1、人类细胞表面IgSF相互作用组揭示蛋白质蛋白质相互作用的复杂网络人类细胞表面IgSF相互作用组揭示蛋白质-蛋白质相互作用的复杂网络导读细胞表面蛋白的相互作用(PPIs)对于介导细胞间的通讯、识别和应答具有重要作用。本研究开发了一套高通量基于ELISA的细胞外相互作用组分析平台并整合自动池化蛋白策略,对564种人细胞表面蛋白和分泌蛋白(大部分为免疫球蛋白超家族(IgSF)蛋白)进行相互作用组分析,检测了所有318,096个PPI组合。进一步的系统进化同源性分析,发现约380个以前未报告的PPIs,并利用表面等离振子共振和细胞结合实验验证了其中一个子集。PPIs揭示了生物系统内部和生物系统之间相互
2、作用的复杂庞大的网络,同时确定了与受体以及“孤儿”受体结合的新型PPIs。这些PPIs包括在多种细胞类型上表达的蛋白质,并参与多种过程(如免疫和神经系统的发育和功能、分化/增殖、代谢、血管生成和增殖),有助于进一步的功能相关性研究和药物靶点的发现。实验设计如下结果1 用于PPI筛选的蛋白质的选择和生产为鉴定人类IgSF蛋白,研究者利用HUGO基因命名委员会(HGNC)、人蛋白质图谱和UniProt数据库,通过“诱饵”和“猎物”多聚结构域将感兴趣的458个IgSF和106个非IgSF蛋白的胞外结构域(ECDs)和分泌蛋白聚集到细胞上清中(图1A和1B),并通过Western blot验证其表达。
3、本研究及其它团队都已证明基于ELISA的细胞外相互作用组测定(ECIA)和其他基于ELISA的结合实验均能在蛋白量表达很低的情况下检测到PPIs。因此认为无论是否检测到蛋白质,所有诱饵和猎物都包括在筛选中。2 自动汇集猎物ECIA平台的开发ECIA和其他基于ELISA的检测方法允许直接从培养基中检测诱饵和猎物蛋白的结合(图1B),对每孔的猎物-诱饵对进行分析。为增加通量,研究者池化三组猎物,并在筛选后对阳性孔去卷积化以鉴定PPIs(图1B)。用一组已知的PPIs进行池化实验显示,猎物经过3倍稀释后也能与PPIs结合(图1C)。由于对诱饵-猎物进行双向测试,相反方向的阳性结果可以“弥补”池化蛋白
4、策略所导致的假阴性。因此认为,池化的优势(减少结合反应的数量)远远超过了假阴性的潜在增长。为了进一步提高通量,研究者优化384孔的格式,并利用液体处理机器人开发了自动化工作流程。apECIA平台可实现每周测试55,296对诱饵-猎物组合。PPI筛选揭示了复杂的PPIs网络。筛选后,对阳性孔进行去卷积化(图1B),并排除非特异性PPIs后,发现495个阳性孔中包含了426个独特PPIs。在每种情况下,三个去卷积的猎物中只有一个能够产生阳性信号。为了证实其相互结合,将阳性猎物针对其同源诱饵一分为三再次测试。约81%的PPIs(345/426)在IgSF蛋白之间,其余19的PPIs存在于 IgSF与
5、筛选体系中的其他蛋白质之间。检测的蛋白质中有一半与PPIs有关(254 / 564,45),不参与PPIs的蛋白质可能会被错误折叠。研究者同时证实了此平台的灵敏度,许多以极低水平表达的诱饵或猎物蛋白仍与一种或两种PPIs结合,但对于表达量极低的猎物蛋白,可能存在假阴性的结果。在426个PPIs中,有345个(81)以前未报道过。大多数PPIs(408/426)形成一个包含226种蛋白质的复杂网络(图1D)。只有涉及18个PPIs的28种蛋白质未连接到此网络(网络的不同区域如图2所示)。98个蛋白质(39)具有1个PPI,113个蛋白质(44)具有2至5个PPIs,43个蛋白质(17)具有5个以
6、上 PPIs(图1E)。由于45的蛋白质表现出结合力,因此研究者计算了每种蛋白质结合x-16个PPIs的预期频率,并比较预期频率和实际观察到的频率(图1F)。实际观察到的结合伴侣数量显著大于随机预测而得的PPIs数量。图1. apECIA筛选概述。A筛选库中蛋白质子集的示意图;B筛选流程图(左),ECIA原理图和蛋白池化策略(右);C.未稀释猎物(单个猎物)与3倍稀释猎物(合并猎物)的ECIA;D.在筛选中观察到的PPIs网络,Siglec子家族节点以彩色突出显示;E.结合受体数目分布的饼图,与节点环状网络图叠加;F.实际观察到的与PHA预期频率的关系。3 系统发育同源性分析(PHA)预测PP
