人类细胞表面IgSF相互作用组揭示蛋白质蛋白质相互作用的复杂网络.docx

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人类细胞表面IgSF相互作用组揭示蛋白质蛋白质相互作用的复杂网络

人类细胞表面IgSF相互作用组揭示蛋白质-蛋白质相互作用的复杂网络

导读

细胞表面蛋白的相互作用（PPIs）对于介导细胞间的通讯、识别和应答具有重要作用。

本研究开发了一套高通量基于ELISA的细胞外相互作用组分析平台并整合自动池化蛋白策略，对564种人细胞表面蛋白和分泌蛋白（大部分为免疫球蛋白超家族（IgSF）蛋白）进行相互作用组分析，检测了所有318,096个PPI组合。

进一步的系统进化同源性分析，发现约380个以前未报告的PPIs，并利用表面等离振子共振和细胞结合实验验证了其中一个子集。

PPIs揭示了生物系统内部和生物系统之间相互作用的复杂庞大的网络，同时确定了与受体以及“孤儿”受体结合的新型PPIs。

这些PPIs包括在多种细胞类型上表达的蛋白质，并参与多种过程（如免疫和神经系统的发育和功能、分化/增殖、代谢、血管生成和增殖），有助于进一步的功能相关性研究和药物靶点的发现。

实验设计如下

结果

1   用于 PPI筛选的蛋白质的选择和生产

为鉴定人类IgSF蛋白，研究者利用HUGO基因命名委员会（HGNC）、人蛋白质图谱和UniProt数据库，通过“诱饵”和“猎物”多聚结构域将感兴趣的458个IgSF和106个非IgSF蛋白的胞外结构域（ECDs）和分泌蛋白聚集到细胞上清中（图1A和1B），并通过Westernblot验证其表达。

本研究及其它团队都已证明基于ELISA的细胞外相互作用组测定（ECIA）和其他基于ELISA的结合实验均能在蛋白量表达很低的情况下检测到PPIs。

因此认为无论是否检测到蛋白质，所有诱饵和猎物都包括在筛选中。

2  自动汇集猎物ECIA平台的开发

ECIA和其他基于ELISA的检测方法允许直接从培养基中检测诱饵和猎物蛋白的结合（图1B），对每孔的猎物-诱饵对进行分析。

为增加通量，研究者池化三组猎物，并在筛选后对阳性孔去卷积化以鉴定PPIs（图1B）。

用一组已知的PPIs进行池化实验显示，猎物经过3倍稀释后也能与PPIs结合（图1C）。

由于对诱饵-猎物进行双向测试，相反方向的阳性结果可以“弥补”池化蛋白策略所导致的假阴性。

因此认为，池化的优势（减少结合反应的数量）远远超过了假阴性的潜在增长。

为了进一步提高通量，研究者优化384孔的格式，并利用液体处理机器人开发了自动化工作流程。

apECIA平台可实现每周测试55,296对诱饵-猎物组合。

PPI筛选揭示了复杂的PPIs网络。

筛选后，对阳性孔进行去卷积化（图1B），并排除非特异性PPIs后，发现495个阳性孔中包含了426个独特PPIs。

在每种情况下，三个去卷积的猎物中只有一个能够产生阳性信号。

为了证实其相互结合，将阳性猎物针对其同源诱饵一分为三再次测试。

约81%的PPIs（345/426）在IgSF蛋白之间，其余19％的PPIs存在于IgSF与筛选体系中的其他蛋白质之间。

检测的蛋白质中有一半与PPIs有关（254/564，45％），不参与PPIs的蛋白质可能会被错误折叠。

研究者同时证实了此平台的灵敏度，许多以极低水平表达的诱饵或猎物蛋白仍与一种或两种PPIs结合，但对于表达量极低的猎物蛋白，可能存在假阴性的结果。

在426个PPIs中，有345个（81％）以前未报道过。

大多数PPIs（408/426）形成一个包含226种蛋白质的复杂网络（图1D）。

只有涉及18个PPIs的28种蛋白质未连接到此网络（网络的不同区域如图2所示）。

98个蛋白质（39％）具有1个PPI，113个蛋白质（44％）具有2至5个PPIs，43个蛋白质（17％）具有5个以上PPIs（图1E）。

由于45％的蛋白质表现出结合力，因此研究者计算了每种蛋白质结合x-16个PPIs的预期频率，并比较预期频率和实际观察到的频率（图1F）。

实际观察到的结合伴侣数量显著大于随机预测而得的PPIs数量。

图1.apECIA筛选概述。

A．筛选库中蛋白质子集的示意图；B．筛选流程图（左），ECIA原理图和蛋白池化策略（右）；C.未稀释猎物（单个猎物）与3倍稀释猎物（合并猎物）的ECIA;D.在筛选中观察到的PPIs网络，Siglec子家族节点以彩色突出显示；E.结合受体数目分布的饼图，与节点环状网络图叠加；F.实际观察到的与PHA预期频率的关系。

