生化分离技术复习1.docx

生化分离技术复习1.docx

《生化分离技术复习1.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生化分离技术复习1.docx（9页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

生化分离技术复习1

绪论.

生化分离技术：

是指从含有目标产物的发酵液、酶反应液或动植物细胞培养液中，提取、精制并加工制成高纯度的、符合规定要求的各种生物技术产品的技术，又称为下游加工技术。

生物技术产品：

是指在生产过程应用微生物发酵技术、酶反应技术、动植物细胞培养技术等生化反应技术制得的产品。

生物技术产品有哪些特点：

生物技术产品有些是胞内产品，有些是胞外产物;通常是由产物浓度很低的发酵液或培养液中提取的;生物技术产品的稳定性差，易随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白质水解、自身水解等;生物技术产品的生产多为分批操作，生物变异性大，各批发酵液或培养液不尽相同。

生化分离技术按其分离原理可分为机械分离与传质分离两大类。

生化分离过程主要包括哪几个方面？

生化分离过程主要包括四个方面：

①原料液的预处理和固液分离；②初步纯化（提取）；③高度纯化（精制）；④产品加工这四个步骤。

第一章固液分离技术

排斥电位和产生吸附架桥作用的双重机制是絮凝的主要原因。

发酵液的相对纯化方法有哪些？

固液分离的目的：

除去固体杂质，得到溶液；分离掉溶液获得固体。

固液分离方法：

过滤、沉降

改善过滤性能的方法工艺上一般采用如下方法：

降低混合液粘度、增大被分离颗粒的粒度、加入助滤剂、提高离心机的转速或提高操作压力、增大真空度、降低滤饼层厚度、除去滤饼

第二章细胞破碎

细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏微生物菌体的细胞壁或细胞膜，释放其中的目标产物。

细胞破碎的方法有哪些？

各有何特点？

一、球磨破碎特点：

适用范围较广；但有效能量利用率很低，设计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力；影响破碎率的操作参数较多，过程优化设计较复杂。

二、高压匀浆法特点：

适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎，不宜用于团状或丝状菌的破碎，易堵塞；由于操作中温度会升高，需对料液作冷却处理，保护目的产物活性。

三、超声破碎法特点：

是很强烈的破碎方法；适用范围广；但有效能量利用率极低，对冷却要求相当苛刻，不易放大，多在实验室使用。

四、 酶溶法特点：

不同的菌体细胞由于细胞壁化学组成不同应选用不同的酶处理。

优点：

①对设备的要求低，能耗小；②抽提的速率和收率高；③产品的完整性好；④对pH值和温度等外界条件要求低；⑤由于细胞壁被溶解，不残留碎片，有利于提纯。

但是酶溶法受酶的费用限制。

酶溶法的缺点：

溶酶价格高，溶酶法通用性差，产物抑制的存在。

五、化学破碎

●对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；

●细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。

●通用性差；

●时间长，效率低；

●有些化学试剂有毒。

形成包含体的因素主要有以下几个方面：

♦重组蛋白的表达率过高，超过了细菌的正常代谢，由于细菌的蛋白水解能力达到饱和，导致重组蛋白在细胞内沉淀下来；

♦由于合成速度太快，以致没有足够时间进行肽链折叠，二硫键不能正确配对，导致重组蛋白溶解度变小；

蛋白质的复性

◆复性是指变性的包涵体蛋白质在适当条件下使伸展的肽键形成特定三维结构，使无活性的分子成为具有特定生物学功能的蛋白质。

◆复性的方法：

稀释复性、透析复性、超滤复性、层析柱复性、膨胀床吸附复性、温度跳跃式复性、双水相法、反胶团法

第3章萃取和浸取技术.

用溶剂从溶液中抽提物质叫液-液萃取，也称溶剂萃取。

经典的液-液萃取指的是有机溶剂萃取.

