基因工程实验资料.docx

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基因工程实验资料

1.动物细胞DNA提取原理是什么?

答：

先用SDS裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸。

然后用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提，使蛋白质变性沉降到酚与水相的界面，DNA则留在水相中，离心后在上清液中加入醋酸钠和两倍体积无水乙醇，除去多糖物质和沉淀DNA，然后离心后沉淀用70%乙醇洗涤，最后用ddH2O溶解沉淀DNA，－20℃保存。

2.DNA提取中用到了哪些试剂？

有什么作用？

EDTA:

二价金属离子螯合剂，螯合Mg2+，抑制DNA酶活性。

因为Mg离子是DNA酶的辅因子。

SDS:

一种阴离子去污剂，在高温（55℃—65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸。

酚:

使蛋白质变性。

氯仿:

作为除杂剂，除去糖、脂等杂质；加速有机相与液相分离；抽提核酸溶液中残留的酚。

乙丙醇:

作为消泡剂；降低DNA的水溶性，让DNA从溶液中析出；有利于分层，使离心后的上层含DNA水相，中间的蛋白质相及下层有机溶液相维持稳定。

无水乙醇:

降低DNA的水溶性，沉淀DNA。

醋酸纳:

调PH，中和Tris-Buffer，形成中性环境，利于DNA沉淀。

Tris-Buffer（PH8.0）:

提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。

70％乙醇:

清洗溶液中离子及其他杂质。

NaCl:

提供高盐环境，使DNA溶解于液相中。

2.有机溶剂使用注意事项？

答：

①有机溶剂的容器，不论是否在使用中，都应随手盖紧。

②尽可能在通风位置工作，以避免吸入有机溶剂的蒸汽。

③尽可能避免皮肤直接接触。

3.PCR原理？

答：

将目的基因DNA在高温（94℃）下解链成为单链模板;人工合成的一对与目的基因两侧序列相互补的寡核苷酸引物在低温（40~60℃）下分别与变性的目的基因片段两侧的两条链的部分序列互补结合；在中等温度（65~75℃）下，由耐热的DNA聚合酶（Taq酶）将dNTP中的脱氧单核甘酸加到引物3，-OH末端，并以此为起点，沿着模板以5，→3，方向延伸，合成一条新的互补链。

4.PCR类型？

反转录PCR怎么做的?

答：

反向PCR、巢式PCR、锚定PCR、数字PCR、RT-PCR、实时荧光定量PCR、免疫捕捉PCR等。

RT-PCR的原理：

提取组织或细胞中的总RNA，以ployA（A）+选择性RNA为模板采用oligo（dT）、随机引物或基因特异性的引物GSP经反转录酶的作用从RNA合成cDNA。

再以cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因或检测基因表达。

5.PCR影响因素？

答：

引物；模板；DNA聚合酶；Mg2+；底物；反应缓冲液。

6.PCR体系有什么物质？

作用？

答：

①引物：

是两段与待扩增目的DNA序列侧翼片段具有互补碱基特异性的寡核苷酸，使DNA聚合酶以其3，-OH末端为起点合成互补链，决定了特定基因的扩增。

②模板：

提供DNA复制的模板，模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子。

③TaqDNA聚合酶：

将dNTP中的脱氧单核甘酸加到引物3，-OH末端，并以此为起点，沿着模板以5，-3，方向延伸，合成一条新的互补链。

④底物dNTPmix：

4种脱氧核苷酸，提供PCR反应的原料和能量。

⑤反应缓冲液：

反应缓冲液一般含有Tris-HCl、KCl和适当的Mg2+。

Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，Tris-HCl起缓冲作用，KCl有利于引物的退火。

7.怎样提高PCR产物的特异性？

 引物:

a.典型的引物18到24个核苷长。

引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。

但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。

较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。

b.选择GC含量为40％到60％或GC含量映像模板GC含量的引物。

c.设计5'端和中间区为G或C的引物。

这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。

d.避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。

e.避免3'末端富含GC。

设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。

f.避免3'末端的错误配对。

3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。

g.避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。

Mg2+:

