常 用 实 验 方 法.docx

常 用 实 验 方 法.docx

《常 用 实 验 方 法.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《常 用 实 验 方 法.docx（36页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

常用实验方法

常用实验方法

实验设计

一、实验设计的意义

实验设计是科学研究计划内关于研究方法与步骤的一项内容。

在医学科研工作中，无论实验室研究、临床疗效观察或现场调查，在制订研究计划时，都应根据实验的目的和条例，结合统计学的要求，针对实验的全过程，认真考虑实验设计问题。

一个周密而完善的实验设计，能合理地安排各种实验因素，严格地控制实验误差，从而用较少的人力、物力和时间，最大限度地获得丰富而可靠的资料。

反之，如果实验设计存在着缺点，就可能造成不应有的浪费，且足以减损研究结果的价值。

总之，实验设计是实验过程的依据，是实验数据处理的前提，也是提高科研成果质量的一个重要保证。

众所周知，科研工作者在进行医药方面的科学研究之前，需要制定完善的统计研究设计方案，那么什么样的设计方案才称得上是完善的呢？

一般来说，完善的设计方案需具备以下几个条件：

实验所需的人力、物力和时间资源；实验设计的“三要素”和“六原则”均符合专业和统计学要求，对实验数据的收集、整理、分析等有一套规范的规定和正确的方法。

而其中准确把握统计研究设计的“三要素和六原则”，是科学实验设计的核心。

二、实验设计的“三要素”

1．实验对象：

实验所用的材料即为实验对象。

如用小鼠做实验，小鼠就是本次实验的实验对象，或称为受试对象。

实验对象选择的合适与否直接关系到实验实施的难度，以及别人对实验新颖性和创新性的评价。

一个完整的实验设计中所需实验材料的总数称为样本含量。

最好根据特定的设计类型估计出较合适的样本含量。

样本过大或过小都有弊端。

   2．实验因素：

所有影响实验结果的条件都称为影响因素，实验研究的目的不同，对实验的要求也不同。

影响因素有客观与主观，主要与次要因素之分。

研究者希望通过研究设计进行有计划的安排，从而能够科学地考察其作用大小的因素称为实验因素（如药物的种类、剂量、浓度、作用时间等）；对评价实验因素作用大小有一定干扰性且研究者并不想考察的因素称为区组因素或称重要的非实验因素（如动物的窝别、体重等）；其他未加控制的许多因素的综合作用统称为实验误差。

最好通过一些预实验，初步筛选实验因素并确定取哪些水平较合适，以免实验设计过于复杂，实验难以完成。

   3．实验效应：

实验因素取不同水平时在实验单位上所产生的反应称为实验效应。

实验效应是反映实验因素作用强弱的标志，它必须通过具体的指标来体现。

要结合专业知识，尽可能多地选用客观性强的指标，在仪器和试剂允许的条件下，应尽可能多选用特异性强、灵敏度高、准确可靠的客观指标。

对一些半客观（比如读pH试纸上的数值）或主观指标（对一些定性指标的判断上），一定要事先规定读取数值的严格标准，只有这样才能准确地分析自己的实验结果，从而也大大提高了自己实验结果的可信度。

三、实验设计的“六原则”

1.随机原则：

即运用“随机数字表”实现随机化；运用“随机排列表”实现随机化；运用计算机产生“伪随机数”实现随机化。

尽量运用统计学知识来设计自己的实验，减少外在因素和人为因素的干扰。

2.对照原则：

空白对照组的设立——只有通过对照的设立我们才能清楚地看出实验因素在当中所起的作用。

当某些处理本身夹杂着重要的非处理因素时，还需设立仅含该非处理因素的实验组为实验对照组；历史或中外对照组的设立一一这种对照形式应慎用，其对比的结果仅供参考，不能作为推理的依据；多种对照形式同时并存。

