基因工程.docx

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基因工程

第1节载体

一、载体（vector）的概念

在基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具称为载体。

2、载体的特性

（1）能在宿主细胞中进行独立和稳定的DNA复制（至少有一个复制起点）；

（2）易从宿主细胞中分离，并进行纯化（具有较小的分子量和较高的拷贝数）；

（3）在其DNA序列中，具有适当的限制性核酸内切酶的酶切位点（至少应有一个克隆位点）；

（4）具有能够观察的表型特征（至少应有一个遗传标记基因）。

三、载体的条件

（1）复制子。

具有特殊结构的DNA序列，以保证与它结合的外源DNA在宿主细胞中独立复制繁殖；

（2）有一个或多个利于检测的遗传表型，如抗药性、显色反应等；

（3）有一个或多个限制性核酸内切酶的单一识别位点，便于外源基因的插入；

（4）适当的拷贝数。

（一）细菌质粒载体

1、质粒的概念

质粒（plasmid）是独立于染色体外的小型环状双链DNA分子。

含有复制功能的遗传结构。

2、分子特性

（1）双链共价封闭环状、自然旋转成超螺旋构型（closedcircleDNA，ccDNA）；

（2）单链断裂成为开链环状DNA（opencircleDNA，ocDNA）；

（3）双链断开成线性DNA（linerDNA）。

三种DNA分子的电泳行为不同。

由于质粒DNA分子构型不同，与溴化乙锭结合能力也有差异，造成分子密度不同，经氯化铯密度超离心，可将其分开。

3、质粒DNA的制备

SDS碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。

一般采用SDS碱裂解法：

（1）培养、收集菌体；

（2）裂解细胞;

（3）分离质粒DNA、染色体DNA以及除去蛋白质和RNA;

（4）通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA。

4、质粒载体的条件

▲分子量尽可能小，多拷贝，便于提取和纯化。

▲缺失流动基因（mob），避免从一个细菌接触转移到另一个细菌。

▲DNA结构清楚，序列中具有一个或多个核酸内切酶单一的酶切位点，在插入外源基因后不影响质粒自身复制。

▲插入外源基因的重组质粒，较容易导入宿主菌内复制和表达。

▲具有一个或几个报告基因，而且核酸内切酶的酶切位点恰好位于基因之内，由于插入外源基因，使得该报告基因失活，便于筛选重组体。

5、质粒载体的局限性

所能携带的外源基因的片段较小，只限于10Kb以下的DNA片段。

6、对天然质粒的修饰改造的策略

围绕作为质粒载体的基本条件，对天然质粒进行改造：

（1）去掉不必要的DNA区域。

尽量缩短质粒的相对分子量，以提高外源DNA片段的装载量。

（2）减少限制性内切核酸酶的酶切位点。

得到多种单一的限制性内切核酸酶识别位点。

（3）加入易于检测的选择性标记。

如抗生素抗性、组织化学染色、荧光等。

（4）要有安全性。

不能随便转移，以免污染环境。

（5）根据需要，组装各种“元件”，构成不同用途的载体。

（6）必须有能在受体细胞内有效复制的质粒复制其始位点。

7、常用的质粒载体及构建

常用的质粒载体：

pBR322、pUC系列、pSP系列、pGEM、BluescriptM。

质粒克隆载体的构建：

一是设计，二是构建（包括对DNA分子的切割、修饰和连接）。

（1）选用合适的出发质粒（亲本质粒），确定必备的“元件”；

（2）正确组装各个“元件”；

（3）组装合适的选择标记基因；

（4）选用合适的启动子；

（5）在能达到目的的前提下，构建过程力求简单。

（1）pBR322

*特点：

分子量较小，为4363bp，不仅利于自身DNA的纯化，可容纳的外源DNA也较大。

具有两种抗菌素抗性基因可供转化子的选择记号。

具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增后，每个细胞中可累积1000-3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。

＊构建:

由F.Bolivar和R.L.Rodriguez构建。

（1）元件来源

复制起点ori：

pBM1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点；

Ampr基因：

pSP2124质粒易位子Tn3的Ampr基因；

Tcr基因：

pSC101质粒的Tcr基因。

（2）长度4363bp

（3）选择标记基因氨苄青霉素和四环素抗性；

（4）克隆位点24个克隆位点。

其中9个会导致Tcr基因失活（BamHⅠ、HindⅢ、SalⅠ）；3个会导致Ampr基因失活（ScaⅠ、PvuⅠ、PstⅠ）。

（5）构建过程:

pMB1（8.4Kb）经Tn3易位pMB3（13.3Kb,含Ampr），经EcoRⅠ消化pMB8（2.6Kb,含EcoRⅠ、EI免疫基因,无Ampr）pMB9（5.3Kb,含Tcr、EI免疫基因、EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠ、BamHⅠ位点）经易位形成pMB312（10.2Kb,含Ampr、Tcr、2个BamHⅠ位点）pMB313（8.8Kb，1个BamHⅠ、HindⅢ、SalⅠ位点，均在Tcr中）经消化分别形成pMB318（含Amps、Tcr）和pMB322（含Ampr、Tcs）二者重组形成pMB322（Ampr、Tcr）。

