汇总RTPCR详细步骤.docx
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汇总RTPCR详细步骤
实验一哺乳动物细胞总RNA的提取、电泳(定量)
实验二反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)
实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳
实验一哺乳动物细胞总RNA的提取、电泳
一、实验目的
学习并掌握总RNA的分离提取,检测质量以及定量的方法。
二、实验原理
细菌的总RNA主要由rRNA、tRNA及mRNA组成,其中rRNA含量最多(占80%~85%)。
在pH6.0微酸环境下,RNA相对稳定,碱性环境下,易分解。
RNA酶极为稳定且广泛存在于细胞内外,环境中存在大量RNA酶,极易降解RNA,因而在RNA提取及相关分析实验中,如何避免RNA酶的污染及抑制内源和外源性RNA活性,是实验成败的关键。
RNA的产量取决于组织或细胞的来源,但是,通常每毫克组织可获得4~7μgRNA,每106细胞可获得5~10μgRNA,提取的RNAA260/A280比值一般为1.8~2.0。
在RNA相关实验过程中,须树立RNase-free思想:
1)样品新鲜,保存得当,以强变性剂,防止内源性RNase;2)人体上遍布RNase,养成操作时勤换一次性手套和口罩的好习惯;3)空气中灰尘和细菌含RNase,应建立干净的操作环境;
实验介绍如何使用TRIzol来分离总RNA。
TRIzol是一种酸性苯酚提取试剂,含有去垢剂,和使RNase失活的异硫氰酸胍,它能在破碎和溶解细胞时保持RNA的完整性,防止RNA降解。
(注意:
TRIzol具有强烈腐蚀作用,小心操作。
)
三、实验材料、试剂与器材
1、细胞(5х106Hela)
2、DEPC水溶液,PBS,TAE
3、氯仿,异丙醇,乙醇均为分析纯
4、TRIzol试剂购自Invitrogen
5、烧杯(1000,500,100,50ml若干),量筒(1000,500,250,50,20ml若干),玻璃棒,药勺,试剂瓶,三角瓶。
枪头(1000、200、20ul),离心管(0.2ml、0.5mlPCR管,1.5ml、2ml、7ml离心管),枪头盒。
四、实验步骤
1.RNA提取前的准备
1)、玻璃器皿,金属及耐250℃物品的处理:
于高温烘箱中干烤,180℃,5小时,干烤前均用锡箔纸密封器皿头部。
2)、塑料制品的处理:
0.05-0.1%的DEPC(焦碳酸二乙酯水)浸泡过夜:
●必须保证塑料制品被水浸透,内部没有气泡,对于小枪头、0.2ml、0.5mlPCR管,必要时应用枪逐个的用水灌注(这一步对于以后的实验保证非常重要,须小心操作)。
●泡过夜后,用镊子逐个敲去管内的DEPC水,装于干烤过的烧杯,加锡箔纸密封杯口;尽量敲去枪头内的水,装于处理过的枪头盒,报纸包好。
●121℃,30分钟高压灭菌,以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性,且抑制后继酶促反应,烘干,备用。
●DEPC是蛋白质强变性剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。
具强挥发性,致癌物,因而使用时应在通风橱操作,需戴一次性手套,一次性口罩,小心操作。
3)、试剂的配制:
试验所用试剂也可用DEPC处理过夜,再高压灭菌,但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理,可用DEPC处理的水配制,并尽可能用未曾开封的试剂,然后高压灭菌。
所需烧杯等必须干烤处理以后方可用。
0.05-0.1‰的DEPC水(三蒸水),磁力搅拌器搅拌过夜或者摇床低速振荡过夜,121℃,30分钟高压灭菌。
2.RNA的提取(TRIzol法):
安全去除细胞生长介质
往细胞培养瓶中加入1mlPBS洗涤单层细胞,不要将细胞破裂,倒出PBS洗涤液
向细胞培养瓶中加入2mlTRIzol,以枪小心吹打,分入2个1.5mlEP管中
室温下培育五分钟(使核蛋白复合物充分分离)时间可能更长30min
向EP管中加入0.2ml氯仿/1mlTRIzol,用力摇晃15秒钟,室温培育三分钟
12000g,4oC离心15min
小心吸取上层无色水样层(0.6ml/mlTRIzol)转移至一新EP管中
加入0.5ml/mlTRIzol异丙醇,室温放置15min
12000g,4oC离心10min,轻轻倒去上清
加入1ml/mlTRIzol75%乙醇洗涤RNA沉淀一次,7500r/min,4oC离心5min
弃上清,倒置EP管,5-10min空气干燥(勿完全干躁,难再溶),加入20ul的DEPC水
55℃加热RNA5-10min(提高RNA溶解度),-70℃保存
注意:
异硫氰酸胍是很强的蛋白变性剂,但它不能使RNA酶发生不可逆失活。
因此,假如去蛋白后,样本被残余的RNA酶污染,这些酶会在变性剂去除后,重新恢复活性。
因此,将水相中RNA彻底从有机相中分离出,并避免通过脏的容器和手套重新被蛋白污染,这点很重要。
3、紫外分光光度法检测RNA浓度
3、琼脂糖凝胶电泳检测(或RNA定量仪器)
1)、3%过氧化氢浸泡电泳槽、胶板、梳子30分钟以上后,以DEPC处理的水冲洗,备用;
2)、以DEPC处理的水稀释50хTAE(DEPC处理的水配制,高压灭菌)为1хTAE备用;
3)、用以上1хTAE配制1%琼脂糖凝胶电泳胶;
4)、电泳5V/cm电泳20min
5)、电泳图谱:
28s和18s条带清晰、28s亮度是18s亮度的2倍以上
实验二反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)
一、实验目的
通过本实验掌握RT-PCR工作原理及操作方法。
二、实验原理
逆转录-聚合酶链反应(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction,RT-PCR)是间接对某一特定的RNA分子的扩增,可分作相对独立的两个步骤:
即RT(将mRNA反转录成cDNA)和PCR(通过聚合酶链式反应扩增特定的cDNA)。
其原理是:
由总RNA或poly(A)+RNA(mRNA)采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA,再以此cDNA为模板以特定的寡核苷酸作引物进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因。