3.重复原则：

所谓重复原则，就是在相同实验条件下必须做多次独立重复实验。

一般认为重复5次以上的实验才具有较高的可信度。

4.平衡原则：

一个实验设计方案的均衡性好坏，关系到实验研究的成败。

应充分发挥具有各种知识结构和背景的人的作用，群策群力，方可有效地提高实验设计方案的均衡性。

在实验设计的过程中要注意时间上的分配，只有在时间上分配好了，才不会出现一段时间特别忙而一段时间特别闲的情况。

5.弹性原则：

所谓空格，指的是在时间分配图上留有空缺。

适当的空缺是非常必要的，只有这样才能富有弹性的实施实验计划，并不断地调整好自己的实验进度。

6.最经济原则：

不论什么实验，都有它的最优选择方案，这包括在资金的使用上，也包括人力时间的损耗上，必要时可以预测一下自己实验的产出和投入的比值，这个比值越大越好，当然是以你所拥有的实验条件作基础的。

组织切片的制备

【目的】

组织标本必须首先被制成组织切片，再经过染色处理，然后才能在显微镜下进行临床诊断和科学研究。

【原理】

苏木素染色结合伊红染色是常规组织学染色技术，也称为H&E染色。

苏木素是碱性染色，细胞核被染成深紫或兰色，常用作核染色；伊红是酸性染色，细胞浆染呈红色，常用作胞浆染色。

【材料】

1.试剂和溶液

（1）2-甲基丁醇（异戊醇）

（2）干冰

（3）O.C.T.（Tissue-Tek,SAKURA）

（4）冰冻或石蜡组织块

（5）酸性Harris苏木素染料

（6）1％酸性酒精

70％酒精99ml

浓盐酸1ml

（7）醇溶性伊红染料

（8）酒精

（9）二甲苯

（10）树脂封片液

2.设备

（1）塑料模具

（2）长镊子

（3）SuperfrostPlus玻片（FisherScientific）

（4）盖玻片

（5）刀片（一次性或非一次性）；

（6）冰冻或石蜡切片机（Leica,Micorm或其它）

【方法】

方法1、冰冻切片的制备

一、准备冰冻组织

1.用塑料或不锈钢容器盛上2-甲基丁醇（异戊醇），然后不时放入小块干冰，使温度降至-40ºC到-50ºC,并保持低温。

2.标记塑料模具并将O.C.T灌入模具，覆盖其底部。

3.收集组织标本。

快速，轻柔和准确地取材以保证组织标本的质量，是获得高质量免疫标记染色的最基本条件。

4.将取下的组织标本置入灌有O.C.T的模具，用O.C.T灌满模具，直至标本完全被其覆盖。

组织标本应尽量贴近模具底部，使标本在切片时易于暴露。

酌情调整组织标本的位置。

用长镊子挟住模具，放入冷却了的2-甲基丁醇（异戊醇）溶液中。

为了避免产生空泡，先将模具底部触及溶液，盛有标本的模具从底部开始向表面冷冻，然后将整个模具放入溶液中5-10分钟。

（1）多数取下的组织标本可以直接放入模具。

如标本沾有大量液体，应当用吸水性能好的纸沾去多余的液体，然后冷冻包埋。

不要用溶液清洗标本。

（2）需要先固定处理的组织标本，可以在完成固定后，用10％到30％蔗糖-缓冲液处理，再冷冻包埋。

5.将冻好的组织标本保存在-80ºC冰箱以待使用。

二、制作冰冻切片

1.切片前先将冰冻组织标本从-80ºC冰箱里取出，放在冰冻切片机（-20ºC）内复温。

2.用O.C.T.将冰冻组织块冻在冰冻标本盘上，然后将其固定在切片机上。

调整好组织块平面与刀片的位置后，开始切片。

直至切到预想的部位后，开始收集切片。

根据研究目的的不同，切片可选择不同的厚度。

3-6µm是常用的切片厚度，也可以是25-50µm厚。

3.切片在室温下晾干，然后用理想的固定液固定。

如果选用冷丙酮或丙酮/甲醇，切片在经过20分钟固定，并在室温下晾干后，可以直接用于染色，或者将其放在密封的切片盒并存入-80ºC冰箱，以待使用。

4.余下的冰冻组织块，可用O.C.T.覆盖其暴露面，然后存入-80ºC冰箱以待下次使用。

方法2、石蜡切片的制备

1．收集组织标本并将其固定。

10％福尔马林缓冲液是最常用固定液，也可根据实验的需要选用其它固定液。

根据标本的大小，将其在室温下固定8-24小时，或更长。

标本的厚度以不超过3mm最佳。

完成固定后，标本即可进行下一步的处理。

2．制作石蜡组织块需要专用的设备，以及复杂的组织处理过程。

通常由组织学或病理学实验室完成。

3．石蜡切片。

准备好盛有40ºC蒸馏水的水浴箱，把包有组织的石蜡块固定在石蜡切片机上，根据需要切成一定的厚度（常用4-6μm），将切片浮在水浴箱的水面上，再转到SuperfrostPlus片子上。

