示例省基金.docx
《示例省基金.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《示例省基金.docx（20页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
示例省基金
分子生物学省重点实验室
妇科学博士点
**省自然科学基金资助项目
申请书
项目名称
卵巢上皮性癌的间皮素（Mesothelin）表达及与CA125的功能关系
所属学科
生命
学科代码
C030304
申请人
***
申请单位
医科大学
通讯地址
邮政编码
归口单位
教育厅
合作单位
申请时间∶2005年06月10日
填写说明
一、填写前要认真查阅省自然科学基金管理的有关规定。
内容表达要明确、严谨，字迹要清晰，空格不够时可另加页。
使用外来语要同时用中文表达。
首次出现的外文缩写标明外文全称。
二、“学科”分7大类，即∶数理、化学、生命、地球、材料与工程、信息、管理。
填写时要按照主要研究内容确定所属学科，并填写学科代码。
如难以界定的可同时填写两个学科及代码，但仍以前一个为主，禁止同一研究内容同时多学科申报。
三、项目名称限制在30个汉字以内，关键词最多不超过30个汉字长度。
“预期水平”栏中选择国际领先、国际先进、国内领先、国内先进之一。
类别∶按申报项目性质在属纯基础和应用基础中选择。
四、申请者必须是所在单位实际主持本研究工作的首席研究人，只能一名，工作稳定，有研究、组织能力，时间上有保证。
参加人为实际从事本研究工作的人员，顾问等指导性工作人员不列入其中。
青年专项基金项目负责人，实足年龄在35岁及以下，项目组成员主要是年轻人。
五、项目申请人和项目组成员在研省基金项目已满两项的，不再受理其新申请项目。
六、项目经费限于本项目研究工作直接需要的开支，实事求是，勤俭节约。
应充分利用已有条件和可以利用的协作条件，多渠道积极争取经费。
七、使用基金会办公室提供的录入系统填写申请书，由申请者所在单位审查、筛选后统一报基金会办公室，一式六份，其中原件一份。
一、简表
项目名称
卵巢上皮性癌的间皮素（Mesothelin）表达及与CA125的功能关系
研究类别
应用基础
预期水平
国际先进
起至年月
2006年至2008年
研
究
内容
、
创新点和意义摘要
研究内容：
卵巢上皮性癌（卵巢癌）早期诊断困难，具长期在腹腔种植转移的生物学特征，是死亡率最高的妇癌。
我们用基因芯片分析了卵巢癌基因表达谱，发现间皮素（mesothelin,MSLN）是上调表达最为显著的可分泌分子。
最新研究提示CA125是鼠MSLN的受体。
因此，本课题拟用分子生物学和免疫组织学技术，分析MSLN在健康妇女血清和临床各期卵巢癌患者的血清、腹水、组织标本中的表达，探讨与CA125表达及定位的关系、与临床分期、荷瘤量和疾病进展的关系，总结MSLN是否可作为卵巢癌早期诊断、术前辅助诊断和病情监测标记物；MSLN是否可与CA125互补应用于卵巢癌的诊断和病情监测。
用体外细胞黏附实验和裸鼠卵巢癌腹腔转移瘤模型，探讨MSLN与CA125在细胞的生长增殖、黏附、腹腔种植和转移过程中的作用，揭示MSLN与CA125的功能关联性，为卵巢癌的腹腔生长转移行为提供理论依据，并为抗卵巢癌腹腔转移治疗打下基础。
2.创新点：
（1）本课题组首次发现和验证了MSLN在卵巢癌中极显著上调表达，并准备就其临床应用价值方面率先开始系统的研究。
截止本申请撰写时，国内外未见相关研究的报道。
（2）将MSLN的表达与CA125的表达相联系，试图发现其内在联系，如能达到预期的目的，不仅为临床实践提供价值很高的标志物，也将为研究MSLN和CA125的功能开辟新的途径。
（3）本课题组根据最新的研究结果进行合理的科学推测，设计进行MSLN和CA125对卵巢癌细胞生长和黏附的影响的实验研究，并结合卵巢癌的独特转移规律，研究MSLN和CA125对卵巢癌细胞和腹膜间皮细胞（表达MSLN）的黏附的影响，在此基础上拟建立动物模型观察MSLN和CA125在体内对卵巢癌腹腔转移的作用。
结果将对理解癌腹腔转移的分子机制和开发新的抗癌药提供理论依据，这一思路在国内外均未见报道，具明显的创新性。
关键词
卵巢上皮性癌；间皮素；CA125
项目组
总人数
高级
中级
其他
其
中
博士后
博士
博士生
硕士
硕士生
3
1
2
0
1
2
2
申请者及项目主要成员情况
姓名
性别
年龄
职称
学位
专业
单位
项目分工
年月
***
女
39
教授
博士
妇科
医科大学
项目设计
08
***
女
30
讲师
硕士
分子生物学
医科大学
动物实验
09
**
女
27
讲师
硕士
细胞生物学
医科大学
实验
09
二、经费收入、支出计划（金额单位∶万元）
金年
额度
来源
2006
2007
2008
合计
申请省基金
3
2
1
6
单位自筹
其他
渠道
拨款
1.省卫生厅
1
1
2.
