基因工程实验资料.docx

1、基因工程实验资料1.动物细胞DNA提取原理是什么?答：先用SDS裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸。然后用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提，使蛋白质变性沉降到酚与水相的界面，DNA则留在水相中，离心后在上清液中加入醋酸钠和两倍体积无水乙醇，除去多糖物质和沉淀DNA，然后离心后沉淀用70%乙醇洗涤，最后用ddH2O溶解沉淀DNA，20保存。2.DNA提取中用到了哪些试剂？有什么作用？EDTA:二价金属离子螯合剂，螯合Mg2+，抑制DNA酶活性。因为Mg离子是DNA酶的辅因子。SDS:一种阴离子去污剂，在高温（5565）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸。酚:使蛋白质变性

2、。氯仿:作为除杂剂，除去糖、脂等杂质；加速有机相与液相分离；抽提核酸溶液中残留的酚。乙丙醇:作为消泡剂；降低DNA的水溶性，让DNA从溶液中析出；有利于分层，使离心后的上层含DNA水相，中间的蛋白质相及下层有机溶液相维持稳定。无水乙醇:降低DNA的水溶性，沉淀DNA。醋酸纳:调PH，中和Tris-Buffer，形成中性环境，利于DNA沉淀。Tris-Buffer（PH8.0）:提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。70乙醇:清洗溶液中离子及其他杂质。NaCl:提供高盐环境，使DNA溶解于液相中。2.有机溶剂使用注意事项？ 答：有机溶剂的容器，不论是否在使用中，都应随手盖紧。尽可能在通风位置工作，以

3、避免吸入有机溶剂的蒸汽。尽可能避免皮肤直接接触。3.PCR原理？答：将目的基因DNA在高温（94）下解链成为单链模板;人工合成的一对与目的基因两侧序列相互补的寡核苷酸引物在低温（4060）下分别与变性的目的基因片段两侧的两条链的部分序列互补结合；在中等温度（6575）下，由耐热的DNA聚合酶(Taq酶）将dNTP中的脱氧单核甘酸加到引物3，-OH末端，并以此为起点，沿着模板以5，3，方向延伸，合成一条新的互补链。4.PCR类型？反转录PCR怎么做的?答：反向PCR、巢式PCR、锚定PCR、数字PCR、RT-PCR、实时荧光定量PCR、免疫捕捉PCR等。RT-PCR的原理：提取组织或细胞中的总R

4、NA，以ployA（A）+选择性RNA为模板采用oligo(dT)、随机引物或基因特异性的引物GSP经反转录酶的作用从RNA合成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因或检测基因表达。5.PCR影响因素？答：引物；模板；DNA聚合酶；Mg2+；底物；反应缓冲液。6.PCR体系有什么物质？作用？答：引物：是两段与待扩增目的DNA序列侧翼片段具有互补碱基特异性的寡核苷酸，使DNA聚合酶以其3，-OH末端为起点合成互补链，决定了特定基因的扩增。模板：提供DNA复制的模板，模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子。TaqDNA聚合酶：将dNTP中的脱氧单核甘酸加到引物3，-OH末端，

5、并以此为起点，沿着模板以5，-3，方向延伸，合成一条新的互补链。底物dNTPmix：4种脱氧核苷酸，提供PCR反应的原料和能量。反应缓冲液：反应缓冲液一般含有Tris-HCl、KCl和适当的Mg2+。Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，Tris-HCl起缓冲作用，KCl有利于引物的退火。7.怎样提高PCR产物的特异性？引物:a.典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。 b.选择GC含量为40到60或GC

6、含量映像模板GC含量的引物。 c.设计5端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。 d.避免引物对3末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。e.避免3末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。f.避免3末端的错误配对。3端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。 g.避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。Mg2+:浓度通常为0.52.0mmol/l，过高或过低均影响产物的特异性。模板:模板量应适宜，过量则可能增加非特异性。延伸时间:应适宜，时间过长会导致产物非特异性增加。循环次数:一般为30个（2530个）周期，

7、如果循环次数过高，会增加非特异性产物及其复杂度。8.PCR都有哪些酶可以用？答：TaqDNA聚合酶；TthDNA聚合酶；Vent聚合酶；PfuDNA聚合酶。见实验书69页。9.T4 DNA连接酶连接的原理？答：T4 DNA连接酶作用机制：酶先与ATP形成酶-AMP共价复合物，再与DNA作用、AMP转移至DNA缺口5，-磷酸基上形成焦磷酸键而活化5，-磷酸基，然后再与3，-羟基形成磷酸酯键，完成连接过程。10.PCR产物与T载体怎样连接的？答：PMD18-T质粒0.5uL，PCR产物4.5uL，2solution（含T4DNA连接酶）5uL，混匀后16水浴过夜。11.DNA用试剂盒是怎么回收纯化

8、得到的？答：依据吸附柱中的硅胶膜在高盐浓度下特异性吸附DNA，在低盐浓度下可被洗脱的原理。按照100mg胶块加入700uL溶胶液的比例，55溶胶。将融化的胶溶液转移到吸附柱中，离心后倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一收集管，加漂洗液离心洗涤，重复漂洗一次，去掉废液后放回吸附柱空转，尽量去除多余溶液。再将吸附柱放入新的收集管中加入洗脱液，静置离心后去掉吸附柱，即为纯化产物。12.DNA回收的注意事项?答: 加入的胶块溶化液的量要足量，保证胶能完全溶解，避免堵塞硅胶模确保WB液中已经加入了酒精把胶液倒入柱子后要静止2min以后再离心，使DAN完全吸附于膜上洗脱液要滴在膜中央，以充分洗脱结合在膜上