(一)、反转录酶的选择:
1.Money鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶:
有强的聚合酶活性,RNA酶H活性相对较弱;2.禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶:
有强的聚合酶活性和RNA酶H活性;
3.Thermusthermophilus、Thermusflavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶:
在Mn2+存在下,允许高温反转录RNA,以消除RNA模板的二级结构;
4.MMLV反转录酶的RNaseH-突变体:
商品名为Superscript和SuperScriptⅡ。
此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA,这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
(二)、合成cDNA引物的选择:
1.随机六聚体引物:
当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时,可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时,体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板,PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA;
2.Oligo(dT):
是一种对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾,此引物与其配对,仅mRNA可被转录。
由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%,故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小;
3.特异性引物:
最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物,若PCR反应用二种特异性引物,第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。
用此类引物仅产生所需要的cDNA,导致更为特异的PCR扩增。
RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于:
分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
起始RNA模板质量、纯度对本实验至关重要,必须完整,且不被基因组DNA污染。
三、实验材料、试剂与器材
1.第一链cDNA合成试剂盒(promega公司)
2.dNTPmix:
含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM(申能博彩)
3.TaqDNA聚合酶(Takara)
4、特异引物(Invitrogen合成)
5、模板RNA(上次实验提得)
四、实验步骤
1.cDNA第一链的合成
目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售,其原理基本相同,但操作步骤不一。
现以promega公司提供的M-MLV试剂盒为例。
(1)在pcr管中,加入0.5μlinhibitor(40U/μl),加入总RNA0.5-2μg,在管中加10μMOligo(dT)12-182μl,补充适量的DEPCH2O使总体积达14μl(<15μl),轻轻混匀、离心;
(2)70℃加热5min,立即将微量离心管插入冰浴中,冰浴5min,离心,将液体收至管底,冰浴中加入下列试剂的混合物:
10mMdNTPmix 1.5μl
5×PCRbuffer 5μl
inhibitor(40U/μl) 1μl
M-MLV反转录酶1μl
DEPC水 2.5μl
Total25μl
42℃孵育60min。
(3)于94℃加热3min以终止反应。
(4)-20℃保存备用(第一链反应混合物可在-20℃保存3个月以上)。
2.PCR
(1)取PCR管,依次加入下列试剂:
10×PCRbuffer 5μl
Mgcl22μl
dNTP(10mM) 0.5μl
上游引物(10pM) 2μl
下游引物(10pM) 2μl
第一链cDNA 1μl
Taq酶(1u/μl) 1μl
ddH2O11.5μl
Total25μl
(2)轻轻混匀,离心;
(3)设定PCR程序。
在适当的温度参数下扩增28-32个循环。
条件:
1.94℃5min
2.94℃40sec
3.60℃40sec
4.72℃15sec
5.GoTo2,32cycles
10.4℃Forever
(4)电泳鉴定:
进行琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果;
(5)密度扫描、结果分析:
采用凝胶图像分析系统,对电泳条带进行密度扫描,检测相对表达量。
五、注意事项
1.逆转录反应过程,需建立无RNAase环境,以避免RNA的降解;
2.为了防止非特异性扩增,必须设阴性对照;
3.内参的设定:
主要为了用于靶RNA的定量,防止假阴性,常用的内参有G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-Actin(β-肌动蛋白)等;
4.防止DNA的污染:
(1) 可采用DNA酶处理RNA样品。
(2) 在可能的情况下,将PCR引物置于基因的不同外显子,以消除基因和mRNA的共线性。
实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳
一、实验目的
学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法,检测质粒DNA的纯度、浓度与分子量。
二、实验原理
琼脂糖(agarose)是一种直链多糖,是由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成的线型多聚糖。
由于链状琼脂糖分子相互以氢键交联,因此与琼脂一样能形成凝胶。
琼脂糖带有亲水性,不含有带电荷的基团,不引起DNA变性,不吸附被分离的物质,是一种很好的凝胶剂。
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