合计
4
2
1
7
㈠省基金经费使用计划
预算支出科目
金额
计算依据
1.科研业务费（实验动植物购置和种植、养殖费，计算、测试分析费，国内调研和学术会议费，业务资料、报告、论文印刷费，临时用工劳务费、必需的国际合作研究费）
2.8
用于数据分析、统计、日常消耗、参加学术会议和论文版面费等
2.实验材料费（原材料、试剂、药品等消耗性物品的购置费，标本、样品采集加工费，运杂包装费）
2.2
购置细胞系、抗体、RNA干扰技术所用试剂、动物实验、分子生物学实验和细胞培养
3.仪器设备费（专用仪器设备的购置费，运杂包装费，自制专用仪器设备的材料、配件和外协加工费）
0.7
＊＊＊仪器
4.实验室改装费（根据研究工作需要所进行的实验室简单改装）
5.协作费（外单位协作者承担研究工作所需经费）
6.管理费（经费自立的单位项目管理费不超过资助金额的5%，最高不超过0.5万元）
0.3
管理费
㈡单位自筹及其他渠道拨款使用计划
省卫生厅经费主要用于实验材料的1万元
㈢需购买的主要仪器、设备
仪器、设备名称
规格型号
数量
产地
资金来源
＊＊＊
1－6
1
中国
省基金
三、立论依据（包括科学意义和应用前景，国内外研究概况，主要参考文献目录。
纯基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；应用基础研究着重结合学科前沿，围绕国民经济和社会发展中的科技问题，论述其研究特色及应用前景）
90%的卵巢恶性肿瘤是卵巢上皮性癌（以下简称卵巢癌），是妇科肿瘤领域内死亡率最高的疾病，5年生存率长期徘徊在30%左右[1。
随社会经济的发展和妇女生育率的降低，卵巢癌的发病率逐年上升，由于该病的治疗需要彻底的手术和后续长期的多个疗程的化疗和其它辅助治疗，给患者家庭和社会经济带来沉重的负担。
卵巢癌有两个显著特点：
一是早期诊断困难，75%的患者就诊时已到临床晚期，晚期患者的5年生存率仅20%，而早期则高达85%-90%；二是其具有独特的生长和转移规律，与其他实体瘤经由血液系统或淋巴系统转移至远处不同，卵巢癌长期在腹腔转移，癌细胞在腹膜间皮细胞黏附、种植并形成转移灶，最终由于腹腔广泛病灶累计网膜、胃肠道和肝脾等脏器而导致患者死亡。
卵巢癌的术前辅助诊断和病情监测的首选方法之一是血清CA125的测定。
CA125是由单克隆抗体OC125识别的一种高分子量的糖蛋白，是近20年妇科领域应用广泛的生物标记物。
85%的晚期卵巢癌血清CA125升高，并且与分期呈相关性。
CA125还与人体卵巢癌的荷瘤量成正比，当彻底手术切除癌灶后，CA125明显下降或转阴，化疗奏效时，也使CA125下降。
卵巢癌的治疗是长期的过程，术后应给予多个疗程的化学治疗（化疗），治疗过程中根据肿瘤对化疗的敏感度及时调整治疗方案也很重要；此外，卵巢癌的复发率很高，CA125的阳性预测率高达90%，因此CA125也被用于病情监测。
CA125是血清检测，故简便、经济、微创。
CA125的局限性也很多：
①诊断的特异性不高，在很多生理状态和良性疾病时也可升高。
晚期卵巢癌时，可结合临床表现易于鉴别，而早期时则难以区分。
②早期病例阳性率低。
临床实践中，由于卵巢位于盆腔深部，一般临床查体难于直接接触，早期发病无特异症状，患者通常是有明显的症状后方就诊，此时多已届临床晚期，所以寻找有价值的早期诊断方法是临床迫切需要的，而CA125难以满足这以要求。
例如，英国的IanJacobs博士，分析了22000位妇女的血清CA125，发现340例CA125升高，结合阴道超声，对41例超声异常的妇女实施了剖腹探查术，发现11例卵巢癌，但令人沮丧的是其中8例为临床晚期[2]。
早期卵巢癌CA125升高不到50%，这也是制约CA125做为早诊指标的因素。
由此可见卵巢癌早期诊断困难之一斑。
③15%的晚期卵巢癌CA125阴性。
④部分复发卵巢癌CA125不升高，CA125的阴性预测率仅45%-55%。
综上，临床仍迫切需要敏感、特异的诊断和监测卵巢癌病情的经济、简便的指标，毕竟卵巢癌是威胁妇女生命的第一杀手。
为这一目的，在2003年我们采用了高通量的DNA微阵列（基因芯片）技术，所用的cDNA微阵列含8000条人基因，分析了卵巢癌和正常卵巢的基因表达谱，结合生物信息学统计处理，进行了深入的数据分析和数据挖掘。