浓度通常为0.5—2.0mmol/l，过高或过低均影响产物的特异性。

模板:

模板量应适宜，过量则可能增加非特异性。

延伸时间:

应适宜，时间过长会导致产物非特异性增加。

循环次数:

一般为30个（25—30个）周期，如果循环次数过高，会增加非特异性产物及其复杂度。

8.PCR都有哪些酶可以用？

答：

TaqDNA聚合酶；TthDNA聚合酶；Vent聚合酶；PfuDNA聚合酶。

见实验书69页。

9.T4DNA连接酶连接的原理？

答：

T4DNA连接酶作用机制：

酶先与ATP形成酶-AMP共价复合物，再与DNA作用、AMP转移至DNA缺口5，-磷酸基上形成焦磷酸键而活化5，-磷酸基，然后再与3，-羟基形成磷酸酯键，完成连接过程。

10.PCR产物与T载体怎样连接的？

答：

PMD18-T质粒0.5uL，PCR产物4.5uL，2×solution（含T4DNA连接酶）5uL，混匀后16℃水浴过夜。

11.DNA用试剂盒是怎么回收纯化得到的？

答：

依据吸附柱中的硅胶膜在高盐浓度下特异性吸附DNA，在低盐浓度下可被洗脱的原理。

按照100mg胶块加入700uL溶胶液的比例，55℃溶胶。

将融化的胶溶液转移到吸附柱中，离心后倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一收集管，加漂洗液离心洗涤，重复漂洗一次，去掉废液后放回吸附柱空转，尽量去除多余溶液。

再将吸附柱放入新的收集管中加入洗脱液，静置离心后去掉吸附柱，即为纯化产物。

12.DNA回收的注意事项?

答:

①加入的胶块溶化液的量要足量，保证胶能完全溶解，避免堵塞硅胶模

②确保WB液中已经加入了酒精

③把胶液倒入柱子后要静止2min以后再离心，使DAN完全吸附于膜上

④洗脱液要滴在膜中央，以充分洗脱结合在膜上的DNA。

⑤将离心后的洗脱液倒掉后，要在空离心。

13.连接为何在16℃？

答：

因为黏性末端的DNA双键间有氢键的作用，温度过高使氢键不稳定，但连接的最适温度恰为37℃，所以经综合考虑，采用16℃较为合适。

14.载体与目的基因连接时各自的量有什么讲究？

答：

连接时外源基因的量要多一些，载体的量要少一些，这样碰撞的机会就会多，否则载体自身环化就严重，一般载体DNA与目的基因连接采用1:

（1-3）的比。

连接酶的用量不宜过多。

15.Cacl2制备感受态原理？

答：

将细胞培养至OD600为0.4-0.6后放入冰浴中使其停止生长，然后将菌株置于低温预处理的低渗Cacl2溶液中，即造成细胞膨胀，细胞通透性发生暂时性的改变，从而极易与外源DNA相黏附并在细胞表面形成复合物

16.转化？

感受态?

以及其的影响因素？

答：

转化：

是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。

感受态：

指宿主细胞最易接受外源DNA片段并实现转化的一种生理状态，它是由宿主菌的遗传性所决定，同时也受菌龄；外界环境因子等的影响。

影响因素：

细胞的生长状态和密度、CaCl2处理时间、热击时间、感受态细胞的保存期、质粒DNA的质量和浓度、试剂的质量、防止杂菌和杂DNA的污染、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。

17.制备感受态的方法有哪些？

（大肠杆菌、农杆菌、酵母）

（1）大肠杆菌感受态制备方法：

CaCl2法制备

（2）农杆菌感受态制备：

CaCl法制备，类似于大肠杆菌的方法。

将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl溶液中，0oC下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。

制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于—70oC可保存相当一段时间而不会对其转化率有太大影响。