9、的DNA。将离心后的洗脱液倒掉后，要在空离心。13.连接为何在16？答：因为黏性末端的DNA双键间有氢键的作用，温度过高使氢键不稳定，但连接的最适温度恰为37，所以经综合考虑，采用16较为合适。14.载体与目的基因连接时各自的量有什么讲究？答：连接时外源基因的量要多一些，载体的量要少一些，这样碰撞的机会就会多，否则载体自身环化就严重，一般载体DNA与目的基因连接采用1:(1-3）的比。连接酶的用量不宜过多。15.Cacl2制备感受态原理？答：将细胞培养至OD600为0.4-0.6后放入冰浴中使其停止生长，然后将菌株置于低温预处理的低渗Cacl2 溶液中，即造成细胞膨胀，细胞通透性发生暂时性的改

10、变，从而极易与外源DNA相黏附并在细胞表面形成复合物16.转化？感受态?以及其的影响因素？ 答：转化：是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。感受态：指宿主细胞最易接受外源DNA片段并实现转化的一种生理状态，它是由宿主菌的遗传性所决定，同时也受菌龄；外界环境因子等的影响。影响因素：细胞的生长状态和密度、CaCl2处理时间、热击时间、感受态细胞的保存期、质粒DNA的质量和浓度、试剂的质量、防止杂菌和杂DNA的污染、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。17.制备感受态的方法有哪些？(大肠杆菌、农杆菌、酵母）（1） 大肠杆菌感受态制备方法：CaCl2

11、法制备（2） 农杆菌感受态制备：CaCl法制备，类似于大肠杆菌的方法。将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl溶液中，0oC下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70oC可保存相当一段时间而不会对其转化率有太大影响。（3） 酵母感受态制备： 18.热击转化的原理？答：利用CaCl2处理感受态宿主细胞，然后通过热击法处理，即置于42高温6090s，细胞布朗运动剧烈，膜流动性增强，由于感受态细胞细胞膜有受伤，DNA进入细胞，然后降温在培养基上生长，表达足够的蛋白质，以使能在抗生素的平板上生长菌落。19.蓝白斑筛选的原理？答: 许多载体都带

12、有一个大肠杆菌DNA的短区段，包含-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控区和N端146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），这种载体适合转入可编码-半乳糖苷酶C端部分序列的受体细胞。宿主和质粒单独编码的片段仅是-半乳糖苷酶的部分序列，单独存在时没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶活性的蛋白质，即为互补。由互补而产生的lacZ+细菌在诱导剂IPTG（异丙基-D硫代半乳糖苷）的作用下，在无色底物X-Gal存在时产生蓝色沉淀底物，使菌落显蓝色。如果外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，无法实现互补，使得带有重组质粒菌落形成白色菌落。20.LB的配方答：LB培养基：1胰化蛋

13、白胨、0.5酵母提取物、1Nacl。即10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH调至7.2在补足水至1L。固体培养基在LB培养基中添加1.52琼脂，121灭菌20min备用。21.灭菌的过程？121，灭菌20min。首先往高压蒸汽灭菌锅内添适量水，然后把培养基放入锅内，锅盖对称拧紧。待压力升至0.05MPa时，打开排气阀，排完气后，关闭排气阀。待压力再次升至0.1MPa时，开始计时，直至升至0.15MPa时关闭电源开关。待压力将至0.1MPa时，打开电源开关，升至0.15MPa时关闭电源。如此循环，20分钟后，关闭电源，直到压力降至0时，打开排气

14、阀，最后打开锅盖取出培养基。22.涂板前在LB上371h？答：质粒只有在大肠杆菌中跟随其复制，使拷贝数增加，转录翻译出足够的酶，才具有抗性。23.转化常见方法？答:大肠杆菌：化学转化法、电击法。动植物细胞：显微注射法、农杆菌转化法、基因抢法。24.质粒DNA提取原理？答：基于环状质粒DNA相对分子质量小，易于复性的特点。在热或碱性条件下DNA分子双链解开，若此时将溶液置于复性条件下，变性的质粒分子能在较短的时间内复性而染色体DNA不能复性。经过离心除去变性的染色体DNA和蛋白质杂质沉淀，上清液中的DNA分子则利用无水乙醇与盐凝聚形成沉淀。25.溶液、有什么作用？成分是什么？答：solution

15、：含葡萄糖，Tris-Hcl（PH8.0），RNA酶和EDTA。葡萄糖使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部；Tris-Hcl（PH8.0)提供一个适当的PH环境；EDTA螯合二价金属离子，抑制DNase的活性;RNA酶降解RNA。solution：含NaOH和SDS。NaOH使染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变形形成杂乱无章的片段，同时使质粒DNA的大部分氢键发生断裂；SDS用于溶解细胞膜上的脂肪和蛋白质。solution：含NaAc或KAc（PH4.8），用于中和solution中的碱性溶液，使得质粒可以复性，而染色体DNA则不能复性，从而经离心后把质粒分离出来。26.TAKARA公司都有哪些产品？有什么用途？（酶、载体类型等）27.限制性内切酶识别、切割有什么特点？答：识别和切割双链DNA分子内特殊的核苷酸序列。其切口有两种类型：平末端和黏性末端。28.星号活性的影响因素?答：甘油体积分数过高（5%）；酶过量（100u/uL）；离子浓度低（8.0）等。29.T载体的结构？（从大连宝生物下载说明书阅读。)T载体是一种高效克隆PCR产物(TA的克隆)的专用质粒载体，为线性化载体，线性化后两侧3端各多出一个脱氧胸苷酸(T)，无需酶切可直接与游离