与正常卵巢相比，发现了56条上调和23条下调的基因，79条表达差异的基因中，间皮素（mesothelin,MSLN）的变化最为显著，在卵巢癌中显著上调表达[3]。
随后，我们用半定量RT-PCR和免疫组织化学对80例卵巢癌和11正常卵巢进行了MSLN的检测，初步验证符合芯片杂交的结果[4]。
MSLN是由单克隆抗体CAK1在间皮细胞、间皮瘤和卵巢癌中识别的抗原[5]。
MSLN的cDNA编码69kDa多肽，糖基化后被蛋白酶水解为40kDa和31kDa的片段，40kDa通过糖基磷酯酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol）与胞膜相连，31kDa脱落成可溶片段。
我们检索了所有与MSLN有关的文献（43篇），意外地发现，2004年3月最新的研究提示人CA125是鼠MSLN相应的受体，二者可能有某种功能关联。
[6]。
尽管CA125用于临床已有20余年了，但其结构和功能始终是个谜一般的问题，直到2001年CA125的结构才基本清楚[7]，全长的CA125是由11000个氨基酸构成蛋白质的核心结构，CA125蛋白质是由短的胞浆尾、跨膜功能区和巨大的细胞外糖基化的功能区构成。
N-末端的胞外功能区的有N-和O-糖基化部位，由60余个串联的重复的模基（motif）组成，模基含156个氨基酸，主要是富含丝氨酸和苏氨酸的序列，正是这个功能单位和MSLN、OC125抗体和M11（识别CA125的B单位）抗体结合[7]。
C-末端，有跨膜部分和短的胞浆尾。
CA125的释放是在胞浆尾的功能区经过丝氨酸/苏氨酸和/或酪氨酸依赖的磷酸化后，经由细胞内质网和高尔基器释放到细胞外。
在人体不同组织和体液有不同形式和大小的CA125[8]。
通常细胞发生恶性转化时出现了新的表型及与之相随的分子改变，这些变化不仅使恶性细胞获得了与正常细胞不同的生长特性，也为我们寻找新的肿瘤诊断标记物和新的药物作用靶提供了线索。
目前科学界公认卵巢癌（上皮癌）起源于卵巢表面上皮，而卵巢表面上皮就是分化修饰后的间皮细胞。
因此，间皮素--MSLN可能是我们理解卵巢癌生物学行为的“分子桥梁”。
我们推测，
（1）可分泌的蛋白质MSLN，可能作为新的血清学指标用于卵巢癌诊断，尤其辅助早期诊断，也可用于病情监测。
（2）MSLN和CA125的表达可能有关联，MSLN的过度表达可能影响CA125的释放而导致血清CA125水平的降低，二者可能有互补性应用的临床价值。
⑶MSLN可能影响卵巢癌细胞的生长和转移方式，与CA125有某种功能的关联，二者的相互作用可能与卵巢癌细胞的生长和增殖、脱落、与腹膜间皮细胞特异性黏附、种植有关，最终导致腹腔广泛转移。
而卵巢癌的独特的生长和转移规律就是瘤细胞长期在腹腔种植和转移。
我们做出以上推测受到以下启示：
⑴我们前期工作中应用高通量的基因芯片技术发现MSLN在卵巢癌细胞中极高表达，RT-PCR和免疫组化初步验证的结果也支持芯片杂交的结果[4]。
2003年下半年，美国学者用同样技术也有类似发现[9]。
⑵同CA125一样，MSLN是可分泌的蛋白，血清中可检测。
但MSLN的可溶片段是31kDa[5]，远远小于CA125的220kDa的片段，因此，MSLN释放后易于被血循环吸收，理论上敏感度要高于CA125。
⑶最新的研究MSLN血清检测的报告有令人震惊的发现[10]：
对暴露于石棉的41人分析血清MSLN，33例MSLN血清浓度正常的人，随访8年仍健康，但7例血清MSLN升高的人，3例3年后患间皮瘤，1例5年后患肺癌。
这一结果提示，血清MSLN有可能用于癌的早期诊断。
⑷Pastan等[5]发现转染MSLN的细胞较对照细胞有更强的黏附力，推测MSLN可能与细胞的黏附有关。
⑸Rump等[6]用生物化学的方法证实，转染了人CA125cDNA的COS7细胞（来源于猴肾）胞膜表达CA125蛋白质（尽管cDNA中不包括信号肽和跨膜部分的编码基因），转染后的COS7细胞可与培养基中的鼠MSLN蛋白质特异性结合。
研究还显示CA125通过含156个氨基酸的模基与MSLN结合在一起，而CA125分子含60余个串联的模基，这种结合可能是多价的方式。