3  系统发育同源性分析（PHA）预测PPIs

PPIs经常发生在亚家族内部和亚家族之间的系统发育相关蛋白之间。

研究者进行多个序列比对以鉴定亚家族成员并形成了系统发育树。

利用apECIA-PHA的组合方法沿着系统发育树分析所筛选的数据，以预测在筛选中可能遗漏的亚家族成员间的PPIs。

研究者选择筛选和PHA预测的一个PPIs子集进行SPR验证。

理想的PPIs可通过SPR高度敏感地观察到明显的结合和解离。

PPIs的特征性结合谱表现出高于背景的清晰共振信号（阴性对照配体和受体）和浓度依赖性结合曲线，被认为是特异性配体-分析物PPI的标志。

非特异性PPIs通常表现出一定的偏差，如高背景和非线性浓度响应。

利用SPR检测了在筛选中得到的24个新型PPIs，存在23个特定的配体-分析物相互作用。

研究者另外测试了35种PHA预测的PPIs，观察到33个特定的相互作用。

在小鼠和跨物种（人类-小鼠）的同源蛋白之间还观察到了另外三个PPIs。

总之，本研究利用SPR共验证了59个新型PPIs。

4  apECIA-PHA组合方法揭示多种DCC亚家族间PPIs

轴突导向因子-1受体DCC在神经系统中的功能较为明确，且DCC作为依赖性受体，与结直肠癌和其他癌症密切相关，但在癌症中的作用尚不清楚。

研究者发现DCC与胰岛素样生长因子结合蛋白1（IGFBPL1）结合，但不与胰岛素样生长因子结合蛋白7（IGFBP7）结合（图2I和3A）。

系统发育进化树显示，IGFBPL1和IGFBP7在同一簇中，并且在各亚家族成员之间具有最高的氨基酸序列相似性（55％）。

SPR检测分析显示，DCC均能与IGFBPL1和IGFBP7结合（图3C）。

PHA显示DCC聚集的四种蛋白质：

PUNC、PUNCe11、再生蛋白（NEO1）和原蛋白（PRTG）（图3A）。

这些蛋白质共同作用于多种生理过程，包括神经系统发育、肌生成和血管生成、炎症和组织再生、白细胞迁移、神经管和乳腺形成、骨骼和结缔组织发育以及干细胞分化。

PUNC是神经系统发育过程中所表达的“孤儿”受体。

PUNCe11和PRTG结合细胞间粘附分子5（ICAM5）（图3A），该蛋白质在大脑中特异性表达，在突触形成、稳定和细化中起作用。

裂解的ICAM5ECD通过细胞因子发挥免疫抑制功能，并调节脑组织炎症反应。

SPR实验证实PUNCe11和PRTG可与ICAM5结合，尽管在筛选中未检测到其余DCC亚家族成员中与ICAM5作用的PPIs（图3C）。

在本筛选体系中观察到一个或多个DCC亚家族成员还与WFIKKN2（一种分泌的蛋白质，可与转化生长因子-β亚家族成员结合并调节其呈递给细胞的状态）、乳运铁蛋白（LTF，一种具有抗菌活性的铁结合蛋白）、白细胞介素6受体亚基α（IL-6Rα，一种细胞因子受体）和ISLR2/LINX（在神经系统发育中起作用）。

