汇总RTPCR详细步骤.docx

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汇总RTPCR详细步骤

实验一哺乳动物细胞总RNA的提取、电泳（定量）

实验二反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）

实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳

实验一哺乳动物细胞总RNA的提取、电泳

一、实验目的

学习并掌握总RNA的分离提取，检测质量以及定量的方法。

二、实验原理

细菌的总RNA主要由rRNA、tRNA及mRNA组成，其中rRNA含量最多（占80%~85％）。

在pH6.0微酸环境下，RNA相对稳定，碱性环境下，易分解。

RNA酶极为稳定且广泛存在于细胞内外，环境中存在大量RNA酶，极易降解RNA，因而在RNA提取及相关分析实验中，如何避免RNA酶的污染及抑制内源和外源性RNA活性,是实验成败的关键。

RNA的产量取决于组织或细胞的来源，但是，通常每毫克组织可获得4~7μgRNA，每106细胞可获得5~10μgRNA，提取的RNAA260/A280比值一般为1.8~2.0。

在RNA相关实验过程中，须树立RNase-free思想：

1）样品新鲜，保存得当，以强变性剂，防止内源性RNase；2）人体上遍布RNase,养成操作时勤换一次性手套和口罩的好习惯；3）空气中灰尘和细菌含RNase，应建立干净的操作环境；

实验介绍如何使用TRIzol来分离总RNA。

TRIzol是一种酸性苯酚提取试剂，含有去垢剂，和使RNase失活的异硫氰酸胍，它能在破碎和溶解细胞时保持RNA的完整性，防止RNA降解。

（注意：

TRIzol具有强烈腐蚀作用，小心操作。

）

三、实验材料、试剂与器材

1、细胞（5х106Hela）

2、DEPC水溶液，PBS，TAE

3、氯仿，异丙醇，乙醇均为分析纯

4、TRIzol试剂购自Invitrogen

5、烧杯（1000，500，100，50ml若干），量筒（1000，500，250，50，20ml若干），玻璃棒，药勺，试剂瓶，三角瓶。

枪头（1000、200、20ul），离心管（0.2ml、0.5mlPCR管,1.5ml、2ml、7ml离心管），枪头盒。

四、实验步骤

1.RNA提取前的准备

1）、玻璃器皿，金属及耐250℃物品的处理：

于高温烘箱中干烤，180℃，5小时，干烤前均用锡箔纸密封器皿头部。

2）、塑料制品的处理：

0.05-0.1%的DEPC（焦碳酸二乙酯水）浸泡过夜：

●必须保证塑料制品被水浸透，内部没有气泡，对于小枪头、0.2ml、0.5mlPCR管，必要时应用枪逐个的用水灌注（这一步对于以后的实验保证非常重要，须小心操作）。

●泡过夜后，用镊子逐个敲去管内的DEPC水，装于干烤过的烧杯，加锡箔纸密封杯口；尽量敲去枪头内的水，装于处理过的枪头盒，报纸包好。

●121℃，30分钟高压灭菌，以消除残存的DEPC，否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性，且抑制后继酶促反应，烘干，备用。

●DEPC是蛋白质强变性剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。

具强挥发性，致癌物，因而使用时应在通风橱操作，需戴一次性手套，一次性口罩，小心操作。

3）、试剂的配制：

试验所用试剂也可用DEPC处理过夜，再高压灭菌,但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理，可用DEPC处理的水配制，并尽可能用未曾开封的试剂，然后高压灭菌。

