酶工程实验报告二纤维素酶最适反应温度的测定.docx
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酶工程实验报告二纤维素酶最适反应温度的测定
本科学生实验报告
学号104120440姓名孙永升
学院生命科学学院专业、班级10生物技术
实验课程名称酶工程<实验>
教师及职称李俊俊<讲师>
开课学期2012至2013学年第二学期
填报时间2013年4月17日
云南师范大学教务处编印
实验名称
实验方式
小组成员
实验二、纤维素酶最适反应温度的测定
小组合作
XX
XX
XX
XX
1、实验目的
通过实验准确测定纤维素酶最适反应温度。
处理实验数据，学会统计作图分析。
2、实验仪器、试剂和溶液：
A2仪器：
紫外分光光度计、比色皿（3个）、恒温水浴锅（4台）、试管架（1个）、1ml移液管（1根）、10ml移液管（1根）、玻璃棒（1根）、1000ml烧杯（1个）、500ml烧杯（2个）、1000ml容量瓶（1个）、洗耳球（1个）、标签（若干）等。
B2试剂和溶液
①DNS试剂（CMCA-DNS）：
称取3,5一二硝基水杨酸（10士0.1）g，置于约600mL水中，逐渐加入氢氧化钠log，在50℃水浴中（磁力）搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200g、苯酚（重蒸）2g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000mL，过滤。
贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。
②柠檬酸缓冲液，0.05mol/LpH4.8（适用于酸性纤维素酶）：
称取一水柠檬酸4.83g,溶于约750mL水中，在搅拌情况下，加入柠檬酸三钠7.94g,用水定容至1000mL。
调节溶液的pH到（4.8士0.05）备用。
③磷酸缓冲液，0.1mol/LpH6.0（适用于中性纤维素酶）：
分别称取一水磷酸二氢钠121.0g和二水磷酸氢二钠21.89g，将其溶解在IOL去离子水中。
调节溶液的pH到（6.0士0.05）备用。
溶液在室温F可保存一个月。
纤维素酶液（pH4.8和pH6.0）。
3、实验原理及实验流程或装置示意图：
A3原理:
温度对酶的影响具有双重作用。
一方面，温度加速酶促反应的速度；另一方面酶是蛋白质，温度升高会引起酶蛋白的变性。
因此，在较低温度范围内，酶促反应随温度升高而增大，超过一定温度后，反应速度下降。
酶促反应速度达到最大值时的温度称为酶反应的最适温度。
如果保持其它条件恒定，而在一系列变化的温度下测定酶活力，以温度为横坐标，OD540为纵坐标，可得到一条温度-酶活力曲线，从中可求得纤维素酶的最适温度。
酶液的稀释
B3实验流程:
↓
不同温度的水浴反应30min
↓
沸水浴10min
↓
迅速冷却至室温,用水定容至25ml
540nm处测吸光度（OD540）
↓
↓
绘制温度-酶活力曲线
求出纤维素酶最适温度
4、实验方法步骤、操作流程及注意事项：
实验中分为两组：
pH4.8与pH6.0。
pH4.8与pH6.0的酶液温度在50和60℃稀释到10000倍，其余温度范围的酶液稀释5000倍即可。
A4、实验方法
本实验在室温下20℃至90℃之间选择不同的温度测定酶活力，以找出在此条件下的最适温度。
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
温度
室温20℃
30℃
40℃
50℃
60℃
70℃
80℃
90℃
B4、待测酶液的制备
称取固体纤维素酶1g，精确到0.1mg，用蒸馏水溶解。
准确稀释定容，待测。
C4.操作步骤:
实验中分为两组：
pH4.8与pH6.0。
pH4.8与pH6.0的酶液温度在50和60℃稀释到10000倍，其余温度范围的酶液稀释5000倍即可。
①取三支25mL刻度具塞试管（一支空白管，二支样品管）。
②分别向四支管中，准确加入用相应pH缓冲溶液配制的CMC-Na溶2.00mL。
（不可黏在试管壁上）
③分别准确加入稀释好的待测酶液0.50mL于三支样品管中（空白管不加），用漩涡混匀器混匀，盖塞。
④将试管同时置于相应温度水浴中，准确计时，反应30min，取出。
⑤迅速、准确地向各管中加入DNS试剂3.0mL，于空白管中准确加入稀释好的待测酶液0.50mL,摇匀。
将三支管同时放入沸水浴中，准确计时，加热10min，取出，迅速冷却至室温，用水定容至25mL。
⑥以空白管（对照液）调仪器零点，在分光光度计波长540nm下，用10mm比色杯，分别测量三支样品管中样液的吸光度，取平均值。
D4实验注意事项
反应温度准确，酶液准确稀释。
试管上编号：
贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；
移液管使用时量取精准，保证结果可靠准确。
精确记时：
每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；
避免试管进水：
煮沸和用流水冲洗时；
5实验处理
A5实验数据：
如表一：
酶液稀释倍数
温度（℃）
相应pH下OD540值
pH4.8pH6.0
室温20
5000倍
0.2205
0.0685
30
0.2845
0.2475