SPR实验证实所有DCC亚家族成员均能与这些蛋白质以及筛选得到的其他蛋白质结合（图3C，3D和3F）。

这些结果表明使用apECIA-PHA方法对于确定筛选体系外的PPIs具有重要意义，阐释更加完整的蛋白质-蛋白质互作网络（图3F）。

图2.PPIs网络的区域选择。

A.选择包含四个未连接到网络的蛋白质PPIs（CD146，CNTN1，NFASC和NrCAM）;B.主要由免疫系统蛋白组成的区域;C.生物系统内和跨生物系统的PPIs区；D.突出显示亚家族特异性IIA型和IIB型PTPRPPIs的两个区域;E.突出显示“孤儿”受体ILDR1和PUNC的PPIs区; F.显示LILR亚家族PPIs的区域；G.具有非Siglecs（CD33/Siglec-3）的SiglecPPIs的区;H.Siglec-SiglecPPIs（CD33/Siglec-3;MAG/Siglec-4a;SN/Siglec-1区;I.突出神经系统蛋白之间以及免疫系统和生殖系统蛋白间相互作用的PPIs区

图3.SPR验证经apECIA-PHA确定的DCC亚家族PPIs。

A.DCC亚家族PPIs树状图，绿色表示在apECIA筛选中观察到并由SPR验证的，品红色表示PHA预测并由SPR验证的PPIs;B.PSGPPIs树状图;C. DCC亚家族、IL6-R和ISLR2结合各种配体的SPR传感图;D.IL-6Rα结合ISLR2的SPR传感图；E.DSCAM和DCC结合PSG的SPR传感图;F.SPR验证的PPIs网络。

5  LAR-PTRR亚家族间PPIs

5.1 LAR-PTRR亚家族与SALMs间具有PPIs

IIA型酪氨酸磷酸酶受体（LAR-PTPR）的LAR家族包括PTPRF（也称LAR），PTPRD和PTPRS（图4A和4B）。

LAR-PTPR在突触组织和功能中起重要作用。

突触前的LAR-PTPR与多个突触后配体通过PPIs介导跨突触粘附。

LAR-PTPRs及其配体突变的小鼠表现出突触结构和功能的缺陷。

以往研究已经发现特定LAR-PTPR和SALM2/3/5之间的多种PPIs（图4A）。

在本筛选体系中观察到上述已知和其它尚未明确的PPIs（图2D,4A和4C）。

进一步利用SPR检测LAR-PTPR与所有SALM的相互作用。

除PTPRF-SALM4外，所有LAR-PTPR均与SALM家族结合（图4E）。

但PTPR-SALM对在最大响应单位（RU）方面存在差异，提示LAR-PTPR和SALM之间的亲和力具有一定的范围（图4F）。

5.2 LAR-PTRR亚家族与白细胞介素1受体辅助蛋白（IL1APs）间具有PPIs

LAR-PTPR与IL1RAP和IL1RAPL1间跨突出的相互作用，可诱导突触前和突触后双向分化。

以往研究认为IL1RAP与所有LAR-PTPRs和带有PTPRD的IL1RAPL1相互作用，此外，研究者还观察到IL1RAPL1与PTPRS的结合（图2D）。

IL1RAPL1与IL1RAPL2具有79％的序列相似性，IL1RAPL2作为脑中表达的孤儿受体，生物学功能尚不明确。

在本筛选体系中，研究者观察到IL1RAPL2与PTPRD和PTPRS结合（图2D）。

此外，筛选体系以及SPR实验均表明IL1RAPL2可与成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）相互作用。

5.3 IIB型PTPR与DSCAMs具有PPIs

IIB型PTPR在大多数组织中表达，并调节多种过程（细胞生长、迁移和分化、免疫细胞发育等）。

IIB型亚家族由PTPRK，PTPRM和PTPRT组成（图4A和4B），并且多个配体已经明确。

研究者在此发现所有IIB型PTPR与唐氏综合症细胞粘附分子（DSCAM）和唐氏综合症细胞粘附分子样-1（DSCAML1）结合（图4A和4C）。

DSCAMs的ECD区包含9个Ig样区域，紧随4个FN3域，1个Ig样域和2个FN3域（图4B）。

N端与同种抗原结合，并介导与netrin-1和split-1的结合，尚为证实C端ECD区域的结合配体。

此外，研究者观察到两个DSCAM（DSCAM-CT和DSCAML1-CT）和所有IIA型PTPR的C端结合（图4C）。

SPR实验也进一步证实了DSCAM-CT和DSCAML1-CT与PTPRT和PTPRM的结合（尽管PTPRK表达水平较低）（图4D）。

图4.SPR验证IIA型和IIB型PTPR与SALM和DSCAM的结合。

A.树状图突出显示SALM，D