⏹液-液萃取过程机理主要有以下四种类型：

⏹

（1）简单分子萃取（物理萃取）

⏹

（2）中性溶剂络合萃取

⏹（3）酸性阳离子交换萃取

⏹（4）离子络合萃取

影响萃取操作的因素：

a.温度温度↑互溶性增大；温度↓产物稳定性提高，粘度增加，扩散性能减小。

b.pH值影响分配系数，影响物质解离情况

c.溶媒比溶媒比＝溶媒体积/萃取体积溶媒比↑萃取效果↑溶媒回收费用↑

d.盐分无机盐类如硫酸铵、氯化钠等一般可降低产物在水中的溶解度而使其更易于转入有机溶剂相中，另一方面还能减小有机溶剂在水相中的溶解度。

盐分↑分配系数↑

带溶剂是指能和产物形成复合物，促使产物更易溶于有机溶剂相中，在一定条件下又要容易分解的物质。

有机溶剂萃取的不足：

Ø许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂；

Ø蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。

双水相萃取的优点：

1使固液分离和纯化两个步骤同时进行，一步完成；

2适合热敏物质的提取，主要是胞内酶；

3亲水性聚合物加入水中，形成两相，在这两相中，水分都占大比例（85～95％），这样生物活性蛋白质在两相中不会失活，且以一定比例分配于两相中。

影响双水相萃取的因素

1、聚合物及其相对的分子量同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加。

2.pH的影响

3.离子环境对蛋白质在两相体系分配的影响

4.温度的影响

超临界流体（SCF）萃取

⏹是利用超临界流体作为萃取剂，对物质进行溶解和分离的过程。

超临界流体（SCF）是处于临界温度和临界压力以上的非凝聚性的高密度流体。

什么是反胶团？

反胶团萃取的特点是什么？

反胶团（reversedmicelles）是表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发地向内聚集而成的，内含微小水滴的，空间尺度仅为纳米级的集合型胶体。

⏹反胶团的微小界面和微小水相具有两个特异性功能：

①具有分子识别并允许选择性透过的半透膜的功能；

②在疏水性环境中具有使亲水性大分子如蛋白质等保持活性的功能。

⏹反胶团萃取技术的突出优点

①有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性；

②分离、浓缩可同时进行，过程简便；

③能解决蛋白质（如胞内酶）在非细胞环境中迅速失活的问题；

④表面活性剂往往具有细胞破壁功效，可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶；

⑤成本低，溶剂可反复使用等。

第四章沉淀技术

影响蛋白质溶解度的外部因素主要有温度、pH、介电常数和离子强度。

影响蛋白质溶解度的主要因素分成蛋白质性质和溶液性质两类。

球状蛋白质的表面多亲水基团

由于水化层和双电层这两种稳定的因素，使蛋白质溶液成为亲水的胶体溶液。

由于水化膜和双电子层的存在，蛋白质颗粒彼此不能接近，因而增加了蛋白质溶液的稳定性，阻碍蛋白质胶粒从溶液中沉淀出来。

生化分离纯化中最常用的几种蛋白质的沉淀方法是：

盐析法（中性盐沉淀）、有机溶剂沉淀、选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）、等电点沉淀、有机聚合物沉淀、聚电解质沉淀法、金属离子沉淀法。

（任选三种）

影响蛋白质盐析沉淀的因素有哪些：

①蛋白质的浓度中性盐沉淀蛋白质时，溶液中蛋白质的实际浓度对分离的效果有较大的影响。

通常高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度即可将其沉淀下来，但若蛋白质浓度过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。

对低浓度的蛋白质，要使用更大的硫酸铵饱和度，但共沉淀作用小，分离纯化效果较好，但回收率会降低。

②pH值对盐析的影响蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。

改变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。

远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。

③温度的影响温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大，但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。

在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随温度升高而增加的。

多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度降低而下降。

低浓度样品要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀，且样品的损失较大，即回收率低，具有生物活性的样品易产生稀释变性。