（2）噬菌体载体（phagemidvector）

是由质粒载体和单链噬菌体载体的复制起点结合而成的新型载体系列。

特点：

噬菌体作为载体可插入10Kb--20Kb甚至更大的外源DNA片段。

1、λ噬菌体载体

λ噬菌体是一种线性双链分子，长约50Kb，具有60多个基因。

左臂

噬菌体DNA由三个片段组成：

中央片段

右臂

左右臂包含了λ复制和成熟所必须的全部机能蛋白编码，而中央片段为非必需区，可被其他大肠杆菌DNA片段所替换。

λ噬菌体DNA的两个5-末端为12Kb的单链，两端序列互补成天然的“粘性末端”。

粘性末端形成的双链区域称为cos位点，它是包装蛋白的识别位点。

进入宿主菌后，DNA分子环化。

替换型载体

有2个相对应的酶切克隆位点，其间是非必需部分。

由于去掉了许多DNA序列，所以能克隆较大的外源DNA片段（20——25Kb）。

插入型载体

有1个可供外源DNA插入的克隆位点，只能插入较小的DNA片段（小于10Kb）。

λ噬菌体的包装

对DNA大小有要求（35Kb—51Kb）

体外包装的原理：

以各种λ噬菌体蛋白基因的突变株感染细菌，分别提取并互补成包装λ噬菌体DNA的完整的包装蛋白系统。

由于包装蛋白系统具有识别功能，而人工体外包装的λ噬菌体大多是置换型载体，因此，只有插入了外源DNA的噬菌体DNA才能具有被包装所需长度。

2、M13噬菌体载体

又称单链噬菌体载体。

两个特性：

（1）允许包装大于病毒单位长度的外源DNA；

（2）感染细菌后，复制环状DNA经包装形成噬菌体颗粒，分泌到细胞外而不产生溶菌。

大小为6.4Kb。

成熟的噬菌体为闭合环状单链正链DNA，含有DNA复制和噬菌体增殖所必需的遗传信息，基因间隔区的部分核苷酸序列即使发生突变、缺失或插入外源DNA片段，也不影响M13DNA的复制。

第2节工具酶

限制性内切酶:

主要用于DNA分子的特异切割

DNA甲基化酶:

用于DNA分子的甲基化

核酸酶:

用于DNA和RNA的非特异性切割

核酸聚合酶:

用于DNA和RNA的合成

核酸连接酶:

用于DNA和RNA的连接

核酸末端修饰酶:

用于DNA和RNA的末端修饰

其它酶类:

用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等

1、限制性内切酶（restrctionendonuclease）

（1）概念和种类

1、概念

限制性核酸内切酶（restrctionendonuclease）是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶（endo-deoxyribonuclease）。

这类酶在生物细胞内是限制性修饰系统的一部分，可防止外源DNA侵入。

限制修饰系统限制性内切酶

（RM系统）甲基化酶

当生物体内发生甲基化后，DNA位点被保护起来，所以宿主细胞中甲基化的DNA能够不被限制性核酸内切酶切割。

2、限制修饰系统的种类

1. I型：

由三个基因构成:

hsdR

hsdM

hsdS

（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）

三个基因编码多亚基复合功能酶，具有修饰、切割DNA的特性，需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸）等辅助因子。

酶在DNA链上的识别位点与切割位点不一致，不能产生特异性片段。

2. II型：

由限制酶与修饰酶组成二元系统，以同源二聚体形式存在。

需要Mg2+作为辅助因子。

能识别DNA双链特异序列，并在此序列上切割产生特异的DNA片段。

3. III型：

数量较少，在特性上与Ｉ型酶相似。

能在特异位点切割，但识别序列是非对称的，切割位点在识别序列之外。

上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。

（3）限制酶的特点

作用机制

以环状和线状双链DNA为底物，在合适的反应条件下，识别一定的核苷酸序列，使两条链上特定位置的磷酸二酯键断开，产生具有3-OH和5-P基团的片段。

识别序列和酶切位点

△识别４-8个相连的核苷酸

MboINGATCN；AvaIIGG（A/T）CC

BamHIGGATCC：

PpuMIPuGG（A/T）CCPy

NotIGCGGCCGC；

SfiIGGCCNNNNNGGCC

CCGGN’N’N’N’N’CCGG

FokI5’-ＧＧＡＴＧ（Ｎ）9-3’

3’-ＣＣＴＡＣ（Ｎ）13-5’外侧，产生５’-端突起

△富含ＧＣ

△对称性—双对称EcoRI5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’

△切点大多数在识别顺序之内，也有例外;

△限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ

（4）限制性内切酶的定义、命名

1.定义：

广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。

2.命名：

限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。

　例如：

HindⅢ　前三个字母来自于菌种名称（H.influenzae），“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。

EcoRI—EscherichiacoliRI

HindⅢ—HaemophilusinfluensaedⅢ

SacI（II）—StreptomycesachromagenesI（Ⅱ）

（五）特征

△每一种酶都具有各自特异的识别序列。

△同位酶、同尾酶、同裂酶

△具有180度旋转对称的回文结构。

即顺看反看都一样（从5→3）。

△HpaⅡ和MspⅠ是同位酶，切割同样的DNA靶子序列CCGG，但对这个序列的甲基化状况有不同的限制反应。

MspⅠ切割所有状态下的CCGG，而HpaⅡ仅切割非甲基化的CCGG。

（6）限制酶的用途

1.    DNA重组2.    限制酶（物理）图谱绘制

3.    突变分析（RFLP分析）4.限制酶的部分酶切与完全酶切

2、DNA聚合酶（DNApolymerase）

1、E.coli的DNA聚合酶系统

PolI参与DNA修复,具3’→5’和5’→3’外切酶活性；

polII参与DNA修复，具3’→5’外切酶活性；

polIII参与DNA复制,具3’→5’和5’→3’外切酶活性；

基因工程中常用的DNA聚合酶：

E.coliPolI

2、E.colipolI的