第一章生物大分子制备.docx

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第一章生物大分子制备

生物化学技术

导论

生物化学技术实质就是生物化学实验手段和方法。

利用这些方法和手段对生物体进行各种水平尤其是分子水平的制备。

如：

核酸、蛋白质、酶等方面的结构分析、纯化、功能与结构的关系等多方面的研究。

生物化学技术是在生物化学实验技术基础上发展和推广开来的。

在生物化学、遗传学、微生物学、生物物理学、免疫学和信息学相互渗透和融会贯通形成了现代生物化学及分子生物学。

其后既形成了生命科学及医学前言学科并得以突飞猛进的发展。

在此中，生化技术和分子生物学技术起到了举足轻重的作用，而生物化学技术的发展、进步和创新又成为推动了生物化学与分子生物学理论的飞速发展的直接动力。

生物化学技术：

色谱技术、光谱技术、电泳技术、离心分离技术、生物大分子制备技术、放射同位素技术等。

生物化学技术与分子生物学技术的结合使得现代生物学成为当今乃至21世纪的前沿学科和热门领域。

而21世纪是生物革命的时代，它将为我们人类解决过去无法解决的三大难题。

第一章生物大分子制备技术

生物大分子：

蛋白质（包括酶）和核酸。

在当前迅速发展的现代生物学中，主要的研究方向就是以核酸和蛋白质的结构与功能为基础，从分子水平去认识生命现象。

因此，得到高纯度具有生物活性的目的物质成为一切研究的首位。

生物大分子的制备工作涉及物理、化学、生物等多学科知识。

但总的来说就是：

1、混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中。

如：

盐析、层析、结晶和有机溶剂提取等。

2、将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同的区域而达到分离目的。

如：

电泳、梯度密度离心、超滤等。

注意：

不管采取什么方法必须保持生物大分子的完整性和分子的生物活性。

生物大分子的制备步骤：

1、选择材料和预处理

2、细胞破碎和细胞器分离

3、提取、纯化与浓缩

4、干燥与保存

一、选择材料与预处理

微生微生物材料：

1、利用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶2、利用微生物体含有的生化物质：

蛋白质、核酸和胞内酶等。

使用微生物作为提取材料时要注意它的生长期。

因为，在它达到对数生长期时，酶和核酸的含量较高，可获得较高的产量。

植物材料：

利用材料的根、茎、叶、果实等部分提取其中的生物活性物质。

使用植物作为提取材料时要注意它的品种、生长地域、季节、气候条件等，甚至采摘的时间段都要考虑。

动物材料：

利用动物的脏器或组织提取有效成分。

主要是选择有效成分含量丰富的部分。

动物材料一般要进行绞碎、脱脂等处理。

上述处理后的材料，若不立即进行试验应冷冻保存！

而对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。

二、细胞的破碎与细胞器的分离

（一）细胞的破碎

1、高速组织捣碎机

将材料配置成稀糊状液，放置于捣碎杯内1/3体积，旋紧杯盖。

将调速器慢慢启动逐渐调至所需转速。

或采用间歇方式进行。

此方法适于动物内脏组织和植物肉质种子等。

2、玻璃匀浆器

将剪碎的组织放入匀浆器管中，插入研杵来回研磨，利用管内和研杵的磨砂部分将组织细胞破碎。

此方法适用于动物内脏和植物组织较嫩部分等。

适合处理较少量的细胞破碎。

其细胞破碎程度高于组织捣碎机。

2、超声波处理法

使用一定功率的超声波对细胞悬浊液进行处理，使细胞急剧震荡破碎。

此法多用于微生物材料，如用大肠杆菌制备各种酶。

此方法的缺点在于处理材料时会产生大量的热量，应注意降温。

而对于超声波敏感的酶和核酸要慎用此法。

采用此法时选用菌体质量浓度为50—100mg/ml,在10—100KHZ下，处理10—15分钟。

4、反复冻融法

将细胞在-20℃以下冰冻，室温解冻。

反复几次。

此时由于细胞内的水分形成冰粒和剩余细胞液的盐浓度增加引起溶胀，使细胞结构破碎。

常用于细菌的破壁和一些植物材料。

5、化学处理法

在细胞液中加入一定试剂，使其细胞膜破坏的方法。

如：

肿瘤细胞常采用加入SDS或去氧胆酸钠等破坏细胞膜使胞内物释放。

细菌的细胞壁较厚常采用溶菌酶破壁。

（二）细胞器的分离

各类生物大分子在细胞内的分布不同。

