抗菌肽开发生产现状.docx

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抗菌肽开发生产现状

抗菌肽开发生产现状

抗菌肽是生物体产生的一种具有抗菌活性的多肽，广泛存在于自然界中，如动物的免疫细胞（如吞噬细胞）、各种脏器的粘膜、皮肤以及植物的花、果、叶中，目前世界上已知的抗菌肽有1200多种。

3.1抗菌肽开发生产方法

在过去的几十年内，已经发现许多种抗菌肽。

这些肽类物质被分为两类，一类是非核糖体合成的抗菌肽，如短杆菌肽、多黏菌素、杆菌肽和糖多肽等，主要是由细菌产生，并经结构修饰而获得；另一类是由核糖体合成的天然抗菌肽，是生物机体在抵御病原微生物的防御反应过程中所产生的一类抗微生物与一些恶性细胞的短肽（antimicrobialandmalignant-cell-toxicpeptides）。

这些肽类是由基因编码、宿主细胞产生的一类抗菌分子，是有机体在进化过程中为适应环境、求得生存而最早产生的免疫活性分子，其分子量较小，一般在4000Dr左右，肽链在几十个氨基酸残基左右，被认为是天然免疫的重要介质，对G（右上为＋）菌、G（右上为－）菌、霉菌、螺旋体、病毒（如流感病毒、疱疹病毒、艾滋病病毒）等均具有很强的杀伤活性。

Steiner等于1981年发现，所有抗菌肽都是由较大的前体分子经过加工修饰得来的。

这些加工修饰过程包括蛋白酶水解、糖基化、羧基端酰胺化、以及氨基端异构化、卤化、环化等。

值得一提的是，还有一些抗菌肽是由较大的蛋白分子水解而来的，这些来源的抗菌肽也具有广泛的抗菌功能。

这类蛋白质包括乳铁蛋白、母鸡卵传铁蛋白、溶菌酶、杀菌/渗透作用促进蛋白、组织蛋白酶G、组蛋白2A和补体分子等。

3.1.1非核糖体合成的抗菌肽

非核糖体合成的抗菌肽是由细菌、真菌和链霉菌等分泌的具有抗菌活性的肽类物质。

研究表明，这类抗菌肽是按照多载体硫模板机制在肽合成酶的作用下合成的。

肽合成酶基因（如杆菌肽S生物合成操纵子grsB）大小为13kb，含有4--6个模板，每个模板都可识别、激活一个氨基酸残基，并且在必要的时候对其进行修饰，添加到正在合成的肽链上。

其中，最小的模板可激活一个氨基酸残基或羟酸残基，在以共价键与模板结合的辅因子（4’－磷酸泛酰巯基乙胺）的协同作用下将激活的氨基酸聚合到肽链上，并且还可稳定已激活的氨基酸残基。

在这种机制控制下可以合成许多含有羟基、L-氨基酸和D-基酸的肽类物质，再通过N-基化、酰化、糖基化或杂环形成作用等进一步的化学修饰，成为具有生物活性的抗菌肽。

多黏菌素B带有5个正电荷，短杆菌肽S带有2个正电荷，在本质上它们都是阳离子抗菌肽。

多黏菌素对G（右上为－）菌的抗菌活性强，主要敏感菌有大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、布鲁氏菌、弧菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌等，尤其对绿脓杆菌具有强大的杀菌作用。

短杆菌肽S和杆菌肽主要作用于G（右上为+）菌。

杆菌肽对耐药的金黄色葡萄球菌、肠球菌、链球菌有效，对螺旋体和放线菌也有效，但对G（右上为－）菌无效。

有资料表明，短杆菌肽S对G（右上为－）菌和白色念珠菌有很强的活性。

杆菌肽是通过抑制G（右上为＋）菌胞浆内的肽聚糖前体转变为焦磷酸萜醇，从而起到抑菌作用的；多黏菌素是通过破坏细菌胞膜而起到杀菌作用的；其他非核糖体合成的抗菌肽，如链阳菌素是通过抑制细菌蛋白质合成起到抑菌作用的。