7、IsPPIs经常发生在亚家族内部和亚家族之间的系统发育相关蛋白之间。研究者进行多个序列比对以鉴定亚家族成员并形成了系统发育树。利用apECIA-PHA的组合方法沿着系统发育树分析所筛选的数据,以预测在筛选中可能遗漏的亚家族成员间的PPIs。研究者选择筛选和PHA预测的一个PPIs子集进行SPR验证。理想的PPIs可通过SPR高度敏感地观察到明显的结合和解离。PPIs的特征性结合谱表现出高于背景的清晰共振信号(阴性对照配体和受体)和浓度依赖性结合曲线,被认为是特异性配体-分析物PPI的标志。非特异性PPIs通常表现出一定的偏差,如高背景和非线性浓度响应。利用SPR检测了在筛选中得到的24个新型P
8、PIs, 存在23个特定的配体-分析物相互作用。研究者另外测试了35种PHA预测的PPIs,观察到 33个特定的相互作用。在小鼠和跨物种(人类-小鼠)的同源蛋白之间还观察到了另外三个PPIs。总之,本研究利用SPR共验证了59个新型PPIs。4 apECIA-PHA组合方法揭示多种DCC亚家族间PPIs轴突导向因子-1受体DCC在神经系统中的功能较为明确,且DCC作为依赖性受体,与结直肠癌和其他癌症密切相关,但在癌症中的作用尚不清楚。研究者发现DCC与胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBPL1)结合,但不与胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)结合(图2I和3A)。系统发育进化树显示,IG
9、FBPL1和IGFBP7在同一簇中,并且在各亚家族成员之间具有最高的氨基酸序列相似性(55)。SPR检测分析显示,DCC均能与IGFBPL1和IGFBP7结合(图3C)。PHA显示 DCC聚集的四种蛋白质:PUNC、PUNC e11、再生蛋白(NEO1)和原蛋白(PRTG)(图3A)。这些蛋白质共同作用于多种生理过程,包括神经系统发育、肌生成和血管生成、炎症和组织再生、白细胞迁移、神经管和乳腺形成、骨骼和结缔组织发育以及干细胞分化。PUNC是神经系统发育过程中所表达的“孤儿”受体。PUNC e11和PRTG结合细胞间粘附分子5(ICAM5)(图3A),该蛋白质在大脑中特异性表达,在突触形成、稳
10、定和细化中起作用。裂解的ICAM5 ECD通过细胞因子发挥免疫抑制功能,并调节脑组织炎症反应。SPR实验证实PUNC e11和PRTG可与ICAM5结合,尽管在筛选中未检测到其余DCC亚家族成员中与ICAM5作用的PPIs(图3C)。在本筛选体系中观察到一个或多个DCC亚家族成员还与WFIKKN2(一种分泌的蛋白质,可与转化生长因子-亚家族成员结合并调节其呈递给细胞的状态)、乳运铁蛋白( LTF,一种具有抗菌活性的铁结合蛋白)、白细胞介素6受体亚基(IL-6R,一种细胞因子受体)和ISLR2 / LINX(在神经系统发育中起作用)。SPR实验证实所有DCC亚家族成员均能与这些蛋白质以及筛选得到
11、的其他蛋白质结合(图3C,3D和3F)。这些结果表明使用apECIA-PHA方法对于确定筛选体系外的PPIs具有重要意义,阐释更加完整的蛋白质-蛋白质互作网络(图3F)。图2. PPIs网络的区域选择。A.选择包含四个未连接到网络的蛋白质PPIs(CD146,CNTN1,NFASC和NrCAM); B. 主要由免疫系统蛋白组成的区域; C.生物系统内和跨生物系统的PPIs区;D. 突出显示亚家族特异性IIA型和IIB型PTPR PPIs的两个区域; E. 突出显示“孤儿”受体ILDR1和PUNC的PPIs区; F. 显示LILR亚家族PPIs的区域;G.具有非Siglecs(CD33 / Si