如：

DNA几乎全在细胞核内；RNA主要在细胞浆中。

各种酶在细胞中也有特定的位置，因此，要根据目的物质的存在位置选取提取材料。

蛋白质、酶、核酸在肝细胞中的分布情况

细胞器名称

主要蛋白质及酶

核酸

细胞核

线粒体

内质网（微粒体）

溶酶体

高尔基体

细胞膜

细胞液

精蛋白、组蛋白、核酸合成酶系

参与电子传递、氧化磷酸化、脂肪酸氧化、

TCA、氨基酸氧化的酶系及脲合成酶系

蛋白质合成酶系、羟化酶类

水解酶系

糖苷转移酶、粘多糖、类固醇合成酶系

载体与受体蛋白、特异抗体、ATP酶、

环化脲苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶

嘧啶与嘌呤代谢酶系、

氨基酸合成酶系、可溶性蛋白类

全部DNA

总RNA的10%

微量DNA

总RNA的5-10%

总RNA的50%

总RNA的30%

（主要是tRNA）

细胞器的分离一般采用差速离心法。

利用细胞各组分质量大小不同，沉降于离心管的不同区域，分离后得到所需组分。

常用于分离细胞器的介质：

蔗糖、氯化铯、葡萄糖、聚乙二醇等。

三、提取与纯化

提取——经过或破碎的细胞，置于一定条件的溶液中，使被提取的生物大分子充分释放出来的过程。

影响提取的因素：

被提取物质在提取溶液中溶解度的大小；由固相扩散到液相的难易程度。

物质在溶剂中溶解度大小与该物质的分子结构及溶剂的理化性质有关。

一般遵守：

“相似相溶”的原则。

对提取生物大分子，减小溶剂粘度、搅拌和延长提取时间可提高扩散速度，提高提取效率。

提取采用“少量多次”效果较好。

（一）蛋白质（酶）的提取

大部分蛋白质可溶于水、稀盐、稀酸和稀碱溶液。

少数与脂结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂。

因此，要采取不同的溶剂提取、分离和纯化蛋白质及酶。

1、水溶液

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质的稳定性好、溶解度高，是提取蛋白质的常用溶剂。

溶剂用量：

一般为原材料体积的1—5倍；

提取温度：

视被提取物质的性质而定。

（蛋白质溶解度随温度生高而增大，但温度过高会使蛋白质变性失活。

提取蛋白质和酶常采用低温（5℃以下）操作；

提取条件：

要均匀搅拌，加快扩散速度；

提取液的pH值：

选择偏离蛋白质或酶等电点两侧的pH值范围；防止过酸或过碱引起蛋白质可解离基团发生变化，导致蛋白质构象的不可逆改变。

一般碱性蛋白质使用偏酸性提取溶剂、酸性蛋白质使用偏碱性提取溶剂。

稀盐提取液的浓度：

稀盐溶液可促进蛋白质的溶解，即盐溶作用。

同时，稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点。

因此，在提取液中加入少量的NaCl等中性盐一般以0.15mol•L-1浓度为宜。

缓冲溶液常用0.02—0.05mol•L-1磷酸盐或碳酸盐溶液。

2、有机溶液

一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水，稀酸、稀碱和稀盐溶液，可采用乙醇、丁醇或丙酮等有机溶剂提取。

它们具有一定的亲水性，还有较强的亲脂性，是理想的脂蛋白提取液。

但提取时一定要在低温下进行。

丁醇对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越：

丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；它具有亲水性，在溶解度范围内不会引起酶的变性失活；此法温度和pH值的选择范围广，适用与所有的生物材料。

（二）蛋白质的分离纯化

蛋白质的分离纯化的方法很多，主要有：

根据蛋白质的溶解度不同；根据蛋白质分子大小差别；根据蛋白质带电情况；根据蛋白质配体的特异性差异等。

1、根据蛋白质溶解度不同的分离方法：

（1）蛋白质的盐析

中性盐对蛋白质的溶解度有显著的影响。

一般在低盐浓度下随盐浓度的升高，蛋白质溶解度增加称为盐溶。

随盐年度继续增大时，蛋白质溶解度不同程度的下降并先后析出，这种现象称为盐析。

高浓度的盐离子（如：

（NH4）2SO4的SO4-2和NH4+）有很强的水化作用，可夺取蛋白质的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。

