基因工程综合实验汇总教材.docx

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基因工程综合实验汇总教材

基因工程综合实验

马正文

生物13班130434109

摘要：

20世纪80年代以来,基因工程技术在农业上的应用取得了斐然成果,植物基因工程已成为农业绿色革命的最重要技术手段。

为此对植物基因工程中目的基因的克隆，植物表达载体构建与目的基因的转化以及转基因植株的检测的研究进展作了综合评述。

1.目的基因克隆

1.1实验目的

1.11通过PCR法分离克隆目的基因。

1.12熟悉掌握PCR、凝胶电泳、DNA回收纯化、PCR产物与T载体链接、大肠杆菌感受态细胞制备、连接产物转化、重组子筛选等一系列克隆相关技术

1.2实验原理

基于已知序列或已知同源基因序列，设计基因特异引物或简并引物，以DNA或cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物电泳后回收纯化，与T载体连接，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，经抗性筛选和PCR检测、质粒酶切鉴定获得重组子。

1.3实验试剂药品及仪器设备

1.3．1试剂药品

PCR反应试剂（TaqDNApolymerase,10×PCRBuffer（Mg2+），2.5mMdNTPs,Primers（合成））

1×TAE,CaCl2，无水乙醇、LB培养基

DNA回收试剂盒，质粒DNA提取试剂盒，DNAmarker

T-Vector,T4-DNAligase,

质粒DNA提取试剂盒

常用限制性核酸内切酶

1.3.2仪器设备

PCR仪、电泳装置、离心机、恒温箱、摇床、凝胶成像仪、移液器等

耗材：

PCR管、离心管、吸头、培养皿等

1.4实验步骤

1．4.1PCR

1.4.1．1PCR原理

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。

双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。

在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。

因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

1.4..1.2PCR反应体系

DNA模板1l

上游引物（10pmol/l）1l

下游引物（10pmol/l）1l

10×PCRBuffer5l

25mMMgCl24l

2.5mMdNTPs4l

Taq（4,5units/l）0.5l

ddH2O33.5l

total50l

或

DNA模板1l

上游引物（10pmol/l）3l

下游引物（10pmol/l）3l

10×PCRBuffer5l

10mMdNTP（each）1l

Pfu（2,3units/l）0.5l

ddH2O36.5l

total50l

1.4.1.3模板DNA可以是基因组DNA、DNA片段、cDNA、质粒DNA或含目标DNA的细菌及病毒等，浓度一般小于100ng。

1.4.1.4引物设计应遵循下列原则：

（1）长度一般在20-24碱基;

（2）与模板DNA的配对同源性在80%以上;

（3）上游引物与基因编码链序列一致,下游引物则与之互补;

（4）3’未端与模板配对能力较好（最好未端5个碱基能配对）;

（5）两引物G+C百分含量相近;

（6）3’未端不出现3个连续的G/C;

（7）引物自身或两引物间不存在连续5个或5个以上碱基的互补能力;

（8）两引物3’未端序列不应相近;

（9）目标PCR产物的长度应能预测;