上述结果提示人CA125可能是鼠MSLN的相应受体，但人体细胞系或人体组织细胞中CA125和MSLN是否存在这样的关系尚未得知。
⑹初步的研究提示MSLN的过度表达可能会阻止CA125从癌组织释放，因此，导致癌组织中CA125高表达的卵巢癌患者的血清中的CA125不高或正常[6]。
⑺MSLN与CA125的结合可调节细胞间的黏附[6]。
（8）2003年8月英国帝国理工学院的学者发现CA125通过免疫调节的机制与肿瘤的侵袭进展有关[11]。
我们课题组近年一直致力于卵巢癌的临床应用基础研究。
但此次选题与以往不同，我们是对研究的对象（卵巢癌）采用了高通量的基因芯片进行了侯选目标的筛查，在分析卵巢癌基因表达谱的基础上，复习文献，奠定了课题立项的客观性。
MSLN是新发现的肿瘤分化抗原，有关的研究还很少。
有关MSLN与人体肿瘤的研究仅33篇文献报道。
在卵巢癌方面，最早识别和克隆MSLN是在卵巢癌细胞系OVCAR-3细胞[4，12,13]，一些研究集中在发展抗MSLN的免疫治疗方面[14-17]。
有的学者进行有关血清检测MSLN的方法学研究[18]。
从2003年始，美国的一项研究报道用基因芯片发现卵巢癌MSLN表达上调[9]，另一项研究报告了他们正在进行MSLN用于卵巢癌筛查，但研究尚未完成[19]。
至于以人体组织或细胞系为对象研究MSLN和CA125相互关系以及二者共同作用对肿瘤细胞生长和转移的影响，在国内外均未见报道。
在国内，我们课题组首先开始MSLN的研究。
文献检索未见其国内他单位的报道，参见第五部分所附的省科技情报所查新报告。
综上所述，我们将在前期发现卵巢癌出现MSLN上调表达的基础上，深入研究MSLN作为诊断（早期诊断）、病情监测生物标记物的可能性；研究MSLN和CA125共表达的状况和消长关系，观察2个指标的互补应用的可能性。
同时，探讨MSLN和CA125在卵巢癌细胞生长增殖、黏附和腹腔转移过程的作用及功能关系，理解导致卵巢癌独特生长转移规律的机制，为抗卵巢癌腹腔转移的治疗提供新的思路和药物作用的靶。
参考文献
1.GerrnleRT,Hill-HarmonMB,MurrayT,etal.CancerStatistics.2001.CACancerJClin2001;51:
15-36
2.MenonU,JacobsIJ.Thecurrentstatusofscreeningforovariancancer.OvarianCancer.Thefirstediton,NewYork:
OxfordUniversityPress,2002,171-188
3.应用DNA微阵列分析卵巢浆液性乳头状囊腺癌的基因表达谱.中华妇产科杂志（待发）
4.ChangK,PastanI.Molecularcloningofmesothelin,adifferentiationantigenpresentonmesothelium,mesotheliomas,andovariancancers.Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996;93:
136-140
5.RumpA,MorikawaY,TanakaM,etal.BindingofovariancancerantigenCA125/MUC16tomesothelinmediatescelladhesion.JBiol.Chem.2003;Dec15
6.O'BrienTJ,BeardJB,UnderwoodLJ,etal.TheCA125gene:
anextracellularsuperstructuredominatedbyrepeatsequences.TumourBiol.2001;22:
348-66
7.NustadK,LebedinY,LloydKO,etal.EpitopesonCA125fromcervicalmucusandascitesfluidandcharacterizationofsixnewantibodies.ThirdreportfromtheISOBMTD-1workshop.TumourBiol.2002;23:
303-14