进行盐析时，如溶液的pH值在蛋白质的等电点则效果更佳。

蛋白质分子的大小不同、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不同。

因此，可通过调节蛋白质溶液的中性盐浓度，使之分段沉淀。

血浆蛋白的分段盐析

硫酸铵的饱和度沉淀的主要蛋白质占血浆总蛋白

g.（100mlH2O）的质量分数，%

20纤维蛋白4

33—48优球蛋白3

40—46假球蛋白24

>50清蛋白69

影响盐析的因素：

a、温度：

除对温度较敏感的蛋白质在低温下（4℃）操作外，一般可在室温下进行。

b、pH值：

大多数蛋白质在等电点的浓盐溶液中溶解度最低。

c、蛋白质浓度：

一般蛋白质溶液含量掌握在25—30g•L-1。

蛋白质盐析常用的中性盐：

硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。

其中应用最广的是硫酸铵。

它具有溶解度的温度系数小（25℃，4.1mol•L-1；0℃，3.9mol•L-1）而溶解度大；分段盐析比其它盐效果好；不易引起蛋白质的变性。

硫酸铵溶液的pH值在4.5—5.5之间，当需要超出时，可用硫酸和氨水调节。

盐析沉淀后的蛋白质要除去其中的盐，常用透析（时间长，要低温）和葡聚糖凝胶（G-25或G-50）层析柱来处理（时间短）。

（2）等电点沉淀法

蛋白质在电中性时，其静电斥力最小，溶解度最小形成颗粒沉淀出来。

由于各种蛋白质的等电点不同，可利用调节溶液的pH值达到某一蛋白质的等电点使之沉淀进行分离。

此法多与盐析法结合使用。

（3）低温有机溶剂沉淀法

与水相溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）可使多数蛋白质溶解度降低并析出。

此法分离效率比盐析高，但蛋白质容易变性，应在低温下进行。

2、根据蛋白质分子大小的差别的分离方法

（1）透析与超滤

透析法是利用半透膜将大小不同的蛋白质分子分开。

超滤法是利用高压力或离心力，使水和其它小的溶质分子通过半透膜而蛋白质留在膜上。

选择不同孔径的滤膜截留不同相对分子质量的蛋白质。

（2）凝胶过滤法（分子排阻层析法或分子筛层析）

这是根据分子大小分离蛋白质混合物的有效方法之一。

主要填充材料是葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶。

3、根据蛋白质带电性质进行分离

根据蛋白质在不同的pH环境中带电性质和电荷数量不同将其分开。

（1）电泳法

各种蛋白质在同一pH条件下，因相对分子质量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同得以分开。

在电泳中等电聚焦电泳比较重要。

它主要是利用一种两性电解质作为载体。

电泳时两性电解质形成一个从正向负极逐渐增加的pH剃度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点pH位置就停止。

此法可用于分析和制备各种蛋白质。

（2）离子交换层析法

阳离子交换剂：

羟甲基纤维素；阴离子交换剂：

二乙氨基乙基纤维素。

当被分离蛋白质溶液流经阳离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，然后用改变pH或离子强度的方法将吸附的蛋白质从柱上洗脱下来。

4、根据配体特异性的分离方法—亲和层析法

亲和层析法是分离蛋白质的一种非常有效的方法。

它通常需要一步处理即可使某种待提纯分离的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来。

而且纯度很高。

此法根据某些蛋白质与另一种称为配体的分子能特异而非共价地结合。

如：

酶—辅酶、抗原—抗体、激素—受体等。

其原理：

先把待提纯的目的蛋白的配体共价连接到琼脂滩一类的多糖表面的功能团上，当混合蛋白流经层析柱时，待提纯的蛋白与特异的配体结合而吸附在层析柱上，其他杂蛋白流出，最后将与配体结合的特异蛋白洗脱下来。

蛋白质在组织和细胞中是以复杂的混合形式存在。

每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离、提纯和鉴定是生物化学中的重要部分。

至今还未有一种单独或一套现成方法可把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白