫升培养基，装入一只三角瓶中，加热使药品溶解，用纱布塞住瓶口，并用牛皮纸扎紧，以备灭菌。

2．把物品放入灭菌锅中在121℃下灭菌15～20分钟，灭菌后放入已杀菌的无菌操作台中。

3．用吸管从种子培养基将菌液接入灭菌后的培养基中，接种量为2%

4．将摇瓶放置在29℃、160r/min的摇床上培养。

5．定时取样，以备后