（10）经GenBank同源性检索,目标基因与引物的配对能力应远强于其它基因。

1.4.1.5循环条件：

一般情况下Taq采用94℃,5min→（94℃,40s→退火温度,40s→72℃,60-120s）30→72℃,10min。

Pfu采用95℃,2min→（95℃,40s→退火温度,30s→73℃,60-240s）35→73℃,5min。

退火温度是PCR成败的关键，虽然根据引物的特性可估计退火温度，但更多情况下是通过试验确定退火温度，一般为45-60℃。

退火温度大致可按下式推算：

Tm=4（G+C）+2（A+T）-5n，n代表错配的碱基数。

延伸时间Taq是每kb1min,Pfu则每kb2min。

1．4.2琼脂糖凝胶电泳

1．4.2.1胶的浓度因DNA长度而异：

基因组DNA，DNA0.4-0.5%

质粒（3-5kb）0.7%

3-1kb0.7-1.0%

1-0.5kb1.0-1.5%

<0.5kb2.0%

1.4.2.2电泳缓冲液可选用0.5×TBE或1×TAE，前者缓冲能力较后者强，但不适用于从胶中回收DNA，建议只采用1×TAE用于琼脂糖凝胶电泳。

琼脂糖用电泳缓冲液配制。

1.4.2.3电泳电压以5V/cm为宜,即电泳槽的长度×5。

1.4.2.4电泳胶中添加0.5g/mlEB。

1.4.2.5DNA样品与6×上样缓冲液混合后点样，为使DNA条带肉眼可见，条带DNA必须达2ng。

1.4.2.6采用合适的DNAMarker。

1.4.3PCR产物与T－载体连接

反应体系：

0.1μg载体DNA，2-5μlPCR纯化产物，1μl连接缓冲液，1μl（3units/l）T4DNA连接酶，加ddH2O至10μl，12-16℃连接过夜。

1.4.4大肠杆菌感受态细胞制备及DNA转化感受态细胞

1.4.4．1挑取TG1单菌落在LB培养基中37℃过夜培养；

1.4.4．2过夜培养的TG1菌按1：

50或1：

100稀释培养1.5-2hr;

1.4.4．3冰上冷却10min;

1.4.4．44000rpm×3min,4℃离心；

1.4.4．5沉淀用1ml100mMCaCl2悬浮，冰上放置10min;

1.4.4．64000rpm×3min,4℃离心；

1.4.4．7沉淀用0.2ml100mMCaCl2悬浮，冰上放置30min-24hr后使用;

1.4.4．8将连接产物与感受态细胞混合，冰上放置30min；

1.4.4．9于42℃热激90s后迅速放冰上2min;

1.4.4．10加入1mlLB（不含氨苄青霉素），混合后于37℃保温1hr;

1.4.4．11在含100g/ml氨苄青霉素的LB固体培养基平板（直径7cm）表面涂30lx-gal（20mg/ml,用二甲基甲酰胺配制）和3lIPTG（200mg/ml）,然后涂布转化后的细菌;

1.4.4．1237℃倒置培养10-14hr，待菌落长成后将平板置于4℃中保存。

1.4.5．大肠杆菌感受态细胞的快速制备及转化

1.4.5．1取1ml过夜培养的细菌,置冰上10min,离心收集细菌后加入100lTSS悬浮,置冰上10min后可用;

1.4.5．2加入要转化的DNA,置冰上10min;

1.4.5．3加入0.9ml含20mM葡萄糖的TSS,37℃培养1小时即可涂板。

注：

此感受态细胞可于－70℃保存4个月。

1.4.6农杆菌感受态细胞制备及冻融转化

1.4.6．1农杆菌稀释100倍过夜培养；

1.4.6．2吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；

1.4.6．35000rpm离心5min，弃去上清液；

1.4.7质粒提取――常规法

1.4.7．1取1ml细菌，12000rpm,15s；

1.4.7．2用200lSolutionI重悬浮细菌，室温放置5min;

1.4.7．3加入200lSolutionII，轻轻颠倒混匀，冰上放置5min；

1.4.7．4加入200lSolutionIII，轻轻颠倒混匀，冰上放置5min；

1.4.7．512000rpm,10min;

1.4.7．6上清液移入新离心管，加等体积异丙醇,颠倒混匀,室温放置2min;

1.4.7．712000rpm,5min，吸干残液；

1.4.7．8溶于50l含10g/mlRNase的TE，37℃保温20min；（到此步骤的质粒可供电泳检查）

1.4.7．9补加TE至100l,加等体积酚/氯仿，剧烈颠倒混匀1min；

1.4.7．1012000rpm,5min;

1.4.7．11上清液（上层）移入新离心管，加等体积氯仿，剧烈颠倒混匀30s；

1.4.7．1212000rpm,2min;

1.4.7．13上清液（上层）移入新离心管，加1/10体积3MNaAc（pH5.2）和2倍体积乙醇,室温放置2min;

1.4.7．1412000rpm,2min;

1.4.7．15用1ml70%乙醇洗涤沉淀后,沉淀于室温或37℃干燥;

1.4.7．16溶于50lTE,-20℃保存。

注:

提取少量质粒用于检查时，也可直接取200l细菌，接着做步骤3，步骤4中在溶液Ⅲ加入5min后加等体积氯仿/异戊醇，混匀，接着做下面步骤。

1．4.8低蛋白低DNase质粒的提取（该法无需酚/氯仿抽提）

1．4.8．1取1ml细菌，12000rpm,15s；

1．4.8．2用150lSET重悬浮细菌，室温放置5min;

1．4.8．3加入350μlSolutionII，轻轻颠倒混匀，冰上放置5min；

1．4.8．4加入250μlSolutionIII，轻轻颠倒混匀，冰上放置5min；

1．4.8．512000rpm,10min;

1．4.8．6上清液移入新离心管，加等体积异丙醇,颠倒混匀,室温放置2min;