12、glec-3)的Siglec PPIs的区; H. Siglec-Siglec PPIs(CD33 / Siglec-3; MAG / Siglec-4a; SN / Siglec-1区; I. 突出神经系统蛋白之间以及免疫系统和生殖系统蛋白间相互作用的PPIs区图3. SPR验证经apECIA-PHA确定的DCC亚家族PPIs。A. DCC亚家族PPIs树状图,绿色表示在apECIA筛选中观察到并由SPR验证的,品红色表示PHA预测并由SPR验证的PPIs; B. PSG PPIs树状图; C.DCC亚家族、IL6-R和ISLR2结合各种配体的SPR传感图; D. IL-6R结合ISLR2的
13、SPR传感图;E. DSCAM和DCC结合PSG的SPR传感图; F. SPR验证的PPIs网络。5 LAR-PTRR亚家族间PPIs5.1 LAR-PTRR亚家族与SALMs间具有PPIsIIA型酪氨酸磷酸酶受体(LAR-PTPR)的LAR家族包括PTPRF(也称LAR),PTPRD和PTPRS(图4A和4B)。LAR-PTPR在突触组织和功能中起重要作用。突触前的LAR-PTPR与多个突触后配体通过PPIs介导跨突触粘附。LAR-PTPRs及其配体突变的小鼠表现出突触结构和功能的缺陷。以往研究已经发现特定LAR-PTPR和SALM2 / 3/5之间的多种PPIs(图4A)。在本筛选体系中观
14、察到上述已知和其它尚未明确的PPIs(图2D, 4A和4C)。进一步利用SPR检测 LAR-PTPR与所有SALM的相互作用。除PTPRF-SALM4外,所有LAR-PTPR均与SALM家族结合(图4E)。但PTPR-SALM对在最大响应单位(RU)方面存在差异,提示LAR-PTPR和SALM之间的亲和力具有一定的范围(图4F)。5.2 LAR-PTRR亚家族与白细胞介素1受体辅助蛋白(IL1APs)间具有PPIsLAR-PTPR与IL1RAP和IL1RAPL1间跨突出的相互作用,可诱导突触前和突触后双向分化。以往研究认为IL1RAP与所有LAR-PTPRs和带有PTPRD的IL1RAPL1相
15、互作用,此外,研究者还观察到IL1RAPL1与PTPRS的结合(图2D)。IL1RAPL1与IL1RAPL2具有79的序列相似性,IL1RAPL2作为脑中表达的孤儿受体,生物学功能尚不明确。在本筛选体系中,研究者观察到IL1RAPL2与PTPRD和PTPRS结合(图2D)。此外,筛选体系以及SPR实验均表明 IL1RAPL2可与成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)相互作用。5.3 IIB型PTPR与DSCAMs具有PPIsIIB型PTPR在大多数组织中表达,并调节多种过程(细胞生长、迁移和分化、免疫细胞发育等)。IIB型亚家族由PTPRK,PTPRM和PTPRT组成(图4A和4B),并且多个
16、配体已经明确。研究者在此发现所有IIB型PTPR与唐氏综合症细胞粘附分子(DSCAM)和唐氏综合症细胞粘附分子样-1(DSCAML1)结合(图4A和4C)。DSCAMs的ECD区包含9个Ig样区域,紧随 4个FN3域,1个Ig样域和2个FN3域(图4B)。N端与同种抗原结合,并介导与netrin-1和split-1的结合,尚为证实C端ECD区域的结合配体。此外,研究者观察到两个DSCAM(DSCAM-CT和DSCAML1-CT)和所有IIA型PTPR的C端结合(图4C)。SPR实验也进一步证实了DSCAM-CT和DSCAML1-CT与PTPRT和PTPRM的结合(尽管PTPRK表达水平较低)(图4D)。图4. SPR验证IIA型和IIB型PTPR与SALM和DSCAM的结合。A.树状图突出显示SALM,D
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