8.SchanerME,RossDT,CiaravinoG,etal.Geneexpressionpatternsinovariancarcinomas.Mol.Biol.Cell2003;14:
4376-86
9.RobinsonBWS,CreaneyJ,LakeR,etal.Mesothelin-familyproteinsanddiagnosisofmesotheliomas.TheLancet2003;362:
1612-17
10.KuiWongN,EastonRL,PanicoM,etal.CharacterizationoftheoligosaccharidesassociatedwiththehumanovariantumormarkerCA125.JBiolChem.2003;278:
28619-34.
11.ChangK,PastanI.MolecularcloningandexpressionofacDNAencodingaproteindetectedbytheK1antibodyfromanovariancarcinoma（OVCAR-3）cellline.IntJCancer.1994;57:
90-7.
12.BrinkmannU,WebberK,DiCarloA,etal.CloningandexpressionoftherecombinantFAbfragmentofmonoclonalantibodyK1thatreactswithmesothelinpresentonmesotheliomasandovariancancers.IntJCancer.1997;71:
638-44
13.FanD,YanoS,ShinoharaH,etal.Targetedtherapyagainsthumanlungcancerinnudemicebyhigh-affinityrecombinantantimesothelinsingle-chainFvimmunotoxin.
MolCancerTher.2002;1:
595-600.
14.BeraTK,Williams-GouldJ,BeersR,etal.Bivalentdisulfide-stabilizedfragmentvariableimmunotoxindirectedagainstmesotheliomasandovariancancer.MolCancerTher.2001;1:
79-84.
15.HassanR,LernerMR,BenfrookD,etal.AntitumoractivityofSS（dsFv）PE38andSS1（dsFv）PE38,recombinantantimesothelinimmunotoxinsagainsthumangynecologiccancersgrowninorganotypiccultureinvitro.ClinCancerRes.2002;8:
3520-6.
16.HassanR,VinerJL,WangQC,etal.Anti-tumoractivityofK1-LysPE38QQR,animmunotoxintargetingmesothelin,acell-surfaceantigenoverexpressedinovariancancerandmalignantmesothelioma.JImmunother.2000;23:
473-9.
17.SchollerN,FuN,YangY,etal.Solublemember（s）ofthemesothelin/megakaryocytepotentiatingfactorfamilyaredetectableinserafrompatientswithovariancarcinoma.
ProcNatlAcadSciUSA.1999;96:
11531-6.
18.UrbanN,MicIntoshMW,AndersenM,etal.Ovariancancerscreening.Hematl.Oncol.Clin.NorthAm.2003,17:
989-1005
四、研究内容和预期成果（说明项目的具体研究内容和重点解决的关键问题，预期成果和提供的形式。
理论成果，应写明在理论上解决哪些科学问题及其科学价值；应用性成果
升级会员 