所需烧杯等必须干烤处理以后方可用。

0.05-0.1‰的DEPC水（三蒸水），磁力搅拌器搅拌过夜或者摇床低速振荡过夜，121℃，30分钟高压灭菌。

2.RNA的提取（TRIzol法）：

安全去除细胞生长介质

往细胞培养瓶中加入1mlPBS洗涤单层细胞，不要将细胞破裂，倒出PBS洗涤液

向细胞培养瓶中加入2mlTRIzol，以枪小心吹打，分入2个1.5mlEP管中

室温下培育五分钟（使核蛋白复合物充分分离）时间可能更长30min

向EP管中加入0.2ml氯仿/1mlTRIzol，用力摇晃15秒钟，室温培育三分钟

12000g，4oC离心15min

小心吸取上层无色水样层（0.6ml/mlTRIzol）转移至一新EP管中

加入0.5ml/mlTRIzol异丙醇，室温放置15min

12000g，4oC离心10min，轻轻倒去上清

加入1ml/mlTRIzol75%乙醇洗涤RNA沉淀一次，7500r/min，4oC离心5min

弃上清，倒置EP管，5-10min空气干燥（勿完全干躁，难再溶），加入20ul的DEPC水

55℃加热RNA5-10min（提高RNA溶解度），-70℃保存

注意：

异硫氰酸胍是很强的蛋白变性剂，但它不能使RNA酶发生不可逆失活。

因此，假如去蛋白后，样本被残余的RNA酶污染，这些酶会在变性剂去除后，重新恢复活性。

因此，将水相中RNA彻底从有机相中分离出，并避免通过脏的容器和手套重新被蛋白污染，这点很重要。

3、紫外分光光度法检测RNA浓度

3、琼脂糖凝胶电泳检测（或RNA定量仪器）

1）、3%过氧化氢浸泡电泳槽、胶板、梳子30分钟以上后，以DEPC处理的水冲洗，备用；

2）、以DEPC处理的水稀释50хTAE（DEPC处理的水配制，高压灭菌）为1хTAE备用；

3）、用以上1хTAE配制1%琼脂糖凝胶电泳胶；

4）、电泳5V/cm电泳20min

5）、电泳图谱：

28s和18s条带清晰、28s亮度是18s亮度的2倍以上

实验二反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）

一、实验目的

通过本实验掌握RT-PCR工作原理及操作方法。

二、实验原理

逆转录-聚合酶链反应（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR）是间接对某一特定的RNA分子的扩增，可分作相对独立的两个步骤：

即RT（将mRNA反转录成cDNA）和PCR（通过聚合酶链式反应扩增特定的cDNA）。

其原理是：

由总RNA或poly（A）+RNA（mRNA）采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以此cDNA为模板以特定的寡核苷酸作引物进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因。

（一）、反转录酶的选择：

1．Money鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：

有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱；2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：

有强的聚合酶活性和RNA酶H活性；

3．Thermusthermophilus、Thermusflavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：

在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构；

4．MMLV反转录酶的RNaseH-突变体：

商品名为Superscript和SuperScriptⅡ。

此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。

（二）、合成cDNA引物的选择：

1．随机六聚体引物：

当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。

用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。

通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA；

2．Oligo（dT）：

是一种对mRNA特异的方法。

因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly（A+）尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。

由于Poly（A+）RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小；

3．特异性引物：

最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。

用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。

RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。

该技术主要用于：

分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

起始RNA模板质量、纯度对本实验至关重要，必须完整，且不被基因组DNA污染。

三、实验材料、试剂与器材

1．第一链cDNA合成试剂盒（promega公司）

2．dNTPmix：

含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM（申能博彩）

3．TaqDNA聚合酶（Takara）

4、特异引物（Invitrogen合成）

5、模板RNA（上次实验提得）

四、实验步骤

1.cDNA第一链的合成

目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。

现以promega公司提供的M-MLV试剂盒为例。

（1）在pcr管中，加入0.5μlinhibitor（40U/μl），加入总RNA0.5-2μg，在管中加10μMOligo（dT）12-182μl，补充适量的DEPCH2O使总体积达14μl（<15μl），轻轻混匀、离心；

（2）70℃加热5min，立即将微量离心管插入冰浴中，冰浴5min，离心，将液体收至管底，冰浴中加入下列试剂的混合物：

10mMdNTPmix       1.5μl

    5×PCRbuffer     5μl

    inhibitor（40U/μl）      1μl

M-MLV反转录酶1μl

    DEPC水            2.5μl

Total25μl 

42℃孵育60min。

（3）于94℃加热3min以终止反应。

（4）-20℃保存备用（第一链反应混合物可在-20℃保存3个月以上）。

2.PCR

（1）取PCR管，依次加入下列试剂：

      10×PCRbuffer    5μl

Mgcl22μl

  dNTP（10mM）         0.5μl

上游引物（10pM）   2μl

    下游引物（10pM）   2μl

第一链cDNA        1μl

       Taq酶（1u/μl）   1μl

ddH2O11.5μl

Total25μl 

（2）轻轻混匀，离心；

（3）设定PCR程序。

在适当的温度参数下扩增28-32个循环。

条件：

1.94℃5min

2.94℃40sec

3.60℃40sec

4.72℃15sec

5.GoTo2,32cycles

10.4℃Forever

（4）电泳鉴定：

进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；

（5）密度扫描、结果分析：

采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描,检测相对表达量。

五、注意事项

1．逆转录反应过程，需建立无RNAase环境，以避免RNA的降解；

2．为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照；

3．内参的设定：

主要为了用于靶RNA的定量，防止假阴性，常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等；

4．防止DNA的污染：

（1） 可采用DNA酶处理RNA样品。

（2） 在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。

实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳

一、实验目的

学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法，检测质粒DNA的纯度、浓度与分子量。

二、实验原理

琼脂糖（agarose）是一种直链多糖，是由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成的线型多聚糖。

由于链状琼脂糖分子相互以氢键交联，因此与琼脂一样能形成凝胶。

琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的基团，不引起DNA变性，不吸附被分离的物质，是一种很好的凝胶剂。

45℃开始形