1．4.8．712000rpm,5min，吸干残液；

1．4.8．8溶于50μl含10g/mlRNase的TE，37℃保温20min，然后-20℃保存。

2.植物表达载体构建与目的基因的转化（以烟草为例）

2.1实验目的

2.1.1进行分子设计构建植物表达载体。

2.1.2通过农杆菌介导等基因转化方法获得转基因烟草植株。

2.2实验原理

根癌农杆菌介导的外源基因转移，整合型的根癌农杆菌Ti质粒是最常用的一种载体。

研究最多的是章鱼碱型和胭脂碱型Ti质粒。

在Ti质粒上有一段T区，T-DNA能从该质粒转移到敏感植物的核基因组中。

T-DNA边界有25bp正向序列可能接受某种酶识别切割，进而形成环状中间体。

此外，Ti质粒上还有一个约50bp的Virlence区，简称Vir区，约有十几个基因，Vir区不在T-DNA内，Vir基因产物是一种跨膜蛋白。

可以接受植物信号的诱导而发生构象的改变，成为活性蛋白。

其中VirA基因可能是决定Ti宿主范围的基因。

根据Vir质粒的基本构造，通常认为由根癌农杆菌介导的外源DNA转移和转化要具备三个因素：

①位于农杆菌染色体上的Chra和Chrb基因，这两个基因细菌细胞对植物细胞的识别和吸附有关；②T-DNA边界序列对于T-DNA整合到植物染色体的过程是必要的；③Vir基因的活化可以启动DNA向植物细胞的转移。

农杆菌介导的基因转移是双子叶植物中最为广泛而有效的遗传转化体系。

2．3药品试剂

——MS母液（大量元素，微量元素，铁盐，有机母液）

——6-BA，IBA（0.1mg/ml）

——LB（蛋白胨，酵母提取物，氯化钠）

——卡那霉素（50mg/ml）、头孢霉素（250mg/ml）、羧苄青霉素母液（50mg/ml）

——琼脂（5g/L）

——砂糖（20-30g/L）

——定性滤纸

——限制性内切酶

——T4DNA连接酶

——凝胶DNA回收试剂盒

2.4仪器设备

——-20℃冰箱

——培养皿

——剪刀镊子

——三角瓶

——接种针

——枪头

——PCR仪

——天平

——研钵和杵子

——37、65水浴

——移液枪

——移液管

——离心机（转速至少可达5000g）

——4℃冰箱

——水浴锅等

2.5植物材料：

——室外烟草或烟草无菌苗

2.6质粒与菌株

——pBI121,pBS,pUC19，或外源目的基因质粒等。

——大肠杆菌TG1、DH5α等，农杆菌LBA4404、GV3101等

2.7实验程序：

2.7.1表达载体的构建：

①将含外源目的基因的质粒与pBS或pUC19用相同的内切酶进行双酶切，

②双酶切产物进行电泳，

③用试剂盒回收目的条带

④目的条带用T4DNA连接酶，在16℃下进行连接。

连接体系如下:

目的基因片段5μL

pBS或pUC193.5μL

T4DNAligasebuffer（×10）1μL

T4DNAligase0.5μL

Totalvolume10μL

①连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，通过PCR筛选出阳性重组质粒。

②阳性重组质粒与pBI121用相同的内切酶进行双酶切；

③电泳回收相应的目的片段；

④目的条带用T4DNA连接酶，在16℃下进行连接。

连接体系同上。

⑤连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，通过PCR筛选出阳性重组质粒。

⑥提取重组质粒DNA，转化农杆菌感受态细胞（液氮冻融直接转入法），PCR检测获得重组子。

⑦重组子可直接用于基因转化研究，也可加入30%~40%无菌甘油于-76℃保存备用

2.7.2无菌材料的准备：

叶片、茎段等均可作受体材料，有两种来源。

①取自无菌试管苗（本实验采用无菌苗）

②取自田间或温室栽培植株（需消毒处理，同组织培养）

2.7.3受体材料的预培养：

①再生培养基的配制:

烟草叶片再生培养基的配制MS+6-BA1.0mg/l+IBA0.1mg，铺板。

准备灭过菌的培养皿、剪刀镊子等。

②预培养：

取烟草无菌苗的幼嫩叶片用剪刀间隔0.5cm结果叶片中脉（保持剪后叶片不断裂以便下一步侵染），在再生培养基中预培养1-2天，待切口处刚刚开始膨大时即可进行能杆菌侵染。