切片在室温下自然风干过夜，贮存待用。

苏木素-伊红（HE）染色

苏木素-伊红染色即通常所说的普通染色或常规染色，又称H.E染色。

是目前应用最广泛的染色方法。

在病理诊断、教学和科研中具有重要的价值。

适合于各种固定、包埋方法制作的石蜡切片以及冰冻切片等。

且切片不易褪色，可以长期保存。

HE染色主用于显示各种组织的正常成份和病变的一般形态结构，各种组织或细胞的一般形态、结构特点和病变的发生、发展及修复的全过程，在质量较佳的HE染色切片上，基本上都可以观察到，从而进行判定或研究。

【实验步骤】

1.二甲苯脱蜡3-5分钟。

×2

2.95%酒精3-5分钟。

×2

3.水洗。

4.苏木素3-15分钟。

根据所配制的苏木素染液决定。

5.水洗。

6.分化。

7.流水冲洗或弱碱性溶液返兰。

8.伊红3-15分钟。

根据所配制的伊红染液决定。

9.95%酒精脱水1-2分钟。

×2

10.无水酒精脱水1-2分钟。

×2

11.二甲苯透明1-2分钟。

×2

12.中性树胶封固。

免疫组织化学染色方法（S-P法）

免疫细胞化学（immunocytochemistry）是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。

抗原主要为大分子或与大分子相结合的小分子；抗体则是由浆细胞针对特定的抗原分泌的γ球蛋白。

如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。

常用的标记物有荧光素和酶。

荧光素标记的称为免疫荧光法（immunofluorescenttechnique），常用的萤光素有异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate）、罗丹明（rhodamine）等。

酶标记的称为酶标免疫法（enzyme-labeledantibodymethod），常用的酶有辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase），酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。

抗体与抗原的结合方法可分为直接法和间接法两种，直接法是将带有标记的抗体与抗原反应，显示出抗原存在的部位。

而间接法则是在抗体抗原初级反应的基础上，再用带标记的次级抗体同初级抗体反应，从而使初级反应得到放大，显示增强。

【实验步骤】

1、石蜡切片4-5μm；

2、切片脱蜡至水；

3、3%甲醇双氧水阻断室温10分钟；

4、0.01M（PH7.2）磷酸盐缓冲液（PBS）洗5分钟3次；抗原修复，加入0.01M（PH6.0）柠檬酸缓冲液置微波炉中10档3分30秒，之后可进行2档1分至1分30秒微波维持。

5、自然冷却后PBS洗，加二抗同种动物非免疫血清封闭，室温10分钟；

6、免洗，倾出血清，分别滴加配制好的一抗4℃过夜；

7、PBS洗5分钟3次；

8、滴加生物素标记的第二抗体，室温孵育10分钟；

9、PBS洗5分钟3次；

10、滴加链亲和素-过氧化物酶，室温10分钟；

11、PBS洗5分钟3次；

12、新鲜配制的DAB溶液显色3-10分钟；

13、自来水洗，苏木素浅染细胞核，分化。

自来水冲洗返兰，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

细胞培养

一、操作规程：

1.实验前,无菌室及无菌操作台用紫外灯照射30-60分钟灭菌,用70％酒精擦拭无菌操作台面,并开启无菌操作台风机运转10分钟后,才可开始实验操作.每次操作只处理一株细胞,以免造成细胞交叉污染.实验结束后,将实验物品带出工作台。

如需要继续进行下一个实验,则用70％酒精擦拭无菌操作台面,再让无菌操作台风机运转10分钟后,才可进行下一个实验操作。

2.无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞,必要物品,如试管架,移液器或吸管头等可以暂时放置,其它实验用品用完后应及时移出,以利气体流通.实验用品要用70％酒精擦拭后才能带入无菌操作台内。

实验操作应在操