黏杆菌素是阳离子脂肽多黏菌素E的一种甲硫衍生物，应用其气雾剂治疗肺部绿脓杆菌感染已取得成功。

对天然脂肽进行化学修饰的目的是为了降低全身应用时的毒性。

天然脂肽的部分毒性可能来自于肽链上的脂尾，有些学者认为多黏菌素的非酰基化衍生物在全身应用时会出现较强的毒性反应，非酰基化短杆菌肽S可引起溶血。

因此，该类抗生素的广泛应用受到了限制。

非核糖体合成抗菌肽的发现为人类提供了丰富的新型抗菌药物资源。

目前，人们主要通过3种途径开发这类抗生素。

第一，对现有抗菌肽及其衍生物通过化学修饰的方法来寻求新的抗生素。

比如，链阳菌素是20世纪50年代发现的一环状抗菌肽家族，其抗菌性很强，但是可溶性极差，通过化学方法已得到2种水溶性半合成链阳菌素，即dalfopristin和quinupristin，作为抗耐药G（右上为+）菌制剂已完成Ⅲ期临床试验。

第二，利用模板合成抗菌肽，这是比较令人振奋的方法。

Schneider等指出，组装新型肽类合成模板，从而得到新的结构，这样，很有可能得到好多抗菌肽骨架化学结构。

第三，利用得到的化学结构为母体进行化学合成。

短杆菌肽就是一个很好的例子，具有母环大小不一、电荷、氨基酸序列和疏水性各异的短杆菌肽S衍生物对细菌具有高度选择性。

3.1.2核糖体合成的抗菌肽

早在几个世纪以前，人们就知道蛙皮有药用价值，但是直到1962年Kiss和Michl从铃蟾（Bombinavariegata）皮肤分泌物中发现具有抗菌且溶血作用的肽类，并且最终从中分离出了含有22个氨基酸的抗菌肽（bombinin），人们才了解到蛙皮之所以具有抗菌作用，是由于其中含有抗菌肽之类的活性物质。

1972年，具有抗菌且溶血作用的肽类melittin从蜜蜂毒液被分离出。

此后，人们对这类阳离子抗菌肽的结构与作用机理进行了深入研究，到目前为止，在各种生物体内发现的抗菌肽达700多种。

包括细菌、真菌、昆虫、被囊动物（tunicate）、两栖类动物、甲壳类动物、鸟类、鱼类、哺乳动物（包括人类）以及植物在内的所有生物体都可产生抗菌肽。

在哺乳动物中，抗菌肽（如defensins）是嗜中性白细胞的主要蛋白成分（占总蛋白10％--18％）。

在损伤黏膜表面抗菌肽的浓度升高，成为黏膜防御的重要物质。

抗菌肽对G（右上为+）菌、G（右上为-）菌、真菌、囊膜病毒、癌细胞和寄生虫都有活性，能促进创伤愈合，还具有趋化作用。

一个好的抗菌肽应该对多数细菌有效，并且对多耐药性绿脓杆菌、耐meticillin金黄色葡萄球菌和Stenotrophomonasmaltophilia高度有效。

有些细菌也会对抗菌肽产生抗药性，但只是轻度抗药。

尽管抗菌肽在长度上千差万别，几乎所有的抗菌肽在本质上都是阳离子型，其高级结构无论是以а-螺旋还是以β-折叠出现，两亲结构是它们的共同特征。

Boman等研究发现猪cecropinP1是通过裂解细菌而达到杀菌目的，而PR-39是通过阻断细菌蛋白质和DNA合成而达到杀菌目的。

Christensen等研究认为，在质膜与水相界面上，抗菌肽与脂质双层间首先通过静电相吸而靠近，借助于分子中N端与C端间的连接结构的柔性，抗菌肽分子中的疏水端插入质膜中，然后两亲性а-螺旋也插入质膜中。

从中性粒细胞分离的defensins具两亲β-折叠构型，杀菌活性在于渗透大肠杆菌的外膜和内膜，类似于cecropins在膜上形成离子通道。

不管是具有а-螺旋还是β-折叠结构的抗菌肽，都有形成通道的能力，即通道形成在抗菌活性中起着重要作用，此外，阳离子特性也是抗菌活性必需的。

对于G（右上为-）菌，抗菌肽易与其外膜上的带负电脂多糖相互作用，从而破坏外膜结构以穿越内膜，而G（右上为+）菌不具有脂多糖膜，但其表面由于肽聚糖中胞壁酸、糖醛酸、磷壁酸和氨基酸羧基的存在而带负电，抗菌肽也能破坏肽聚糖层而穿透质膜。