2.7.4农杆菌培养：

①农杆菌的活化：

从-20度冰箱里取出保存的农杆菌，在无菌操作台上吸取少量放入LB液体培养基中或者划线培养，挑取单菌落接种到液体LB培养基中，加入50mg/l的Kan，200rpm，28℃摇菌过夜。

需准备的物品及试剂：

LB液体培养基、灭菌的三角瓶（50-100ml）、灭菌的枪头。

②农杆菌的稀释及二次摇菌：

农杆菌培养物稀释到液体MS培养基中；二次摇菌需6-10小时,OD600为0.2~0.5时可用于转化。

需准备的物品及试剂：

灭菌的三角瓶、枪头、2ml的离心管。

2.7.5侵染：

于超净台上将经预培养的烟草叶片在农杆菌稀释液中浸3min,用灭菌的滤纸吸去多余菌液后,继续放置在原来的培养基中。

2.7.6共培养（暗培养）：

925℃条件下暗培养，共培养2-4天，待叶片周围有白色菌产生.。

2.7.7选择培养：

将共培养的叶片转移至烟草再生培养基并附加500mg/L羧苄青霉素或者250mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素。

转移至光下在16h白天、8h黑夜的光周期和25℃条件下选择培养。

（观察拍照）

2.7.8继代培养:

选择培养2~3周后，将分化的抗性不定芽转入相应的选择培养基中进行继代扩繁培养。

2.7.9生根培养：

将生长至长1cm以上的小苗转移到含300mg/L羧苄青霉素、30mg/L卡那霉素的固体MS培养基上诱导生根.约2-3周后可见根的形成,从而得到再生完整植株.筛选。

生根培养基为1/2MS无激素培养基附加500mg/l的头孢霉素+100mg/l卡那霉素。

（观察拍照）

2．7.10移栽：

待这些完整植株生长到大约5cm时，并具有完整的根系后，移栽到花盆中，使之在温室中继续生长。

PartIII转基因植株的检测

一、gus（β-葡萄糖苷酸酶基因）的检测（组织化学定位染色法）

实验目的：

通过组织化学定位染色对转基因植株进行GUS活性检测。

实验原理：

gus来源于大肠杆菌染色体的uidA位点。

在一定条件下与X-glucuionicacid（5-bromo-4chloro-3indoyl-β-D-glucuronicacid）底物发生作用，发生蓝色沉淀反应，可以直接观察到植物组织由沉淀形成的蓝色斑点。

试剂:

⏹X-Gluc染色液的配制：

母液浓度加入体积终浓度

0.2MNa2HPO4/NaH2PO4（pH7.0）50ml100mM

0.5MEDTA（pH7.0）0.2ml1mM

铁氰化钾0.0164g0.05mM

亚铁氰化钾0.0212g0.05mM

TritonX-1000.1ml0.1%

无菌水49.7ml

总体积100ml

注：

121℃灭菌，母液两周内使用有效，最好现用现配

⏹X-Gluc反应液：

1mgX-Gluc用20μlDMSO（二甲基亚砜）或N，N-二甲酰氨（DMF）溶解后，加4ml染色液母液，所得X-Gluc的浓度为2mM

⏹一般固定液：

1％甲醛，50mM磷酸钠缓冲液，0.05％TritonX-100（Tween-20）

原生质体固定液

1％甲醛，0.3~0.6M甘露醇，10mMMES（甲基乙烷磺酸）pH5.6

FAA固定液：

5%甲醛，5%乙酸，5%乙醇

二、实验程序：

2.1材料的准备：

⏹瞬时表达检测取侵染后1～5d的材料，稳定表达检测取转化后处理6周后的材料

⏹叶片、幼根等制成徒手切片（小块、小片）

⏹悬浮细胞、原生质体低速离心收集，用无菌水等渗液洗涤

⏹清洁的愈伤组织可直接使用

2.2染色：

⏹直接染色法：

①将准备好的试材浸泡在染液中，于25～37C保温1hr至过夜；

②叶片等绿色材料转入70％乙醇中脱色2～3次，至阴性对照材料呈白色；

③肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为GUS表达位点。

实验结果拍照记录。

⏹固定染色法：

①将材料浸入固定液，必要时抽真空1min,室温下轻摇30～60min;

②取出材料，用磷酸钠缓冲液漂洗3～4次；

③将试材放入1.5ml无菌离心管中，加入染色液，浸没材料，盖上管盖，于37C水浴中保温几分钟至过夜;