有机溶剂沉淀法基本原理是什么？

分析影响沉淀效果的因素。

主要是降低水溶液的介电常数，溶剂的极性与其介电常数密切相关，极性越大，介电常数越大，如20℃时水的介电常数为80，而乙醇和丙酮的介电常数分别是24和21.4，因而向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。

另一方面，由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。

①温度　多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度降低而下降。

②样品浓度　低浓度样品要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀，且样品的损失较大，即回收率低，具有生物活性的样品易产生稀释变性。

但对于低浓度的样品，杂蛋白与样品共沉淀的作用小，有利于提高分离效果。

高浓度的样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大，分离效果下降。

③pH值有机溶剂沉淀适宜的pH值，要选择在样品稳定的pH值范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低的pH值，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。

④离子强度离子强度是影响有机溶剂沉淀生物大分子的重要因素。

盐浓度太大或太小都有不利影响，通常溶液中盐浓度以不超过5％为宜，少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了有机溶剂沉淀蛋白质的效果，通常是在低盐或低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。

有机溶剂沉淀法有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。

第五章吸附及离子交换

什么是吸附？

吸附的种类有哪些？

利用吸附剂对液体或气体中某一（些）组分具有选择性吸附的能力，使其富集在吸附剂表面。

实质是溶质从液相或气相转移到吸附剂表面的过程。

⏹物理吸附吸附剂和吸附质之间的作用力是分子间引力（范德华力）。

⏹化学吸附利用吸附剂与吸附质之间的电子转移，生成化学键而实现物质的吸附。

⏹交换吸附吸附表面如为极性分子或离子所组成，则它会吸引溶液中带相反电荷的离子而形成双电层，这种吸附称为极性吸附。

影响吸附的主要因素

⏹吸附剂的性质

⏹吸附质的性质

⏹温度

⏹溶液pH值

⏹盐浓度

⏹吸附物质的浓度与吸附剂量

⏹溶剂

活性炭吸附溶质的量在未达到平衡前一般随温度提高而增加，对相对分子质量大的化合物的吸附力大于相对分子质量小的化合物

活性炭纤维与颗粒状活性炭相比，吸附与解吸速度快，工作吸附容量较大，外表面积大；

固定床优点：

流体在介质层中基本上呈平推流，返混小，柱效率高。

缺点：

无法处理含颗粒的料液，因会堵塞床层，造成压力降增大而最终使操作无法进行。

流化床优点：

压降小，可处理高黏度或固体颗粒的粗料液；不需要特殊吸附剂，设备操作简单。

缺点：

存在严重的返混，特别是高径比很小的流化床，使床层理论塔板数降低，吸附剂的利用率低。

吸附操作中引起固定床过早出现“穿透”现象的因素有哪些？

如何处理？

⏹床层装填不合理，颗粒不均匀等，导致出现偏流现象，需重新对吸附剂床层进行装填。

Ø操作过程不规范（如流速或压力突然变化），使床层均匀程度受到破坏，重新装填吸附剂后，严格按操作规程进行操作。

Ø系统密闭性差，或操作不合理床层内出现气泡或分层现象。

进行密闭性检查，消除漏气，消除气泡及分层后，再进行正常工艺操作。

Ø料液浓度过高，操作流速过大等。

对待处理料液进行适当稀释，合理确定操作流速。

离子交换技术：

是根据某些溶质能解离为阳离子或阴离子的特性，利用离子交换剂与不同离子结合力强弱的差异，将溶质暂时交换到离子交换剂上，然后用合适的洗脱或再生剂将溶质离子交换下来，使溶质从原溶液中得到分离、浓缩或提纯的操作技术。

利用离子交换技术进行分离的关键是离子交换剂。

在生物产品中，分子通常较大，在树脂内部的扩散速度相对较慢，其离子交换速度常由内部扩散速度所控制