抗菌肽可以中和G（右上为-）菌脂多糖、G（右上为+）菌脂磷壁酸和细菌未甲基化CpGDNA等细菌信号分子。

这些信号分子可以与宿主细胞表面Toll样受体结合，启动信号级联放大和细胞因子（如TNF、IL-6等）正调节。

低浓度细菌信号分子可引发机体有益的炎症反应和发热，但是如果反应剧烈或持续时间延长，可以导致全身循环障碍、器官衰竭，甚至死亡。

抗菌肽可抑制脂多糖与血清脂多糖结合蛋白因子结合，防止内毒素血症和死亡。

抗菌肽还参与宿主天然免疫的其他反应，比如刺激单核细胞和嗜中性白细胞的趋化作用、促进肥大细胞组织胺的释放、抑制组织蛋白酶以及促进创伤愈合。

微量测定实验证明，抗菌肽可以选择性地正调节30多种基因的表达。

但是，至今仍没有完整的动物模型资料来证明抗菌肽在这些反应中起着重要作用。

3.1.3抗菌肽的基因工程

抗菌肽在生物体内含量极微，从生物体中提取抗菌肽工艺复杂、产量低、费时长，价格昂贵，无法实现大规模生产，这成为制约抗菌肽进入实际应用的最大障碍。

因此，利用基因工程技术生产抗菌肽具有重要意义。

目前在该领域主要运用以下方法：

首先是利用差异显示技术（differentialdisplayDD），对进行诱导和未进行诱导的生物基因的差异表达进行研究，筛选出抗菌肽阳性克隆，酶切、测序，可得到一些新的抗菌肽类相关基因，据此设计引物进行RT-PCR扩增，并将此扩增片断导入克隆载体和表达载体，或是采用融合表达的方法，该方法是将抗菌肽基因与另外一种基因连接起来，共同构建成融合基因，再克隆到表达载体上，最后经诱导、表达而得到抗菌肽基因表达的蛋白。

之所以采用融合表达的方法，是因为抗菌肽所携带的碱性氨基酸对蛋白酶非常敏感，而采用融合表达的方法可抵消其碱性并降低其对宿主细胞的毒性。

虽然现在抗菌肽的基因工程取得了很大的成就，但存在的问题也不容忽视。

比如如何进一步提高表达水平，提高基因表达产物的稳定性，设计并合成杀菌活力更强、杀菌谱更广的抗菌肽等，都是需要解决并值得深入研究的课题。

3.1.4抗菌肽的合成进展

抗菌肽种类繁多，到目前为止已经有500多种抗菌肽被分离和鉴定，仅从昆虫体内分离获得的就多达170余种。

采用生物合成法制备抗菌肽成本太高，从自然界生物体中直接提取抗菌肽方法复杂，产量甚微，均无临床实际应用的可能。

最近以大肠杆菌作为表达系统，采用高效融合表达技术在形成得到无活性包涵体的基础上，通过剪切和纯化获得了生物活性与天然抗菌肽相当的目的基因产物，即采用基因重组技术生产的功能性抗菌肽。