40
0.2830
0.3400
50
10000倍
0.3830
0.2205
60
0.3955
0.1890
70
5000倍
0.5025
0.1450
80
0.4390
0.0890
90
0.0820
0.0490
表一
B5实验结果处理：
B5.1葡萄糖标准曲线如图1：
图1标准曲线
葡萄糖标准曲线如上图所示，得回归直线方程y=kx-0.0747，k=0.7023，R2=0.9992>0.99，该标准曲线相关性很好。
式中Y表示表示测定的吸光度（OD）值，X表示还原糖的浓度,0.0747表示补偿参数。
B5.2纤维素CMCA-DNS酶活力计算：
X=A×l/0.5×n×2（u/mL）
葡萄糖标准曲线为y=0.7023x–0.0747，横坐标为葡萄糖浓度，纵坐标为OD540nm值，因此：
A=（OD540nm+0.0747）/0.7023（mg）,其中OD540nm=0.481,n为酶液稀释倍数。
还原糖A=（OD540nm+0.0747）/0.7023（mg）=0.7913（mg）,
X=A×l/0.5×n×2（u/mL）
B5.3实验数据处理：
如表二
酶液稀释
PH
温度（℃）
吸光度OD540nm
还原糖（mg）
酶活（u/g）
5000
4.8
20
0.2205
0.4203
8406
30
0.2845
0.5115
10230
40
0.2830
0.5093
10186
10000
50
0.3830
0.6517
26068
60
0.3955
0.6695
26780
5000
70
0.5025
0.8219
16438
80
0.4390
0.7315
14630
90
0.0820
0.2231
4462
5000
6.0
20
0.0685
0.2039
4078
30
0.2475
0.4588
9176
40
0.3400
0.5905
11810
10000
50
0.2205
0.4203
16812
60
0.1890
0.3755
15020
5000
70
0.1450
0.3129
6258
80
0.0890
0.2330
4660
90
0.0490
0.1761
3522
（注：
本实验室温即设定温度：
20℃）表二
B5.4SPSS统计分析作图：
图二
图三
C5分析与讨论：
分析：
此次实验中为测定纤维素酶活最适反应温度，测定pH4.8和pH6.0时不同温度下的纤维素最适应反应酶活。
最后根据温度与酶活力作酶活与温度曲线，如：
图二、图三。
可以初步得出结论：
pH4.8时，纤维素酶活在60℃左右酶活最大；
pH6.0时，纤维素酶活在50℃左右酶活最大。
讨论：
在pH4.8与pH6.0不同的环境下时，纤维素酶活差别极大，从总体来看，酸性条件下酶活高于中性条件下的酶活。
说明纤维素酶反应环境属酸性条件，温度60℃左右，另外温度的范围对纤维素酶活力影响总体呈现趋势：
pH一定时，随温度的逐渐升高，酶活表先升，到达最大，之后随温度升高逐渐降低，最后当温度达限定酶活—既酶失活变性，不在变化。
也表现出酶（蛋白质）生物特性。
谭占仙（2009）在研究pH值、温度对纤维素酶活力的影响1时测定结果为：
酸性纤维素酶最适宜的pH值为4.85，温度为60℃或65℃碱性纤维素酶最适宜的pH值为6.0，温度为60℃或65℃，黄燕华等（2004）2纤维素酶的酶活测定最适为pH4.8,最适温度为50℃,最适反应时间为60min,同时需要设置以有底物无酶或有酶无底物的空白作为对照。
与本次试验结果相近。
由本实验中纤维素酶活在相对pH环境下得出一个酶活最适温度大概范围，为了得到更加准确的温度应再在测温度范围下，逐步递减温度梯度，即做更准确的验证试验：
测定pH4.860℃左右做纤维素酶活最适温度验证：
编号
1
2
3
4
5
温度
50℃
55℃
60℃
65℃
70℃
测定pH6.050℃左右做纤维素酶活最适温度验证：
编号
1
2
3
4
5
温度
40℃
45℃
50℃
55℃
60℃
6、实验小结
掌握了纤维酶活最适温度的测定方法，加强实验动手能力，小组合作意识。
测酶活时严格控制影响到的因素，如反应温度、时间、pH等。
量取液体时精确，如缓冲液、酶液、DNS试剂等。
对反应后的实验结果认真仔细观察做好记录。
养成科学分析问题的习惯。
改进：
在实验前应对酶和底物预先预热来提高准确性。
7实验思考题：
纤维素酶的耐受性如何测定？
答：
首先在pH选定下测定出纤维素酶的最适反应温度，本实验已做；
在最适温度下，将待测样品液（纤维素酶液和底物混合液）5.5ml分别放置在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃不同温度下保温30min。
再将待测样品放置在最适温度下，按照本次试验方法测不同温度保温之后的酶活力。
绘制相对活力曲线图。
8参考文献：
[1]谭占仙.研究pH值、温度对纤维素酶活力的影响[J].黑龙江科技信息，2009，6：
10.
[2]黄燕华,冯定远.DNS法测定纤维素酶活性的适宜反应温度pH值和反应时间的研究[Z].中国畜牧兽医学会动物营养学分会——第九届学术研讨会论文集，中国重庆,2004-08.
指导老师评语及得分：
签名：
2013年04月日
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