（3）酵母感受态制备：

18.热击转化的原理？

答：

利用CaCl2处理感受态宿主细胞，然后通过热击法处理，即置于42℃高温60—90s，细胞布朗运动剧烈，膜流动性增强，由于感受态细胞细胞膜有受伤，DNA进入细胞，然后降温在培养基上生长，表达足够的蛋白质，以使能在抗生素的平板上生长菌落。

19.蓝白斑筛选的原理？

答:

许多载体都带有一个大肠杆菌DNA的短区段，包含β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控区和N端146个氨基酸的编码信息。

在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），这种载体适合转入可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的受体细胞。

宿主和质粒单独编码的片段仅是β-半乳糖苷酶的部分序列，单独存在时没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶活性的蛋白质，即为互补。

由互补而产生的lacZ+细菌在诱导剂IPTG（异丙基-β-D硫代半乳糖苷）的作用下，在无色底物X-Gal存在时产生蓝色沉淀底物，使菌落显蓝色。

如果外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，无法实现互补，使得带有重组质粒菌落形成白色菌落。

20.LB的配方

答：

LB培养基：

1％胰化蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％Nacl。

即10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH调至7.2在补足水至1L。

固体培养基在LB培养基中添加1.5％~2％琼脂，121℃灭菌20min备用。

21.灭菌的过程？

121℃，灭菌20min。

首先往高压蒸汽灭菌锅内添适量水，然后把培养基放入锅内，锅盖对称拧紧。

待压力升至0.05MPa时，打开排气阀，排完气后，关闭排气阀。

待压力再次升至0.1MPa时，开始计时，直至升至0.15MPa时关闭电源开关。

待压力将至0.1MPa时，打开电源开关，升至0.15MPa时关闭电源。

如此循环，20分钟后，关闭电源，直到压力降至0时，打开排气阀，最后打开锅盖取出培养基。

22.涂板前在LB上37℃1h？

答：

质粒只有在大肠杆菌中跟随其复制，使拷贝数增加，转录翻译出足够的酶，才具有抗性。

23.转化常见方法？

答:

大肠杆菌：

化学转化法、电击法。

动植物细胞：

显微注射法、农杆菌转化法、基因抢法。

24.质粒DNA提取原理？

答：

基于环状质粒DNA相对分子质量小，易于复性的特点。

在热或碱性条件下DNA分子双链解开，若此时将溶液置于复性条件下，变性的质粒分子能在较短的时间内复性而染色体DNA不能复性。

经过离心除去变性的染色体DNA和蛋白质杂质沉淀，上清液中的DNA分子则利用无水乙醇与盐凝聚形成沉淀。

25.溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ有什么作用？

成分是什么？

答：

solutionⅠ：

含葡萄糖，Tris-Hcl（PH8.0），RNA酶和EDTA。

葡萄糖使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部；Tris-Hcl（PH8.0）提供一个适当的PH环境；EDTA螯合二价金属离子，抑制DNase的活性;RNA酶降解RNA。

solutionⅡ：

含NaOH和SDS。

NaOH使染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变形形成杂乱无章的片段，同时使质粒DNA的大部分氢键发生断裂；SDS用于溶解细胞膜上的脂肪和蛋白质。

solutionⅢ：

含NaAc或KAc（PH4.8），用于中和solutionⅡ中的碱性溶液，使得质粒可以复性，而染色体DNA则不能复性，从而经离心后把质粒分离出来。

26.TAKARA公司都有哪些产品？

有什么用途？

（酶、载体类型等）

27.限制性内切酶识别、切割有什么特点？

答：

识别和切割双链DNA分子内特殊的核苷酸序列。

其切口有两种类型：

平末端和黏性末端。

28.星号活性的影响因素?

答：

甘油体积分数过高（>5%）；酶过量（>100u/uL）；离子浓度低（<25mmoL/L）；PH过高（>8.0）等。

29.T载体的结构？

（从大连宝生物下载说明书阅读。

）

T载体是一种高效克隆PCR产物（TA的克隆）的专用质粒载体，为线性化载体，线性化后两侧3'端各多出一个脱氧胸苷酸（T），无需酶切可直接与游离