如抗菌肽以羧基末端与牛凝乳酶原为氨基末端在大肠杆菌中融合表达后，可形成凝乳酶原-2融合抗菌蛋白。

虽然2抗菌肽本身具有抗菌活性，但当其与凝乳酶原结合后，在大肠杆菌胞浆中是以不可溶形式存在，因此，对大肠杆菌不会产生任何毒杀作用。

收获此种融合抗菌蛋白，经酶切纯化后即可获得具有杀菌活性的2抗菌肽。

为了提高表达，采用了一种结合蛋白即2蛋白和突变体，以串联表达目的抗菌肽的方式，在7表达系统中使抗菌肽得到了高效表达。

采用真核细胞如酵母和哺乳动物细胞作为表达体系，则可避免目的基因产物即抗菌肽对宿主细胞的毒性作用。

姜明等通过电镜观察了柞蚕抗菌肽对大肠杆菌的作用。

发现经一定时间的作用后。

在细菌外壁形成了喇叭状缺口，这说明抗菌肽分子是以一端插入细菌细胞膜，通过打孔形成一个通道，使细菌细胞膜破裂，原生质泄漏而死亡。

从这点看，抗菌肽的正电荷与细菌胞膜的磷脂头负电荷间的作用至关重要，在肽分子中N端α-螺旋的双亲性是裂解细菌的主要部分，C末端的酰胺化与广谱抗菌有关。

从而可看出抗菌肽的抗菌机理与通过阻断大分子的生物合成来发挥作用的抗菌素的抗菌机理完全不同，且病原菌不易对其产生耐药性，因此该物质将成为新抗菌药的来源。

上述方法均为高产低成本生产抗菌肽提供了可能。

转基因技术为抗菌肽的生产提供了另一有效途径。

已有多种转基因植物，特别是在转基因烟草、土豆和西红柿等的建立已获得了长足进展。

转基因动物也有陆续的报道，其中用2.9的微小基因25（包括两个2外显子和1.4的5.上游序列）的转基因小鼠已成功建立。

该种转基因鼠对经口感染的鼠伤寒沙门菌具有很强的抵抗能力。

转基因动物模型的建立不仅为抗菌肽的大规模生产奠定了基础，而且有助于探讨某种特定抗菌肽在体内所起的生物学作用。

抗菌肽具广谱抗菌作用，对畜禽具促生长、保健和治疗疾病的功能，属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类环保型制剂。

可应用生物工程的技术方法生产抗病菌的转基因动植物产品，同时可以通过基因工程的技术方法大量的表达抗菌肽，使之成为新一代肽类抗菌药的来源，具有出广阔的应用前景。

目前关于抗菌肽的研究大多数处于实验室阶段，对于抗菌肽的基础与临床应用研究有待于进一步深入。

如：

对于抗菌肽的免疫原性、毒性、药动学及药效学的研究还较为有限，抗菌肽的临床试验仍局限于局部治疗。

其次，抗菌肽分子量小，分离纯化困难；天然含量极微，提取步骤烦琐、得率低；化学合成成本高，价格昂贵，难以在实际推广中应用。

利用基因工程技术在微生物中直接表达抗菌肽基因，抗菌肽对宿主菌有很强的杀伤力而不能获得表达产物，这就需要以融合蛋白的形式表达抗菌肽基因，但有表达效率低等问题，要解决此问题，关键在于选择合适的强启动子，以提高抗菌肽的生产效率，降低其生产成本。

但可以预见，随着抗菌肽基因工程技术研究的不断深入和分子生物学技术在抗菌肽上的成熟应用，将会有一批用现代生物技术方式大量生产且抗菌活性高的抗菌肽新产品出现。

3.2国外抗菌肽开发生产状况

…此处省略,详情请见六鉴网（）《抗菌肽市场调研报告》

3.3国内抗菌肽开发生产状况

国内有多研究开发抗菌肽的，如：

东北农业大学生命科学学院、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室、华南农业大学、南开大学、天津大学、中国科学院上海生化与细胞所、中国水稻所、中国农业科学院生物技术研究中心、深圳市翰宇生物工程有限公司、中国科学院昆明动物研究所、河南农业大学食品科技学院、河南亚卫动物药业有限公司、南方医科大学公共卫生与热带医学学院病原生物学系、华南理工大学轻工与食品学院、宜春学院生命科学与资源环境学院、江西农业大学动物科学技术学院等等。