④取出材料，用75％的乙醇漂洗，或放入FAA固定液中处理20min;

⑤先后用20％、50％乙醇各浸泡20min以上；

⑥显微镜下观察，白色背景上的蓝色斑点即为GUS表

⑥显微镜下观察，白色背景上的蓝色斑点即为GUS表达位点；实验结果拍照记录。

⑦染色后的材料可浸入含80％乙醇的FAA固定液中保存。

2.3注意事项：

①实验要设阴性对照，阴性对照应无蓝色出现，如产生蓝色即为本底。

其原因可能有：

a.试材或试剂的污染，尤其是材料的内生菌；b染色时间过长，时间越长，假阳性率增加。

②在需要进行较长时间染色时染色液中应加入0.02％NaN3或100g/ml的氯霉素，以便抑制细菌生长，减少本底。

③叶绿素含量高的试材染色后一定要进行脱色

④含多酚、木质素多的试材染色过程中会发生褐化，样品呈现褐色而掩盖GUS着色。

可将染色后的材料放到75％乳酸水溶液中，在1磅压力下加热15min，此法对烟草、马铃薯有效。

三、转基因植株的PCR检测

3.1实验目的：

3.1.1快速提取转基因植株的基因组DNA。

3.1.2通过PCR反应对基因转化植株进行快速检测。

实验原理:

依据PCR原理，通过基因特异引物对转基因植株中外源目的基因进行特异扩增，从而判断是否为转基因植株。

实验试剂、药品:

——液氮

——1×CTAB缓冲液：

50mmol/LTris-HClpH8,0.7mol/LNaCl,10mmol/LEDTApH8,1%CTAB,20mmol/L2巯基乙醇（用前加入）

——氯仿/异戊醇（24：

1）

——RNaseA：

2000U/ml，用0.15mol/LNaCl，0.015mol/L柠檬酸三钠配成10mg/ml；使用前100℃热处理15min除去残留的DNase活性

——异丙醇

——无水乙醇，3mol/L乙酸钠

——70%乙醇

——TE缓冲液：

10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTApH8

——PCR引物及反应试剂等。

仪器设备：

——PCR仪

——电泳设备

——离心机

——凝胶摄像仪

——水浴锅

——天平

——研钵和杵子

——37、65水浴

——移液枪

——离心管、枪头等各种耗材

植物材料：

——转基因植株、对照植株

实验程序：

1.转化植株的DNA的分离（CTAB法）

①取0.5g材料于液氮中研成粉末，移至预热的500μl2×CTAB缓冲液中（2%CTAB,100mmol/LTris-Cl,20mmol/LEDTA,1.4mmol/LNaCl,pH=8.0），轻轻转动离心管，混匀，然后置于65℃水浴放置60min。

②混合物冷至室温后加入等体积的氯仿/异戊醇。

轻轻颠倒离心管几次使管内混合物成乳浊液。

室温下10000rpm离心10min分相。

③将上清液（水相）移至一干净离心管中，加入1/100体积的RNaseA贮液，颠倒混匀，37℃保温30min。

④2/3体积异丙醇沉淀，混匀，室温下10000rpm离心10min，沉淀DNA。

⑤70%乙醇清洗沉淀。

⑥将DNA空气干燥15min，溶于TE缓冲液中。

4℃保存备用。

2.PCR反应

⏹引物序列

GUS基因：

GUSF:

5-AGTCGACATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCA–3（SalI）

GUSR:

5-ACTGCAGTCATTGTTTGCCTCCCTGCT–3（PstI）

GFP基因：

GFPF:

5-AGAGCTCATGGTAGATCTGACTAGTAAA–3（SacI）

GFPR:

5-AGGTACCTCACACGTGGTGGTGGTG–3（KpnI）

反应体系

成分体积

DNA模板1μL

上游引物（10pmol/μL）0.4μL

下游引物（10pmol/μL）0.4μL

10×PCRbuffer2μL

25mMMgCl21.6μL

2.5mMdNTP1.6μL

Taq酶（4,5units/μL）0.3μL

ddH2O12.7μL

Totalvolume20μL

反应条件

用转化植株的总DNA为模板，未转化植株作阴性对照，重组质粒作阳性对照，进行PCR扩增反应，

反应条件为：

94℃预变性5min后,94℃变性30sec，46~60℃退火40sec，72℃延伸1min，进行30个循环,最后72℃延伸10min，4℃保存。

电泳检测

PCR产物在1%~1.5%的agarose胶上电泳，拍照。