华南农业大学教授黄自然及其研究组从我国特有物种柞蚕蛹中经人工诱导和提取的产物（溶菌酶）--抗菌肽，是经过十几年的努力取得的一项首创性科研成果。

抗菌肽医药产品即以生物工程方法将抗菌肽纯化为一类新型药物。

具有广谱性杀菌作用，并能抑制乙型肝炎病毒的复制。

特别是对耐药性细菌，抗菌肽有较强杀灭作用，并能选择性杀伤肿瘤细胞，是一种具有作用靶点及新作用机制的化合物。

南开大学、天津大学和大港油田联手攻关，成功地从苍蝇体内分离出抑制多种病源菌和病毒的抗菌肽。

目前多种抑菌实验已经完成，科研人员正在着手进一步纯化从苍蝇幼虫体内提取出的抗菌肽。

中国科学院上海生化与细胞所张永莲等人对名为Binlb的鼠源新基因的功能研究取得突破（批准号：

39893320）。

该基因只在附睾头部上皮细胞中特异表达具有抗菌功能的多肽，生育旺期表达最高。

这是目前第一个发现与附睾防御系统相关的天然抗菌肽，人体也类似，也是国际上发现的第一个与男性生殖系统炎症相关的功能基因，第一次证实附睾具有免疫系统。

其研究成果：

《大鼠生殖系统中的一个抗菌肽基因》，于2001年3月在《Science》上发表，是我国生命科学基础研究成果第一次在《Science》上刊载。

中国水稻所黄大年教授主持的蚕抗菌肽B基因转化水稻的研究，抗菌肽B基因转化植株表现出对白叶枯病合细条病的抗性有明显提高，为水稻白叶枯病的抗性育种提供了一条新的途径。

将该基因导入推广品种，可以获得农艺性状保持优良。

另外，转基因第二代植株仍然表现对白叶枯病合细条病的抗性。

中国农业科学院生物技术研究中心研究员贾士荣完成了抗菌肽CecropinB及ShivaA基因的合成，构建了表达载体，并将这些基因成功地导入我国七个马铃薯主栽品种（品系），获得1050个转基因株系，经多年多点抗病性鉴定，初步筛选出三个较起始品种抗病的株系。

黄亚东，郑青，王林川，廖富蘋，黄自然等采用病毒载体pAcGP67B，通过PCR点突变技术将柞蚕抗菌肽基因起始密码ATG删除以利于形成信号肽切除位点的编码序列。

gp67信号肽的插入能引导表达产物分泌到细胞外而便于表达产物的鉴定及其生物活性的测定，对柞蚕抗菌肽D基因重组杆状病毒表达载体的构建及其表达。

…此处省略,详情请见六鉴网（）《抗菌肽市场调研报告》

3.4抗菌肽生产受到的限制

目前已有很多阳离子抗菌肽实现工程表达，如magainins、杀菌肽（cecropin）、buforins及其模拟肽。

基因工程生产抗菌肽的表达系统有植物、昆虫、毕赤酵母、大肠杆菌，常选用表达宿主偏爱的密码子人工合成基因并进行克隆表达。

由于抗菌肽分子量小，容易被宿主细胞分解，且对宿主细胞有毒性，氨基酸组成不均衡，表达效率较低，常以融合蛋白的形式表达，也有多聚体串联表达的报道。

迄今为止，人们已经成功地构建了多种人工合成抗菌肽，根据国内外对抗菌肽表达的文献报道，从抗菌肽的类型、表达体系及表达产物的抗菌活性等方面进行总结（见表3.2）。

从表3.2可以看出，由于抗菌肽独特的N-端及C-端结构，经过基因工程融合表达后，很难保持完整的天然的空间构象。

即使该融合蛋白容易获得纯化，但抗菌肽的活性也受到较大的影响。

此外，在真核系统中非融合表达的抗菌肽，虽然保持了天然蛋白质的序列及空间构象，由于受到表达产量及纯化方法的限制，也很难获得纯化的高产量的抗菌肽，因而抗菌肽的大量生产仍然是一个难题。

抗菌肽要成为药物，目前还需要解决一些问题。

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3.5抗菌肽开发生产方向

尽管抗菌肽具有作为新一类药物的潜能，但是要将抗菌肽应用到临床治疗还有许多问题有待解决：

（1）抗菌肽分子小，易被蛋白酶降解，因此需用脂质包被或进行化学修饰进行保护；

（2）分离、纯化小分子物质比较困难；

（3）抗菌肽天然资源有限，化学合成和基因工程成为获得抗菌肽的主要手段，但成本较高，生产效率较低；

（4）目前有关抗菌肽药动学、药效学、毒力学方面研究较少，无法为临床应用提供依据，随着对分离纯化、抗菌特性、表达调控及毒力学性质等问题的进一步研究，抗菌肽定能对人类及动物的健康产生深远的影响。

内容摘自六鉴化工咨询网（）发布《抗菌肽市场调研报告》